集成化熒光激活液滴分選系統(tǒng)研究

盛廣濟(jì) 朱 君 樊瑜波 李 昂

(北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191)

集成化熒光激活液滴分選系統(tǒng)研究

盛廣濟(jì) 朱 君 樊瑜波#李 昂*

(北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191)

高通量的熒光激活液滴分選技術(shù)在大規(guī)模生化試驗(yàn)中能夠顯著降低實(shí)驗(yàn)成本，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，因此在微生物菌株篩選、新藥研發(fā)、高通量單細(xì)胞研究等眾多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。然而，目前使用的熒光激活液滴分選系統(tǒng)大多基于光學(xué)試驗(yàn)器件搭建，系統(tǒng)的靈活性、穩(wěn)定性相對(duì)較差，搭建的技術(shù)門檻較高，限制了該技術(shù)在生命科學(xué)研究等領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。設(shè)計(jì)一種集成化的熒光激活液滴分選系統(tǒng)，通過(guò)特定光路設(shè)計(jì)，系統(tǒng)所需的熒光激發(fā)和探測(cè)光路實(shí)現(xiàn)集成化、模塊化封裝，熒光激發(fā)和探測(cè)功能模塊縮小到160 mm×143 mm×54 mm，大幅縮減系統(tǒng)體積?？梢酝ㄟ^(guò)給普通顯微鏡增加功能模塊的方式，快速實(shí)現(xiàn)分選系統(tǒng)的搭建，從而提高熒光激活液滴分選技術(shù)的易用性。相比現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的熒光激活液滴分選系統(tǒng)，成本下降到1/5，體積減小為1/40，有利于該技術(shù)的工業(yè)化推廣。

熒光激活；液滴分選；集成化

fluorescence activated; droplet sorting; system integration

引言

微流控技術(shù)能夠在很小的尺度上精細(xì)地操作流體的運(yùn)動(dòng)，配合特殊設(shè)計(jì)的芯片，能夠在片上實(shí)現(xiàn)從樣品的制備、孵育到反應(yīng)產(chǎn)物的純化、分析等一系列操作[1-2]，因而催生了片上實(shí)驗(yàn)室的概念。該技術(shù)能夠大大簡(jiǎn)化傳統(tǒng)生化試驗(yàn)流程，降低實(shí)驗(yàn)試劑的消耗，提高試驗(yàn)的自動(dòng)化程度，近年來(lái)得到了廣泛關(guān)注。在微流控技術(shù)中，依據(jù)反應(yīng)體系的存在形式，可以分為連續(xù)流體體系和微液滴體系。其中，微液滴反應(yīng)體系是在特殊設(shè)計(jì)的微流控芯片中，利用水在油相中的乳化效應(yīng)，將反應(yīng)體系分割成為相互隔離的微小液滴。液滴在油相中懸浮，在表面活性劑的作用下能夠穩(wěn)定存在。目前，微液滴的生成、融合和液滴可控注入等操作都相對(duì)成熟，操作的通量高達(dá)每秒鐘103個(gè)液滴[3]，因此能夠滿足高通量實(shí)驗(yàn)的需求。

微液滴實(shí)驗(yàn)技術(shù)具有的高通量、超小反應(yīng)體系等突出特點(diǎn)，使得該技術(shù)在菌株篩選、藥物研發(fā)、高通量單細(xì)胞研究、微量樣品富集等眾多領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注[4-6]。尤其是近年來(lái)，以伯樂(lè)(Biorad)為代表的微液滴數(shù)字PCR技術(shù)能夠?qū)鹘y(tǒng)PCR技術(shù)的探測(cè)靈敏度大大提高，在癌癥的早期診斷、測(cè)序文庫(kù)制備等領(lǐng)域都具有極高的應(yīng)用價(jià)值[7]。

