改性細(xì)菌纖維素/羥基磷灰石復(fù)合多孔支架合成方法的研究

南 方 王巧莉 賴(lài) 琛 奚廷斐,#*

1(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)2(北京大學(xué)深圳研究院人體組織再生與修復(fù)深圳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518057)

改性細(xì)菌纖維素/羥基磷灰石復(fù)合多孔支架合成方法的研究

南 方1王巧莉2賴(lài) 琛2奚廷斐1,2#*

1(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)2(北京大學(xué)深圳研究院人體組織再生與修復(fù)深圳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518057)

探討不同合成方法對(duì)改性細(xì)菌纖維素/羥基磷灰石復(fù)合支架微觀結(jié)構(gòu)和性能的影響。采用原位復(fù)合法、物理混合法及生物礦化法制備改性細(xì)菌纖維素(TBC)與羥基磷灰石(HA)復(fù)合多孔支架，利用掃描電鏡(SEM)、能譜分析(EDX)、X射線(xiàn)衍射(XRD)、傅里葉紅外變換光譜(ATR-FTI)對(duì)不同方法合成的產(chǎn)物進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)表征，同時(shí)通過(guò)力學(xué)實(shí)驗(yàn)確定不同支架的力學(xué)性能參數(shù)。SEM和ATR-FTI等結(jié)果表明，采用原位復(fù)合法、物理混合法及生物礦化法都可以成功地將HA復(fù)合在TBC的納米纖維上，但是復(fù)合的機(jī)理各不相同。原位復(fù)合法中HA納米顆粒是以螯合鍵的方式與TBC納米纖維上的羧基聯(lián)合，而物理混合和生物礦化法HA納米顆粒是采用靜電吸附的方式復(fù)合在TBC纖維上。XRD表明，不同方法合成的支架都出現(xiàn)了明顯的(211)峰，但峰的形態(tài)有明顯的差別。力學(xué)測(cè)試結(jié)果表明，復(fù)合后產(chǎn)物的力學(xué)性能也有很大的差異，采用原位復(fù)合的支架強(qiáng)度最低，復(fù)合后支架強(qiáng)度由4.67 MPa迅速減小到1.00 MPa，而用生物礦化復(fù)合的支架強(qiáng)度最高，復(fù)合后支架強(qiáng)度由4.67 MPa增加到到5.55 MPa。通過(guò)對(duì)不同方法合成的復(fù)合支架微觀結(jié)構(gòu)的表征和分析，為骨組織工程支架的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

