梁氏異蝎毒素促進(jìn)KYSE-510細(xì)胞凋亡的作用機制研究

王娟， 李秦晉， 符文卉， 魏寶陽， 王智*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128； 2. 湖南體育職業(yè)學(xué)院，長沙410019)

梁氏異蝎毒素促進(jìn)KYSE-510細(xì)胞凋亡的作用機制研究

王娟1#， 李秦晉1， 2#， 符文卉1， 魏寶陽1， 王智1*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128； 2. 湖南體育職業(yè)學(xué)院，長沙410019)

為了研究蝎毒抑制腫瘤細(xì)胞生長的機理，提取梁氏異蝎Heterometrusliangi蝎毒干預(yù)人食管癌細(xì)胞(KYSE-510細(xì)胞)，運用流式細(xì)胞術(shù)、電鏡技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄PCR和Western blot方法分別檢測蝎毒對KYSE-510細(xì)胞凋亡的影響以及對caspase-3基因表達(dá)。結(jié)果表明：經(jīng)蝎毒處理的實驗組KYSE-510活細(xì)胞數(shù)量顯著減少，其原因是蝎毒引起細(xì)胞大量凋亡和壞死。經(jīng)不同濃度(50 μg·mL-1，100 μg·mL-1，200 μg·mL-1)蝎毒處理的KYSE-510細(xì)胞與對照組的caspase-3基因在mRNA水平表達(dá)相近，而在蛋白表達(dá)水平上，實驗組細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比，蝎毒促進(jìn)了caspase-3的剪切活化，且以200 μg·mL-1蝎毒處理的KYSE-510細(xì)胞caspase-3的剪切活化最強，由此證明蝎毒導(dǎo)致KYSE-510細(xì)胞凋亡的機理之一可能是其促進(jìn)了caspase-3的剪切活化。

梁氏異蝎毒素；KYSE-510細(xì)胞；caspase-3；基因表達(dá)

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用(Krajewskaetal.,1997，Stefanakietal.,1998；許世偉等，2014)，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮作用。作為細(xì)胞凋亡的調(diào)控因子，caspase-3可能在癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用(Liuetal.,1996；Qietal.,2002)。蝎毒作為一種動物毒素，對腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用，能有效導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡(賈莉等，2001)，對肝癌、肺癌等有確切的療效(孫立東等，1996；楊春旭等，2002，2005；王兆朋等，2006a)，對一些移植性動物腫瘤也有顯著的抑制和預(yù)防作用(李桂生等，2004)。不同的學(xué)者應(yīng)用不同的方法證明了蝎毒廣泛的抗腫瘤活性(董偉華等，1999；孔天翰等，2004；付士波，2005；楊春旭等，2005；王兆朋等，2006b；朱靈等，2008)，并且其在抗腫瘤的同時具有明顯的增強機體免疫力的作用(張維東等，2007)，與放療藥和化療合用可降低放療和化療的毒副作用，具有成為新型抗癌藥的良好前景(Krajewskaetal.,1997；楊志華等，2000；王兆朋等，2006a，2006b；許世偉等，2014)。

已有統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，食道癌的發(fā)生率占所有惡性腫瘤的2%(Parkinetal.,1999；Enzinger & Mayer，2003)。全世界每年約有22萬人死于食道癌，我國是食道癌高發(fā)區(qū)，因食道癌死亡者僅次于胃癌，居第二位。因此，本實驗以人食管癌KYSE-510細(xì)胞為代表，以梁氏異蝎Heterometrusliangi為材料提取蝎毒，運用電鏡以及流式細(xì)胞儀檢測，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和Western blot方法分別檢測蝎毒對KYSE-510細(xì)胞caspase-3基因的mRNA和蛋白表達(dá)，分別在mRNA和蛋白水平上研究了蝎毒對KYSE-510細(xì)胞中caspase-3基因表達(dá)的影響，以揭示蝎毒抗腫瘤的分子機理。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

KYSE-510細(xì)胞株由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院遺傳學(xué)國家重點實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基