但是，目前微液滴技術(shù)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的操作平臺(tái)。其中，液滴的生成、融合、再注入等操作相對(duì)簡(jiǎn)單，研究人員配合特定的微流控芯片能夠較簡(jiǎn)單地完成，但對(duì)于液滴的分析以及特定目標(biāo)的高通量篩選操作非常復(fù)雜。試驗(yàn)系統(tǒng)包括復(fù)雜的熒光激發(fā)、探測(cè)以及高壓介電篩選等組成部分，雖然已有文獻(xiàn)對(duì)熒光激活液滴分選系統(tǒng)(fluorescence activated droplet sorting system, FADS)搭建方法進(jìn)行了報(bào)道[8]，但自行搭建系統(tǒng)對(duì)研究人員的技術(shù)要求極高，現(xiàn)有的系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)方案復(fù)雜，集成化難度大，維護(hù)成本高，目前市場(chǎng)上還沒(méi)有相應(yīng)的產(chǎn)品出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的缺失，很大程度地限制了FADS的發(fā)展[9-10]。

本研究基于熒光激活液滴分選技術(shù)，提出了集成化FADS解決方案。該方案將熒光激發(fā)、多通道熒光探測(cè)光路巧妙地與成像光路相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了FADS的集成化、模塊化。實(shí)驗(yàn)人員搭建FADS只需為顯微鏡安裝相應(yīng)的功能模塊，無(wú)需復(fù)雜的光路調(diào)整和優(yōu)化。同目前見(jiàn)諸文獻(xiàn)報(bào)道的系統(tǒng)相比，該方案具有體積小、成本低、熒光探測(cè)靈敏度高、使用方便等顯著特點(diǎn)，對(duì)熒光激活液滴分選技術(shù)的推廣具有一定的推動(dòng)作用。

1 系統(tǒng)原理與設(shè)計(jì)

1.1 FAD原理

熒光激活液滴分選技術(shù)首先將樣品分成相互隔絕、大小均一的微液滴，每一微液滴構(gòu)成了一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)器(單分散性)。如圖1所示，生成的液滴通過(guò)孵育培養(yǎng)后，包含目標(biāo)產(chǎn)物的陽(yáng)性液滴和液滴中包裹的標(biāo)記物反應(yīng)，從而產(chǎn)生特定的熒光信號(hào)。當(dāng)該陽(yáng)性液滴混雜在大量陰性液滴中依次高速通過(guò)FADS的熒光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，熒光信號(hào)超過(guò)設(shè)定分選閾值，觸發(fā)分選高壓，從而在高壓介電電泳力的作用下被篩選到特定的流體通道，實(shí)現(xiàn)陽(yáng)性液滴的富集[1-3]。

圖1 FADS工作原理Fig.1 Fluorescence activated droplet sorting system

1.2 FADS組成

FADS包括液滴熒光激發(fā)模塊、熒光探測(cè)模塊和高壓分選模塊。其中，熒光激發(fā)模塊和熒光探測(cè)模塊涉及光路的搭建，光路的設(shè)計(jì)也決定FADS系統(tǒng)的使用靈活性、可維護(hù)性以及信號(hào)探測(cè)質(zhì)量的好壞。

目前，研究人員多基于熒光顯微鏡搭建光路系統(tǒng)[11]。激光光路和熒光探測(cè)光路在顯微鏡內(nèi)由二向色片合束，通過(guò)顯微物鏡聚焦于微流控芯片的熒光探測(cè)位置(見(jiàn)圖2)。

圖2 基于熒光顯微鏡光路搭建的FADSFig.2 Configuration of FADS based on fluorescence microscope

通常，為了減小探測(cè)熒光的背景噪聲，需要在光電倍增管(photomultiplier tube, PMT)前安裝小孔，防止微流控芯片中熒光探測(cè)位置以外的干擾信號(hào)進(jìn)入PMT。光路要求小孔的位置與激光激發(fā)位置在顯微鏡像平面的像重合，大小和激光光斑的像大小相等。小孔大小通常在10～100 μm，因此對(duì)小孔的位置和大小調(diào)整要求極其精確[8]。又因?yàn)樾】孜挥跓晒夤饴分校ǔ晒庑盘?hào)很弱，肉眼不可見(jiàn)，因此調(diào)整難度很高。