氧化細(xì)菌纖維素；羥基磷灰石；多孔支架

引言

骨組織缺陷的修復(fù)與重造主要依賴(lài)于骨移植替代材料。膠原和羥基磷灰石是骨修復(fù)替代物中最通用的材料，因?yàn)樗鼈兊膹?fù)合物能夠模仿天然骨的細(xì)胞外間質(zhì)。羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是生物活性骨主要的無(wú)機(jī)化學(xué)成分，有良好的生物性能和骨傳導(dǎo)性，可以促進(jìn)骨細(xì)胞在材料表面生長(zhǎng)，因此是一種常用骨修復(fù)替代材料。但是HA的力學(xué)性能較差，達(dá)不到骨組織修復(fù)材料的要求，不能單獨(dú)應(yīng)用于骨修復(fù)材料[1]。HA與膠原構(gòu)成的復(fù)合材料也因其力學(xué)性能的原因在外壓下易碎。此外膠原呈現(xiàn)出其他一些明顯的缺陷，比如動(dòng)物源性、成本及免疫原性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)許多材料可部分或完全的替代膠原，在骨組織修復(fù)中滿(mǎn)足某些生理生化需求，包括明膠[2]、乳酸[3]、甲殼素[4]、殼聚糖[5]、絲素蛋白[6]及ZrO2[7]等。作為一類(lèi)多糖，細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose,BC)與膠原在納米纖維構(gòu)造方面有許多相似之處，但是BC沒(méi)有免疫原性。BC是一類(lèi)由細(xì)菌發(fā)酵的纖維素，包括木醋桿菌屬、棘阿米巴、無(wú)色桿菌屬、動(dòng)膠菌和其他菌類(lèi)[8]。作為一類(lèi)纖維素多聚物，BC是一類(lèi)由D-葡萄糖單體通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接而成的線(xiàn)性同源多聚物[9]。與植物纖維素相比，BC純度高，具有良好的持水性、生物相容性及力學(xué)強(qiáng)度和彈性模量[10]。這些特性也使BC在軟骨組織工程[11]、人工小血管[12]、大鼠血管替換[13]、人造骨骼[14]、創(chuàng)傷敷料[15]及生物補(bǔ)片等方面得到廣泛應(yīng)用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，BC作為骨再生材料可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖并改進(jìn)骨的再生過(guò)程[16]。HA與BC構(gòu)成的多孔支架可以通過(guò)多種方法獲得。在許多研究里都提及的生物礦化法[17-18]，用一個(gè)濕性BC模型模擬體液，包含一個(gè)與人體血漿的生理pH值和體溫相同的離子濃度。物理混合法涉及到將BC的水懸浮液與制備的HA顆粒混合[19-20]，它們主要通過(guò)靜電吸附使HA顆粒粘附在BC表面。在原位復(fù)合法里通過(guò)在BC的水懸浮液中滴定Ca2+、PO43-和OH-形成BC與HA的復(fù)合材料[21]。然而，纖維素的主要羥基組織對(duì)磷酸鈣晶體并沒(méi)顯示出高效的反應(yīng)活性[22]。此外，羥基組織會(huì)因?yàn)槌?xì)纖維間緊密纏繞的多羥基粘合而減少。因此，HA顆粒并不會(huì)同源分布于整個(gè)BC矩陣中。為了提高HA在BC纖維上的成核作用，BC必須進(jìn)行化學(xué)改性使其在納米纖維表面上形成離子態(tài)。Okita等研究發(fā)現(xiàn)，BC經(jīng)氧化后發(fā)生了氫鍵的斷裂，空間結(jié)構(gòu)在氧化后相對(duì)疏松[23]。還有研究表明，采用TEMPO氧化BC薄膜，可以改善材料的致密空間結(jié)構(gòu)，然而僅能對(duì)其表面進(jìn)行改性，對(duì)材料的整體結(jié)構(gòu)改變不大[24]。我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)找到方法來(lái)改性BC來(lái)創(chuàng)造各類(lèi)衍生物[9,25]。盡管改性反應(yīng)有不少困難，主要羥基組織位點(diǎn)C6上仍能發(fā)生羧基化。相比于細(xì)胞羥基，BC上的羧基化活性在增強(qiáng)，這是因?yàn)樵贐C羧基化形式里羥基的均一性得以改善。

本研究中，采用原位復(fù)合、物理混合和生物礦化等3種不同的方法將HA加入氧化的細(xì)菌纖維素(TBC)中。在這些實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，HA的濃度相同，唯一不同的是HA納米顆粒加入的途徑。通過(guò)不同途徑合成多孔支架來(lái)分析孔徑大小、結(jié)構(gòu)向異的差異，以探索改性BC與HA組成的復(fù)合材料能否滿(mǎn)足競(jìng)爭(zhēng)體制和生物先決條件，使其在骨組織工程中得到應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

(NH4)2HPO4(AR級(jí)，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，中國(guó))，Ca(NO3)2·4H2O(AR級(jí)，天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)，中國(guó))，氨水(AR級(jí)，25%，天津富宇精細(xì)化工有限公司，中國(guó))，TEMPO(AR級(jí)，Sigma公司，美國(guó))，NaClO溶液(有效氯13.4%,AR級(jí)，天津富宇精細(xì)化工有限公司，中國(guó))，NaClO2(AR級(jí)，Sigma公司，美國(guó))，細(xì)菌纖維素漿料(海南光宇生物科技有限公司，中國(guó))，磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/mL，pH值為6.89,上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司,中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌纖維素的氧化