RPMI1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司。

1.3 蝎毒制備

蝎毒(提取自梁氏異蝎)：用電激法取毒液，溶于磷酸鹽緩沖液中，離心去不溶物質(zhì)，然后在RPMI1640培養(yǎng)基中溶解，分別配制成50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要試劑

新生牛血清、牛血清蛋白、Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、RT-PCR通用試劑盒(美國PROMEGA公司)、TRIZOL Reagent(美國GIBCO公司)、DEPC(德國GREINER公司)、PVDF膜(美國MILLIPORE公司)，羊抗小鼠抗體 #05-665(美國MERK MILLIPORE公司)，PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.5 實驗方法

1.5.1 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡——Annexin V/PI雙染色法 懸浮細(xì)胞直接收集到10 mL的離心管中，用孵育緩沖液洗滌1次，500～1 000 r·min-1離心5 min。用100 μL的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15 min，500～1 000 r·min-1離心5 min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次，加入熒光(SA-FLOUS)溶液，4 ℃下孵育20 min，避光并不時振動，用流式細(xì)胞儀分析，然后判斷結(jié)果：凋亡細(xì)胞對所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。

1.5.2 電鏡標(biāo)本的制備 掃描電鏡以及透射電鏡實驗標(biāo)本均分為對照組和實驗組。實驗組加含最終濃度為100 μg·mL-1的蝎毒處理，不加毒素的為對照組，培養(yǎng)24 h后常規(guī)掃描電鏡和透射電鏡制樣。

1.5.3 RT-PCR方法檢測caspase-3基因的mRNA表達(dá)水平 引物設(shè)計：內(nèi)參GAPDH擴增的片段長度為443 bp，引物序列為：

Upper Primer1： 5’-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3’， Lower Primer2： 5’-AGATCCACAACGGATACATT-3’。

根據(jù)GenBank提供的序列，設(shè)計用于擴增caspase-3基因引物，擴增的片段長度為250 bp，引物序列為：

Upper Primer1： 5’-CTCTCAACGACAGCAGCCCG-3’， Lower Primer2： 5’-AGGTGATCCAGACTCTGACC-3’。

凝膠圖像分析：用電泳圖像分析儀的分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行瓊脂糖凝膠的掃描和擴增條帶光密度分析。

1.5.4 Western blot方法檢測caspase-3基因的蛋白表達(dá) 用10%分離膠，4%的濃縮膠灌膠，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min，然后用水沖洗掉多余染液并將膜晾干準(zhǔn)備免疫反應(yīng)，通過顯影和定影完成凝膠圖像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

Annexin V/PI雙染色法后，用50 μg·mL-1和100 μg·mL-1蝎毒處理KYSE-510細(xì)胞，48 h內(nèi)觀察到細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。從圖1可知，活細(xì)胞的減少與蝎毒濃度是密切相關(guān)的，隨著蝎毒濃度的增加，活細(xì)胞的數(shù)量顯著減少：從98.68%減少到42.58%再到38.28%。細(xì)胞凋亡數(shù)(包括損傷和凋亡)從0.93%增加到47.97%再到49.49%，細(xì)胞壞死率從0.40%到9.46%再到12.22%。結(jié)果表明，該蝎毒能有效促進(jìn)KYSE-510細(xì)胞的凋亡和壞死。

2.2 電鏡檢測結(jié)果

對照組的細(xì)胞(圖2：A，B)在掃描電鏡下生長活躍，細(xì)胞之間緊密相連。正常的KYSE-510細(xì)胞是一個中間有突起的不規(guī)則多邊形，它的游動靠其表面延伸到周圍環(huán)境的微絨毛。經(jīng)蝎毒處理24 h，實驗組(圖2：C，D)的KYSE-510細(xì)胞在掃描電鏡下的形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)：細(xì)胞表面粗糙，細(xì)胞膜出現(xiàn)皺縮甚至部分出現(xiàn)穿孔。

圖1 50 μg·mL-1以及100 μg·mL-1蝎毒處理(48 h)KYSE-510細(xì)胞密度坐標(biāo)(百分含量)