另外，由于激光光路和熒光探測(cè)光路是分離的，如果激發(fā)光光束位置稍有變化，會(huì)造成熒光探測(cè)位置在顯微鏡像平面的像與小孔位置偏離，從而造成熒光探測(cè)效率降低，因此這種設(shè)計(jì)往往需要經(jīng)常校準(zhǔn)小孔的位置來(lái)保證系統(tǒng)熒光探測(cè)效率，系統(tǒng)維護(hù)復(fù)雜。

為了解決該問(wèn)題，配合顯微成像系統(tǒng)光路，設(shè)計(jì)FADS的熒光激發(fā)和探測(cè)模塊(見(jiàn)圖3)。顯微鏡光路能夠?qū)悠吠队暗较衿矫妫纬汕逦南?，如果在該像平面處安裝小孔，就會(huì)形成一個(gè)激光激發(fā)和熒光探測(cè)的共用窗口。激光聚焦于小孔位置形成光斑，在顯微鏡光路作用下，投影到微流控芯片熒光探測(cè)位置，該位置激發(fā)出的熒光在小孔所在位置成像，最終被PMT接收。

圖3 集成化FADS功能模塊與顯微鏡配合Fig.3 Configuration of FADS based on integration FADS functional module

這種設(shè)計(jì)能夠保證小孔處透過(guò)激光激發(fā)的熒光必然返回小孔處以形成熒光信號(hào)，而小孔位置以外的背景雜光則能夠被完全阻擋。這種光路設(shè)計(jì)能夠保證激光激發(fā)和熒光探測(cè)達(dá)到最高效率，相當(dāng)于能夠自動(dòng)保證常規(guī)光路設(shè)計(jì)條件下小孔位置始終處于理論最優(yōu)位置，熒光信號(hào)的信噪比始終保持在最高水平。當(dāng)激光光腰直徑略大于小孔孔徑時(shí)，即使小孔的位置稍有偏移，對(duì)熒光激發(fā)和探測(cè)不會(huì)造成影響，從而大大降低了系統(tǒng)的維護(hù)難度。另外，由于激光模塊和熒光探測(cè)模塊在光路中處在同一位置，因此能夠方便地將該部分進(jìn)行封裝，從而形成完整的FADS功能模塊，稱之為FADS功能模塊。該模塊內(nèi)光路一旦調(diào)整完成，就無(wú)需在后續(xù)的使用中調(diào)整。模塊可以配合任意成像設(shè)備，如正置顯微鏡、倒置顯微鏡、體式顯微鏡，甚至微距鏡頭組成FADS?？蒲腥藛T能夠靈活地將熒光激活液滴分選技術(shù)集成到現(xiàn)有試驗(yàn)系統(tǒng)中(如雙光子顯微鏡、拉曼顯微鏡等)，組成復(fù)雜的微流控分析分選平臺(tái)。

1.3 模塊集成化

圍繞成像系統(tǒng)像平面設(shè)計(jì)小孔位置，激光和熒光經(jīng)過(guò)同一小孔位置進(jìn)入成像系統(tǒng)，這種設(shè)計(jì)能夠方便地將熒光探測(cè)光路和激光光路進(jìn)行緊湊的整合，從而實(shí)現(xiàn)FADS的集成化、模塊化設(shè)計(jì)。圖4展示了FADS集成化設(shè)計(jì)之后的功能擴(kuò)展模塊，其中包含激光器、三通道熒光探測(cè)PMT、PMT高壓電源、24位精密模數(shù)轉(zhuǎn)換電路，以及分選高壓觸發(fā)輸出控制單元。模塊尺寸為160 mm×143 mm×54 mm，相對(duì)在光學(xué)平臺(tái)上搭建的FADS體積明顯縮小。另外，模塊全密封設(shè)計(jì)，使得系統(tǒng)的抗干擾能力增強(qiáng)，熒光信號(hào)探測(cè)質(zhì)量得到很大提高。

圖4 FADS功能模塊內(nèi)部組成Fig.4 Component in FADS functional module

2 系統(tǒng)測(cè)試

將集成化FADS功能模塊安裝到倒置熒光顯微鏡拍照接口上，能夠快速搭建FADS(見(jiàn)圖5)。本研究設(shè)計(jì)了系統(tǒng)測(cè)試芯片，測(cè)試FADS的熒光探測(cè)靈敏度、信噪比、分選通量，以及分選正確率。