TBC通過(guò)TEMPO氧化制備的[9,25]。為了在TEMPO/NaClO2/NaClO體系里獲得TBC樣品，首先將1 g BC加入300 mL磷酸鹽緩沖液中。然后加入0.1 mmol TEMPO和17 mmol NaClO2，將2 mL NaClO加入100 mL磷酸緩沖液中混合均勻，然后將混合液加入BC的懸浮液中。最后將混合溶液快速密封并放在磁力攪拌器上65℃恒溫?cái)嚢?0 h。關(guān)掉磁力攪拌器，加入10 mL乙醇終止反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物放入高速離心機(jī)中離心，棄掉上清沖洗壁上的沉淀物再離心，反復(fù)3次后放入低溫冰箱，冷凍干燥48 h后得到干燥的氧化纖維素樣品。

1.2.2 細(xì)菌纖維素氧化后羧基含量的測(cè)定

TBC中羧基含量的測(cè)定可以采用電導(dǎo)率滴定法[26]。稱(chēng)取0.2 g干燥后的TBC樣品，放入盛有70 mL水的燒杯中，加入3 mL 0.01 mol/L的Nacl溶液，在高速攪拌機(jī)下分散成勻漿。再向上述體系加入0.1 mol/L的HCl溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值到2.5～3.0之間。然后以0.04 mol/L的NaOH溶液作為標(biāo)準(zhǔn)的滴定液，用電導(dǎo)率滴定儀對(duì)上述體系進(jìn)行滴定測(cè)試。滴定中可能會(huì)有少部分的NaOH參與到副反應(yīng)中，但大部分的NaOH是參與到了與羧基的中和反應(yīng)中。因此，可根據(jù)NaOH的消耗量來(lái)計(jì)算羧基含量[27]。羧基含量的計(jì)算公式為

(1)

式中：V2是右邊等當(dāng)點(diǎn)NaOH溶液的體積，mL；V1是左邊等當(dāng)點(diǎn)NaOH溶液的體積，mL；C是NaOH溶液的濃度；W是干燥的TBC的質(zhì)量。

1.2.3 氧化細(xì)菌纖維素和羥基磷灰石多孔支架的制備

對(duì)于原位復(fù)合法，分別制備0.5 mol/L的(NH4)2HPO4和1 mol/L的Ca(NO3)2溶液，放入滴定管中。取1 g干燥的TBC樣品在室溫下放入去離子水中并在25 000 r/min攪拌器下攪拌，形成懸浮的漿料。(NH4)2HPO4和Ca(NO3)2溶液在室溫下通過(guò)滴定管同時(shí)緩慢的加入到攪拌速率為5 000 r/min的TBC漿料中，滴定管的速率保持在4 mL/min,利用NaOH(0.5 M)保持溶液的pH值在11以上。反應(yīng)結(jié)束后將混合體系放入真空干燥器中1 h除去氣飽。然后轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯模具(12.5 cm×8.5 cm×2.0 cm，64孔)中，放入-20℃低溫冰箱中冷凍24 h。再將冷凍的樣品放入凍干機(jī)中，冷凍干燥48 h，獲得多孔支架。

在物理混合法中，0.5 mol/L(NH4)2HPO4和1 mol/LCa(NO3)2溶液共同倒入密封反應(yīng)釜中，在120℃下反應(yīng)24 h，自然冷卻，過(guò)濾沉淀，用去離子水清洗3遍，75℃的烘箱中干燥24 h，獲得平均長(zhǎng)度500 nm的針狀HA顆粒。并如上述方法制備TBC懸浮液。在攪拌速率為1 000 r/min的TBC懸浮液中加入HA顆粒，8 h后，停止反應(yīng)，如上述方法，制備TBC/HA支架。

生物礦化法制備多孔支架，分別配制1 mol/L CaCl2和0.5 mol/LNaH2PO4的礦化液。將柱形TBC(高10 mm，直徑5 mm)的支架分別依次浸入CaCl2和NaH2PO4溶液中，在37℃、轉(zhuǎn)速50 r/min條件下震蕩30 min,在每次支架從礦化液中取出時(shí)，用去離子水沖洗，用濾紙吸干多余的液體，再放入另一種礦化液中，進(jìn)行3～8次循環(huán)。最終樣品在37℃烘箱中干燥3 d。

1.2.4 多孔支架場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(SEM)檢測(cè)