Fig. 1 Density plots showing the percentage distribution of KYSE-510 control and 50 μg·mL-1and 100 μg·mL-1scorpion venom treated cells

A. 對照組, B. 50 μg·mL-1蝎毒處理組, C. 100 μg·mL-1蝎毒處理組; 左上方: 損傷細(xì)胞, 右上方: 晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞, 左下方: 活細(xì)胞, 右下方: 早期凋亡細(xì)胞。A. Control group, B. Scorpion venom-treated group (50 μg·mL-1), C. Scorpion venom-treated group (100 μg·mL-1); upper left: injured cell, upper right: non-viable apoptotic cell or non-viable non-apoptotic cell, bottom left: living cell, bottom right: viable apoptotic cell.

圖2 掃描電鏡下的形態(tài)學(xué)觀察Fig. 2 Morphological observations using scanning electron microscopy

A. 對照組細(xì)胞 (×2 000), B. 100 μg·mL-1蝎毒處理細(xì)胞 (24 h, ×2 000), C. 對照組細(xì)胞(×5 000), D. 100 μg·mL-1蝎毒處理細(xì)胞 (24 h, ×5 000)。

A. Control group cell (×2 000), B. Scorpion venom-treated cell (100 μg·mL-1, 24 h, ×2 000), C. Control group cell (×5 000), D. Scorpion venom-treated cell (100 μg·mL-1, 24 h, ×5 000).

圖3 透射電鏡下的超微結(jié)構(gòu)觀察

Fig. 3 Morphological observations using transmission electron microscopy

E. 對照組細(xì)胞 (×10 000), F. 100 μg·mL-1蝎毒處理細(xì)胞 (24 h, ×10 000), G. 對照組細(xì)胞 (×15 000), H. 100 μg·mL-1蝎毒處理細(xì)胞 (24 h, ×15 000)。 E. Control group cell (×10 000), F. Scorpion venom-treated cell (100 μg·mL-1, 24 h, ×10 000), G. Control group cell (×15 000), H. Scorpion venom-treated cell (100 μg·mL-1, 24 h, ×15 000).

用透射電鏡進(jìn)一步觀察它的超微結(jié)構(gòu)，可以看出對照組的細(xì)胞(圖3：E，G)擁有完整的細(xì)胞膜及細(xì)胞器，沒有出現(xiàn)核物質(zhì)的聚集。而實驗組的組織水腫，細(xì)胞內(nèi)空泡數(shù)量增多；細(xì)胞核內(nèi)常染色體減少，程序性死亡的細(xì)胞增多(圖3：F，H)。

2.3 RT-PCR方法檢測caspase-3基因mRNA表達(dá)水平結(jié)果分析

caspase-3基因RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像，結(jié)果顯示(圖4)，3組不同濃度(50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1)蝎毒處理的KYSE-510細(xì)胞與對照組相比，caspase-3基因的mRNA表達(dá)量相近，證明蝎毒對caspase-3基因在mRNA水平表達(dá)上無明顯影響。

圖4 不同濃度蝎毒處理的KYSE-510細(xì)胞 caspase-3基因mRNA表達(dá)水平Fig.4 Expression of caspase-3 gene in KYSE-510 cells that treated with different concentrations of scorpion venom as determined by RT-PCR

2.4 Western blot方法檢測caspase-3基因蛋白表達(dá)水平結(jié)果分析

用Western blot方法檢測了不同濃度(50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1)蝎毒處理的KYSE-510細(xì)胞與對照組的caspase-3基因在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)，結(jié)果顯示(圖5)，經(jīng)蝎毒處理的KYSE-510細(xì)胞caspase-3基因的蛋白表達(dá)明顯強于對照組，并且經(jīng)200 μg·mL-1蝎毒處理的KYSE-510細(xì)胞caspase-3基因的蛋白表達(dá)增強最為明顯，箭頭所指的部位是亞基(17 kDa)，細(xì)胞開始早期凋亡，證明蝎毒可以明顯促進(jìn)KYSE-510細(xì)胞caspase-3蛋白的剪切活化，并在濃度為200 μg·mL-1時最為有效。