圖5 采用集成化設(shè)計(jì)方案搭建的FADS(A為FADS功能模塊，實(shí)現(xiàn)熒光的激發(fā)和探測(cè)；B為超高速相機(jī)，實(shí)現(xiàn)對(duì)液滴生成及分選過(guò)程的觀察；C為FADS電源模塊，負(fù)責(zé)系統(tǒng)的供電；D為FADS高壓分選模塊，負(fù)責(zé)產(chǎn)生液滴分選所需的千伏高頻電壓)Fig.5 FADS build with integrated functional modules (A: FADS functional module, used for fluorescence activation and detection; B: Ultra-high speed camera, used for droplet generation and sorting real-time observation; C: FADS system power module, used for power up the system. D: FADS system high voltage generation module, used for generating high frequency high voltage AC signal to sorting positive droplet)

芯片設(shè)計(jì)如圖6所示，片上實(shí)現(xiàn)兩路液滴生成，一路生成包含轉(zhuǎn)染了GFP大腸桿菌的液滴作為陽(yáng)性液滴，另一路生成空液滴作為陰性對(duì)照，液滴體積約50 pL。生成的液滴匯流到一個(gè)通道中，陽(yáng)性液滴與陰性液滴依次間隔排列。最后，液滴依次通過(guò)熒光檢測(cè)通道，通過(guò)FADS功能模塊讀取液滴的熒光強(qiáng)度信號(hào)，當(dāng)強(qiáng)度超過(guò)設(shè)定的分選閾值后，給出分選觸發(fā)信號(hào)，觸發(fā)高壓分選，從而將陽(yáng)性液滴分選到上方通道，完成陽(yáng)性液滴的富集。

圖6 用于驗(yàn)證FADS的微流控芯片(A,B為液滴生成;C為液滴匯流；D為液滴加速，擴(kuò)大液滴間距離；E為熒光探測(cè)，液滴分選)Fig.6 Microfluidic chips used for FADS testing (A, B: generate droplet; C: positive and negative droplet converge; D: speed up droplet; E: fluorescence detection and droplet sorting)

3 結(jié)果

微流控芯片中液滴生成通量在每通道100～200個(gè)/s時(shí)，液滴的生成、匯流排列、液滴加速分離、熒光激活分選都能夠?qū)崿F(xiàn)(見(jiàn)圖7)。陽(yáng)性液滴的熒光信號(hào)能夠很好地和陰性液滴區(qū)分開(kāi)，并成功地實(shí)施分選，液滴的分選正確率為100%(通過(guò)超高速相機(jī)檢測(cè)了20 000個(gè)液滴的分選過(guò)程)。當(dāng)液滴生成通量進(jìn)一步提高時(shí)，設(shè)計(jì)的微流控芯片陰性陽(yáng)性液滴匯流處無(wú)法保證陽(yáng)性液滴陰性液滴依次排列，因此無(wú)法校驗(yàn)后端FADS分選結(jié)果的正確性。

圖7 FADS功能測(cè)試試驗(yàn)。(a)液滴生成；(b)陽(yáng)性液滴陰性液滴匯流依次排列;(c)加速液滴;(d)液滴分選Fig.7 Experiment for testing FADS. (a)Generating droplet; (b) Positive and negative droplet converge;(c)Speed up droplet;(d)fluorescence detection and droplet sorting

將熒光信號(hào)導(dǎo)出陽(yáng)性液滴的信號(hào)強(qiáng)度AD轉(zhuǎn)換結(jié)果為2 829 260，背景噪聲RMS=751.455，對(duì)應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度Vs=971.38 mV，背景噪聲強(qiáng)度Vn=258 μV，探測(cè)系統(tǒng)的信噪比SNR=79.7 dB。PMT的探測(cè)靈敏度約為750 V/nW，可得系統(tǒng)的熒光探測(cè)下限為3.5 fW。取熒光信號(hào)波長(zhǎng)λ=532 nm，系統(tǒng)能夠探測(cè)到的熒光強(qiáng)度下限約為104光子/s，系統(tǒng)的AD采樣速率為10 kHz，則在一次采樣周期內(nèi)(100 μs)，液滴熒光信號(hào)只要有不小于2個(gè)光子進(jìn)入到系統(tǒng)中就能夠被探測(cè)到，熒光探測(cè)靈敏度接近單光子探測(cè)水平(見(jiàn)圖8)。