采用掃描電鏡(MIRA3型，TESCAN, 捷克)觀察樣品的表面形態(tài)，在觀察前先對(duì)樣品進(jìn)行噴金處理，支架樣品一般會(huì)進(jìn)行2次噴金處理。比較3種不同的方法制成的多孔支架的表面形態(tài)。觀察過(guò)程中對(duì)生物礦化制作的支架樣品選擇晶體相對(duì)集中的位置，并對(duì)此區(qū)域的物質(zhì)用能譜分析儀(Genesis Apollo X/XL型，EDAX，美國(guó))進(jìn)行能譜分析。

1.2.5 多孔支架的X射線(xiàn)衍射(XRD)檢測(cè)

使用X-衍射儀(D/max-2500/PC型，Rigaku，日本)，對(duì)TBC、HA、不同方法制備的TBC/HA樣品進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試的條件：CuKa射線(xiàn)、Ni濾波、40 mA電流，掃描的范圍2θ=10°～40°。

1.2.6 多孔支架傅里葉紅外變換光譜(FTIR)測(cè)定

采用光譜儀(Nicolet 6700型，Thermo, 美國(guó))來(lái)測(cè)量?jī)龈傻膹?fù)合支架樣品的ATR-FTIR光譜,采樣器進(jìn)行32次掃描，分辨率為4 cm-1，掃描范圍為1 100～1 700 cm-1。

1.2.7 多孔支架力學(xué)強(qiáng)度的測(cè)試及相對(duì)密度

利用萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(Z005型，Zwick，德國(guó))測(cè)量支架材料的力學(xué)性能。以壓縮速度5 mm/min，壓縮比100%為控制條件。比較3種不同的方法制得的納米復(fù)合材料的壓縮楊氏模量。

相對(duì)密度和楊氏模量關(guān)系密切，它對(duì)支架的硬度和強(qiáng)度有明顯的影響，計(jì)算方式為

(2)

式中，E*和Es分別表示多孔支架和疏松材料的楊氏模量，ρ*和ρs分別表示多孔固體和疏松材料的密度；C是一個(gè)常數(shù)，在Oscar′s的實(shí)驗(yàn)里表明它與孔的規(guī)律性成反比[28]。C值的增加表示支架中孔的分布更加隨意及結(jié)構(gòu)向異性變大，而不同的多孔體系指數(shù)不同。

2 結(jié)果

2.1 SEM分析

圖1 不同方法制備的多孔支架的電鏡交聯(lián)區(qū)域圖片。(a)和(b) 原位復(fù)合法按照TBC∶HA=1∶1.5制成多孔支架及其局部放大；(c)和(d)物理混合法的質(zhì)量比是TBC∶HA=1∶1.5及其局部放大；(e)和(f)生物礦化法中TBC多孔支架6次循環(huán)浸入CaCl2和NaH2PO4溶液及其局部放大Fig.1 Cross-sectional SEM images of sponges prepared under different methods.(a) and (b) Sponges prepared by in situ formation with a weight ratio of TBC：HA=1∶1.5 and local enlarged image; (c)and(d) Sponges prepared by physical mixing with a weight ratio of TBC：HA=1∶1.5 and local enlarged image; (e) and (f) Biomineralized TBC sponges after 6 cycles of alternate soaking in calcium and phosphate solutions and local enlarged image

不同方法制備支架的掃描電鏡如圖1所示。在不同的TBC多孔支架上HA納米顆粒的尺寸和形態(tài)不同。從支架的截面圖可以看到，采用原位復(fù)合法制備的多孔支架(見(jiàn)圖1(a))，孔徑較小，孔道較深，孔隙率也相對(duì)較大。從局部放大圖(見(jiàn)圖1(b))可以清楚地看到，TBC的納米纖維較為疏松分散，形成疏松的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，HA的納米顆粒呈球形，附著在單根納米線(xiàn)或者納米束上。采用物理混合法制備的多孔支架(見(jiàn)圖1(c))空隙率明顯降低，孔道不貫通，有明顯的白色點(diǎn)狀沉淀附著在支架中，局部放大圖(見(jiàn)圖1(d))顯示點(diǎn)狀沉淀是針狀HA納米顆粒的聚集體。針狀是水熱法合成HA的典型形態(tài)。礦化法制備的支架(見(jiàn)圖1(e))由于反復(fù)浸漬循環(huán)，孔道出現(xiàn)坍塌，有較多的白色固體沉淀在支架中，局部放大圖(見(jiàn)圖1(f))顯示HA顆粒呈珊瑚狀堆積。