圖5 不同濃度蝎毒處理的KYSE-510細(xì)胞 caspase-3基因蛋白表達(dá)水平Fig. 5 Expression of caspase-3 gene in KYSE-510 cells that treated with different concentrations of scorpion venom as determined by Western blot

3 討論

許多研究表明，caspase-3與腫瘤的分化、增生、轉(zhuǎn)移有關(guān)，caspase-3在正常情況下充當(dāng)腫瘤抑制基因，在腫瘤組織中高表達(dá)則是機體對腫瘤的一種抵抗措施(EI-Deiryetal.,1993；Leppleetal.,1996；Ikeguchietal.,1998)。本實驗以KYSE-510細(xì)胞為代表，以梁氏異蝎為材料提取蝎毒，在掃描電鏡與透射電鏡下對比觀察實驗組(經(jīng)蝎毒處理24 h)與對照組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變與超微結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)對照組的細(xì)胞正常而實驗組的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的程度，隨著毒素濃度的增大，正?；罴?xì)胞的數(shù)量顯著減少或百分比顯著降低，凋亡壞死的細(xì)胞明顯增加，表明蝎毒影響KYSR-510細(xì)胞的生長與死亡，抑制細(xì)胞的生長增殖而促進(jìn)其凋亡和壞死，這也是蝎毒的抗腫瘤機制。

實驗中蝎毒在mRNA水平上對caspase-3基因表達(dá)無明顯影響，而在蛋白水平上則大大增強了caspase-3蛋白的剪切活化，并以經(jīng)200 μg·mL-1蝎毒處理的KYSE-510細(xì)胞caspase-3蛋白的剪切活化最強，由此說明了蝎毒抑制癌細(xì)胞增殖的其中一種機制是通過增強癌細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白的剪切活化來阻止細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期。另外，蝎毒是否還有其他機制可以促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，還有待進(jìn)一步研究。

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Mechanism of the Enhancement of Scorpion Venom fromHeterometrusliangion Apoptosis and Necrosis of KYSE-510 Cell

WANG Juan1#， LI Qinjin1， 2#， FU Wenhui1， WEI Baoyang1， WANG Zhi1*

(1. College of Bioscience & Biotechnology， Hunan Agriculture University， Changsha 410128， China;2. Hunan Sports Vocational College， Changsha 410019， China)

Scorpion venom was extracted fromHeterometrusliangito study the mechanism of inhibition of venom on tumor grow. The effect of scorpion venom on apoptosis and necrosis of KYSE-510 cell and expression levels of caspase-3 were investigated by electron microscopy， Annexin V-FITC， and propidiumiodide double staining analysis by flowcytometry as well as reverse transcription PCR and Western blot. The results indicated that the mRNA expression levels of caspase-3 in KYSE-510 cells that treated with different concentrations of scorpion venom (50 μg·mL-1， 100 μg·mL-1， 200 μg·mL-1) were similar to these of control. However， the expressions of caspase-3 in KYSE-510 cells were obviously up-regulated by scorpion venom as determined by Western blot， especially when the cells were treated with 200 μg·mL-1scorpion venom. These results suggested that the possible mechanism of the scorpion venom was accelerated protein splicing activity of caspase-3.

venom ofHeterometrusliangi; KYSE-510 cells; caspase-3; gene expression

2016-06-03 接受日期：2016-08-17

湖南省科技廳重點項目(2014FJ2003)

王娟(1990—)， 女， 碩士研究生， 研究方向為發(fā)育生態(tài)學(xué)， E-mail：240647109@qq.com; 李秦晉(1975—)， 男， 博士研究生， 講師， 主要從事農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)研究， E-mail：18157099@qq.com#同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者Corresponding author， 博士， 教授， 博士研究生導(dǎo)師， 主要從事生態(tài)學(xué)和害蟲生態(tài)調(diào)控研究， E-mail：wangzspider@sina.com.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20160152

Q78

A

1000-7083(2016)05-0660-06