圖8 FADS熒光信號(hào)探測(cè)性能。(a)FADS導(dǎo)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度(b)FADS的噪聲水平Fig.8 FADS fluorescence detection performance. (a) Fluorescence signal output by FADS (b) Noise level of FADS

4 討論

在試驗(yàn)中，測(cè)試了集成化功能模塊搭建的FADS，系統(tǒng)對(duì)含有GFP熒光轉(zhuǎn)染的大腸桿菌的陽(yáng)性液滴進(jìn)行了可靠的分選。目前，實(shí)現(xiàn)通量能達(dá)到200液滴每秒，分選的通量主要受限于微流控芯片。系統(tǒng)熒光探測(cè)下限可以達(dá)到2個(gè)光子，理論上分選通量能夠達(dá)到采樣率的1/4，約2 500滴/s。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，陰性液滴也會(huì)產(chǎn)生一定的熒光信號(hào)，該信號(hào)將成為系統(tǒng)的重要干擾因素。因此，F(xiàn)ADS的液滴分選通量受限于實(shí)驗(yàn)體系、微流控芯片設(shè)計(jì)，以及FADS等多方面的因素。

采用FADS功能模塊集成化設(shè)計(jì)、熒光激發(fā)和探測(cè)光路，以及PMT信號(hào)的模數(shù)轉(zhuǎn)換電路，可以集成到180 mm×143 mm×54 mm大小的功能模塊中；而采用分立的光學(xué)試驗(yàn)組件搭建的FADS[8]，光路部分尺寸為600 mm×800 mm×130 mm。因此，本研究提出的FADS功能模塊集成化設(shè)計(jì)方法，能夠有效減小FADS的體積。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，采用通用儀器搭建的FADS成本約為28萬(wàn)元[8]，而搭建本研究提出的集成化FADS硬件成本約為5萬(wàn)元，系統(tǒng)的搭建成本大幅降低。

采用集成化FADS功能模塊搭建FADS，熒光激發(fā)、熒光探測(cè)光路緊湊地集成在一個(gè)功能附件中。一方面，系統(tǒng)搭建無(wú)需對(duì)光學(xué)組件進(jìn)行復(fù)雜的調(diào)整工作，只需為顯微成像系統(tǒng)增添功能附件；另一方面，由于熒光激發(fā)光路和熒光探測(cè)光路集成在同一模塊中，系統(tǒng)無(wú)需頻繁地調(diào)整光路來(lái)減少由于光路失調(diào)對(duì)熒光探測(cè)效率的影響，降低了系統(tǒng)維護(hù)難度。

本研究提出的集成化FADS，在降低系統(tǒng)成本、減小系統(tǒng)體積的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)核心敏感組件的模塊化封裝、系統(tǒng)的模塊化搭建，為FADS的推廣提供了一個(gè)可行的解決方案。