圖2 TBC/HA復(fù)合材料礦化7 d的EDX圖譜Fig.2 Spectra of TBC/HA composite mineralization for 7 days

圖3 TBC/HA復(fù)合材料礦化21 d的EDX圖譜Fig.3 EDX spectra of TBC/HA composite mineralization for 21 days

2.2 EDX分析

在電鏡觀察礦化法制備的TBC/HA復(fù)合支架時(shí)，尋找晶體相對(duì)聚集的地方做能譜分析。EDX圖譜中各原子比例見(jiàn)圖2、3，本實(shí)驗(yàn)選擇的是礦化7和21 d的兩組支架所做的能譜分析。表1和表2顯示了支架中含有碳、氧、鋁、鈣、磷等元素。其中，礦化7d的鈣磷比例為1.28，礦化21 d的鈣磷比例為1.55。羥基磷灰石中鈣磷的比例為1.67，生物礦化法中的鈣磷比相比羥基磷灰石中的鈣磷比略低些。

表1 TBC/HA復(fù)合材料的原子比列Tab.1 The Element ratio of TBC/HA composite

表2 TBC/HA復(fù)合材料的原子比列Tab.2 The Element ratio of TBC/HA composite

2.3 XRD分析

各種支架樣品的XRD圖譜如下所示。圖4中曲線(xiàn)A是純HA的衍射圖譜，尖銳的峰型表明了水熱法合成的HA具有較高的結(jié)晶度，31.5、32.9、34.0度分別對(duì)應(yīng)了(211)，(112)，(202)面。3種復(fù)合方法制備的復(fù)合材料具有類(lèi)似的XRD衍射圖形，同時(shí)出現(xiàn)了(211)面的衍射峰。原位復(fù)合法制備的材料(見(jiàn)圖4中曲線(xiàn)B)，(211)峰是非常明顯的無(wú)定形態(tài)寬峰，說(shuō)明了在此體系中出現(xiàn)的HA顆?；緦儆跓o(wú)定形態(tài)。但非常明顯的區(qū)別是，礦化體系中獲得的復(fù)合材料(見(jiàn)圖4中曲線(xiàn)C)，(211)峰相對(duì)尖銳，表明體系中存在的HA的結(jié)晶程度比原位法要強(qiáng)。物理混合法制備的TBC/HA復(fù)合材料出現(xiàn)了比較尖銳的(211)峰(見(jiàn)圖4中曲線(xiàn)D)，表明了體系中存在著晶型較好的HA。TBC的XRD圖譜(見(jiàn)圖4中曲線(xiàn)E)展示了典型的纖維素晶體結(jié)構(gòu)的圖形，在14.4和22.5處出現(xiàn)明顯的峰值，分別對(duì)應(yīng)于(112)和(002)面。這與純BC的圖譜[9]基本上沒(méi)有差異。

圖4 TBC/HA復(fù)合材料X射線(xiàn)衍射圖(A-純HA；B-TBC∶HA=1∶1.5(原位復(fù)合法)；C - TBC:HA6次循環(huán)(生物礦化法)；D-TBC：HA=1∶1.5(物理混合法)；E-TBC)Fig.4 X-ray diffraction patterns of TBC-HA composites(A-Pure HA；B-TBC∶HA=1∶1.5(in situ formation)；C-TBC:HA 6 cycles(biomineralization)；D-TBC∶HA=1∶1.5(physical mixing)；E-TBC)

2.4 FTIR分析

各種樣品的紅外反射圖如圖5所示。因?yàn)橹饕茄芯緾OO-基團(tuán)與Ca2+之間相互作用的形態(tài)，所以本研究集中于從1 700～1 100 cm-1中外區(qū)域部分的峰值變化。對(duì)于生物礦化法的樣品(見(jiàn)圖5中曲線(xiàn)A)，COO-很難識(shí)別并分裂成許多小峰，說(shuō)明在生物礦化的過(guò)程中，COO-與Ca2+發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)比較復(fù)雜。物理混合法的圖譜中COO-振動(dòng)峰消失(見(jiàn)圖5中曲線(xiàn)B)，但是在1 481～1 431 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)較寬的峰，證明有較弱的新鍵產(chǎn)生。在1 481和1 431 cm-1處新出現(xiàn)的峰，表明了采用原位法制備的復(fù)合物中形成了新的COO-Ca螯合鍵(見(jiàn)圖5中曲線(xiàn)C)。在1 552和1 417 cm-1處的峰是TBC中COO-的振動(dòng)峰(見(jiàn)圖5中曲線(xiàn)D)。

圖5 各種樣品的ATR-FTIR圖譜(A-生物礦化法制備的TBC/HA(6次循環(huán))；B-物理混合法制備的TBC/HA(TBC∶HA=1∶1.5)；C-原位復(fù)合法制備的TBC/HA(TBC∶HA=1∶1.5)；D-TBC)Fig.5 ATR-FTIR spectra of various samples (A-TBC/HA prepared by biomineralization(6 cycles);B-TBC/HA prepared by physical mixing (TBC∶HA=1∶1.5); C-TBC/HA prepared by in situ formation(TBC∶HA=1∶1.5); D-TBC)

2.5 力學(xué)性能分析

圖6 不同方法制備樣品的楊氏模量。(a)原位復(fù)合法；(b)物理混合法；(c)生物礦化法Fig.6 Young′s modulus of samples prepared by different methods. (a) In situ formation; (c) Physical mixing; (d) Biomineralization

各種樣品的力學(xué)性能如圖6所示。不同的復(fù)合方法，復(fù)合材料的力學(xué)性能有很大不同，可見(jiàn)HA的形態(tài)對(duì)材料的力學(xué)性能有很大的影響。原位復(fù)合法制備的多孔支架，HA的出現(xiàn)會(huì)引起楊氏模量顯著減小(見(jiàn)圖6(a))，這表明在TBC的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中HA的出現(xiàn)會(huì)削弱力學(xué)特性。在物理混合法當(dāng)中，HA顆粒的加入在低水平區(qū)域內(nèi)(質(zhì)量比TBC∶HA=1∶0.75，圖6(b))使得楊氏模量輕微的增加。當(dāng)質(zhì)量比增加到1∶1.5時(shí)，楊氏模量明顯減小。在圖6(c)中，能看到生物礦化法合成支架的楊氏模量隨著HA比例的增高有輕微增加的趨勢(shì)。

相對(duì)密度是指多孔固體與疏松材料的密度比值(ρ*/ρs)[28]，對(duì)于多孔材料來(lái)說(shuō)它是一個(gè)重要的參數(shù)，與力學(xué)強(qiáng)度也有較大的關(guān)系。

圖7顯示了不同樣品的相對(duì)密度。原位復(fù)合法和物理混合法做了4個(gè)濃度梯度的樣品，礦化法對(duì)應(yīng)于3次循環(huán)、5次循環(huán)、6次循環(huán)和8次循環(huán)。相對(duì)密度的變化趨勢(shì)與彈性模量比較相似。純BC材料因?yàn)槲⒂^結(jié)構(gòu)致密因而有高的相對(duì)密度。原位復(fù)合法制備的多孔支架結(jié)構(gòu)疏松，孔隙率高，因此密度低。物理合成法中HA含量增加，密度降低，呈現(xiàn)一個(gè)最小值后然后開(kāi)始增加。采用生物礦化法制備的支架強(qiáng)度明顯比另兩種方法要強(qiáng)很多，甚至比純BC支架都要強(qiáng)。從以上測(cè)試結(jié)果可以得出結(jié)論，HA與TBC的復(fù)合方式以及HA的微觀形態(tài)對(duì)復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu)和宏觀性能都有較大的影響。

圖7 不同方法制備的各種樣品的相對(duì)密度Fig.7 The relative density various samples prepared by different methods.