目前，搭建的FADS分選判斷依據(jù)是液滴熒光信號(hào)強(qiáng)度是否超過(guò)設(shè)定閾值。當(dāng)熒光信號(hào)強(qiáng)度超過(guò)設(shè)定閾值時(shí)，判定液滴為陽(yáng)性，觸發(fā)高壓分選，否則為陰性，系統(tǒng)不動(dòng)作。這種方式簡(jiǎn)單高效，但是在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，熒光探測(cè)系統(tǒng)輸出常伴有尖峰狀噪聲，如果單純根據(jù)強(qiáng)度閾值來(lái)判斷，容易造成假陽(yáng)性結(jié)果。如果能夠引入“過(guò)閾值時(shí)間”判斷標(biāo)準(zhǔn)，即熒光強(qiáng)度超過(guò)閾值的時(shí)間達(dá)到一定長(zhǎng)度才判定當(dāng)前信號(hào)有效，則能夠避免尖峰噪聲造成的系統(tǒng)假陽(yáng)性錯(cuò)誤，從而進(jìn)一步提高系統(tǒng)的可靠性。另外，本研究提出的FADS系統(tǒng)集成了3個(gè)熒光探測(cè)通道，如何綜合三通道熒光強(qiáng)度來(lái)給出陽(yáng)性液滴的判斷條件較為復(fù)雜。3個(gè)熒光探測(cè)通道分別設(shè)置3個(gè)對(duì)應(yīng)的閾值，最終的判斷結(jié)果等于三通道獨(dú)立判斷結(jié)果的布爾運(yùn)算。這種方式適用于采用的熒光標(biāo)記物發(fā)射熒光波長(zhǎng)能夠較好地匹配探測(cè)波長(zhǎng)，即單一標(biāo)記物熒光波長(zhǎng)與特定探測(cè)通道波長(zhǎng)相匹配。如圖9(a)所示，標(biāo)記物發(fā)射熒光能夠被單一通道探測(cè)，沒(méi)有出現(xiàn)明顯混疊。當(dāng)標(biāo)記物熒光光譜較寬或者發(fā)射波長(zhǎng)位于兩個(gè)探測(cè)通道之間時(shí)，熒光信號(hào)分布于多個(gè)探測(cè)通道中，從而造成單一標(biāo)記物引發(fā)兩個(gè)通道熒光信號(hào)超過(guò)閾值。當(dāng)微液滴中包裹了多種熒光標(biāo)記物時(shí)，系統(tǒng)的陽(yáng)性判斷就會(huì)出現(xiàn)混亂。系統(tǒng)無(wú)法對(duì)單一標(biāo)記物的陽(yáng)性、陰性結(jié)果做出準(zhǔn)確的判斷。如何實(shí)現(xiàn)多種熒光標(biāo)記物同時(shí)存在于復(fù)雜反應(yīng)體系中，通過(guò)三通道熒光探測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確分辨某一熒光標(biāo)記物在多通道熒光檢測(cè)FADS中至關(guān)重要。另外，由于FADS要求從熒光檢測(cè)到做出分選判斷時(shí)間延遲足夠小(通常小于1 ms),從而滿足分選通量的要求，因此對(duì)算法的實(shí)時(shí)性要求較高。該穩(wěn)定算法的開(kāi)發(fā)，以及如何實(shí)現(xiàn)在嵌入式系統(tǒng)中實(shí)時(shí)運(yùn)行優(yōu)化，是下一步多通道探測(cè)FADS系統(tǒng)研究的重點(diǎn)。

5 結(jié)論

本研究提出了一種集成化設(shè)計(jì)的FADS功能模塊，相對(duì)于目前文獻(xiàn)中報(bào)道的系統(tǒng)具有體積小、成本低、易于維護(hù)等特點(diǎn)。另外，本研究提出基于成像系統(tǒng)像平面設(shè)計(jì)熒光激發(fā)和探測(cè)光路的方法，能夠有效地將FADS集成化，封裝成獨(dú)立的拓展功能模塊。使用該模塊，可以在成像設(shè)備的基礎(chǔ)上，靈活地拓展熒光激活液滴分選功能。實(shí)驗(yàn)表明，使用該模塊搭建FADS，能夠穩(wěn)定可靠地實(shí)現(xiàn)200液滴/s的分選通量，并且理論上仍具有很大的提升空間，對(duì)熒光激活液滴分選技術(shù)的推廣具有重要意義。

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10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 03.016

2015-10-19， 錄用日期:2016-02-26

R318

D

0258-8021(2016) 03-0370-05

Research on Integrated Fluorescence Activated Droplet Sorting System

Sheng Guangji Zhu Jun Fan Yubo#Li Ang*

(SchoolofBiomedicalScienceandMedicalEngineeringBeihangUniversity,Beijing100191,China)

# 中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)會(huì)員(Member, Chinese Society of Biomedical Engineering)

*通信作者(Corresponding author)， E-mail:eangli@yahoo.com