2.6 羧基含量的測(cè)定

BC經(jīng)過(guò)氧化后，C6上的羥基最終被氧化成了羧基，通過(guò)電導(dǎo)率滴定法根據(jù)消耗的NaOH的量來(lái)計(jì)算氧化后細(xì)菌纖維素中羧基的含量。表3所示是選取的3組數(shù)據(jù)計(jì)算的羧基的含量?？梢钥闯觯拷M測(cè)量因?yàn)闅溲趸c消耗量的差異，羧基含量稍微有些差別。0.2 g的TBC樣品中，羧基含量平均值為0.67 nmol/g。

表3 羧基的含量Tab.3 The content of carboxy

3 討論

BC經(jīng)過(guò)TEMPO/NaClO2/NaClO氧化體系進(jìn)行改性后，C6上的-OH先被選擇性的氧化成-CHO，在進(jìn)一步的氧化成-COOH基團(tuán)(見(jiàn)圖8(a)、(b))。氧化后的TBC與BC在結(jié)構(gòu)上比較而言，親電基團(tuán)增多，氫鍵作用減弱，結(jié)構(gòu)由致密變得相對(duì)疏松。

圖8 不同方法制備的多孔支架的內(nèi)部反應(yīng)原理。(a)純BC；(b)TBC；(c)生物礦化；(d)物理混合；(e)原位復(fù)合。Fig.8 The internal reaction mechanism of different methods for preparation of porous scaffolds.(a) Pure BC;(b)TBC; (c) Biomineralization; (d) Physical mixing; (e) In situ formation.

XRD圖顯示了各種復(fù)合方法如何影響材料的晶體結(jié)構(gòu)。對(duì)于TBC而言典型的I型纖維的衍射峰是在2θ圖里14.4和22.5處出現(xiàn)的峰。純的HA納米顆粒在32.9處也出現(xiàn)典型的晶型峰(211)，同時(shí)COO-分裂形成了其他3個(gè)小的新型峰。原位復(fù)合法里，晶型圖的線(xiàn)條比較粗糙，(211)處的峰呈無(wú)定形態(tài)的寬峰。這說(shuō)明原位法合成的多孔支架的HA晶體結(jié)構(gòu)差。物理混合法構(gòu)成的復(fù)合材料的晶型圖與TBC的相似，說(shuō)明此法構(gòu)成的支架結(jié)晶度和密度高。由于HA顆粒在TBC中不均勻的分布，在該圖譜中沒(méi)有相應(yīng)的HA峰出現(xiàn)。生物礦化法也沒(méi)有相應(yīng)的HA峰的產(chǎn)生，但是在32處出現(xiàn)了一個(gè)寬的峰，說(shuō)明TBC和HA可以共存的。

通過(guò)觀察FT-IR圖可知，TBC在1552/1417兩處出現(xiàn)了明顯的羧基峰。對(duì)比3種不同復(fù)合方法的紅外圖譜可知，在原位復(fù)合當(dāng)中，由于TBC上的COOH與HA中的Ca2+形成了COOCa，所以在1431/1481處產(chǎn)生新的峰。物理混合法里，與TBC圖譜比較而言，圖譜變化不大說(shuō)明TBC與HA反應(yīng)微弱。在礦化反應(yīng)中出現(xiàn)了許多的小峰，而且羧基峰很難識(shí)別，這是由于TBC的保護(hù)使其活性減弱。3種方法構(gòu)成的復(fù)合支架的紅外圖都表明，HA晶體被成功地結(jié)合到TBC空間結(jié)構(gòu)中。

3種方法構(gòu)成的多孔支架的楊氏模量圖變化很明顯，說(shuō)明HA的形態(tài)對(duì)多孔支架力學(xué)性能有顯著的影響。在原位法里，楊氏模量變化很明顯，有近75%的減小，說(shuō)明HA顆粒會(huì)削弱纖維素之間的力學(xué)強(qiáng)度。物理法中，只有當(dāng)TBC與HA比例從1∶1.5到1∶3時(shí)，楊氏模量迅速減少。這說(shuō)明，小比例的HA的加入對(duì)纖維的力學(xué)性能影響不大，但超過(guò)這個(gè)比例，力學(xué)性能會(huì)被嚴(yán)重削弱。礦化法里，隨著HA的不斷加入，力學(xué)性能基本不變。這些結(jié)果表明，HA顆粒的晶型結(jié)構(gòu)對(duì)力學(xué)性能有顯著影響。

4 結(jié)論

對(duì)改性的細(xì)菌纖維素與羥基磷灰石納米顆粒，采用原位復(fù)合法、物理混合法及生物礦化法等3種不同方法構(gòu)成的多孔支架，進(jìn)行SEM、EDX、XRD、FTIR、力學(xué)性能及相對(duì)密度進(jìn)行測(cè)試分析。3種方法都可以使HA顆粒成功的結(jié)合在TBC上。對(duì)比3種方法形成的支架對(duì)微觀結(jié)構(gòu)的影響，原位復(fù)合法通過(guò)螯合作用和共價(jià)鍵使支架的孔徑變大、結(jié)構(gòu)疏松分布不規(guī)律、支架的力學(xué)強(qiáng)度最小。生物礦化法COOH活性被保護(hù)，反應(yīng)復(fù)雜，有珊瑚狀致密結(jié)構(gòu)產(chǎn)生、支架的力學(xué)強(qiáng)度最高。物理混合法通過(guò)靜電作用使支架孔徑逐漸被堵、孔的橫截面變大、微觀結(jié)構(gòu)整齊、支架的力學(xué)強(qiáng)度介于兩者之間。比較而言，螯合作用和靜電作用在TBC與HA反應(yīng)中占主導(dǎo)地位。所構(gòu)成的多孔支架基本上滿(mǎn)足了競(jìng)爭(zhēng)體制要求，可用于骨組織修復(fù)材料。不過(guò)本實(shí)驗(yàn)以細(xì)菌纖維素作為基礎(chǔ)材料，通過(guò)氧化改性再與羥基磷灰石進(jìn)行復(fù)合，制備骨修復(fù)材料的研究只限于微觀結(jié)構(gòu)的表征分析，如在臨床上得以應(yīng)用，還需進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

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Research on the Synthesis of Modified Bacterial Cellulose/Hydroxyapatite Sponges

Nan Fang1Wang Qiaoli2Lai Chen2Xi Tingfei1,2*

1(SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience，WenzhouMedicalUniversity，Wenzhou325035，Zhejiang,China)2(ShenzhenkeyLaboratoryofHumanTissueRegenerationandRepair，ShenzhenInstituteofPekingUniversity,Shenzhen518057,Guangdong,China)

The purpose of this study is to investigate three kinds of preparation methods for bacterial cellulose and hydroxyapatite sponges and compare the microstructure and characteristics.The modified bacterial cellulose (TBC) and hydroxyapatite (HA) sponges were fabricated byinsituformation, physical mixing orbiomineralization. Samples prepared by the different methods were characterized using scanning electron microscopy (SEM), energy spectrum analysis(EDX),X-ray diffraction (XRD), Fourier IR transform spectroscopy (ATR-FTI). Furthermore mechanical performance of the sponges prepared with different parameters were tested as well.Experimental results showed that by theinsituformation, physical mixing orbiomineralization HA was successfully deposited on TBC nanofibers, but mechanisms were different.By theinsituformation method, HA nanoparticles took the form of chelate keys associated with TBC nano fibers on the carboxyl. In the physical mixing orbiomineralization methods, HA nanoparticles became electrostatically adsorbed on TBC nanofibers.XRD results showed that there were obvious (211) peaks in the scaffolds synthesized by different methods, but there were significant differences in the morphology of the peaks.Mechanical results showed that microstructure and mechanical properties of sponge also had very big difference with different composite methods. By theinsituformation method, the scaffold minimum intensity was reduced from 4.67MPa to 1.00MPa,while by the biomineralization, scaffold maximum intensitywas increased from 4.67MPa to 5.55MPa. Through the analysis of the microstructure and characterization of the scaffolds，our study could provide the basis for their application to bone tissue engineering.

oxidation of bacterial cellulose; hydroxyapatite; sponge

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 03.011

2015-09-25， 錄用日期:2016-01-22

深圳市基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(JCYJ20140419114548513)

R318

A

0258-8021(2016) 03-0330-010

# 中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)會(huì)員(Member, Chinese Society of Biomedical Engineering)

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: xingtingfei@pku.edu.cn