骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合海螵蛸支架的部分生物學(xué)安全性評估

彭 雅 覃 裕 顧春松 易洪城*

1(貴州省骨科醫(yī)院骨內(nèi)二科，貴陽 550002)2(貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨二科，貴陽 550002)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合海螵蛸支架的部分生物學(xué)安全性評估

彭 雅1覃 裕1顧春松2易洪城2*

1(貴州省骨科醫(yī)院骨內(nèi)二科，貴陽 550002)2(貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨二科，貴陽 550002)

制作與鑒定自體兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-海螵蛸復(fù)合支架，進(jìn)行生物學(xué)安全性評估。采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法,體外培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs);采用沉淀法，構(gòu)建BMSCs-海螵蛸復(fù)合支架;通過電鏡掃描及MTT試驗，對復(fù)合支架進(jìn)行檢測。選取40只新西蘭兔, 分兩組分別植入BMSCs-海螵蛸復(fù)合支架(試驗組)或海螵蛸支架(對照組),通過肌肉植入試驗評估復(fù)合支架的生物學(xué)安全性。密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選分離培養(yǎng)出干細(xì)胞，其免疫細(xì)胞化學(xué)檢測表面抗原CD29(+)。電鏡掃描測得海螵蛸支架孔隙率為81.730%±6.770%。掃描電鏡下見細(xì)胞黏附于海螵蛸支架爬行生長，分泌胞間基質(zhì)。MTT檢測：復(fù)合培養(yǎng)第1、3、5、7天之間吸光值兩兩比較，均有顯著性差異(P<0.05),細(xì)胞呈逐漸增殖趨勢;第7、8天比較無顯著差異，表明第8天細(xì)胞無明顯增殖。肌肉植入試驗的血常規(guī)、血生化檢測，復(fù)合支架組(試驗組)與海螵蛸組(對照組)檢測結(jié)果無顯著差異，復(fù)合支架的各項指標(biāo)達(dá)標(biāo)。病理切片：第7天，試驗組與對照組的組織炎癥反應(yīng)為III～I(xiàn)V級；第14天，二者的組織炎癥反應(yīng)為II～I(xiàn)II級；第28天，二者的組織炎癥反應(yīng)為I～I(xiàn)I級；第56天，二者的組織炎癥反應(yīng)為0～I(xiàn)級：均符合肌肉植入試驗結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)。自體BMSCs能與中藥海螵蛸聯(lián)合培養(yǎng)構(gòu)建復(fù)合支架，支架上的細(xì)胞數(shù)量隨培養(yǎng)時間延長而增多，第7天時達(dá)增殖高峰。研究表明，此復(fù)合支架的組織相容性良好，符合生物材料的應(yīng)用要求。

兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；海螵蛸；復(fù)合支架；生物安全性；骨組織工程

引言

骨組織工程是一門融合了工程學(xué)、細(xì)胞學(xué)、組織生物學(xué)等多方面知識的高新學(xué)科[1]。 將自體細(xì)胞或干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至生物支架材料上，經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)擴(kuò)增，形成細(xì)胞/材料三維空間復(fù)合體,植入骨缺損位置,替代、修復(fù)組織缺損,促進(jìn)骨再生。就目前而言,將細(xì)胞與中醫(yī)中藥構(gòu)建復(fù)合支架的報道并不多見。中藥海螵蛸[2]為烏賊科動物多種烏賊的內(nèi)殼,烏賊骨中含有豐富的礦物質(zhì)及微量元素,且孔隙發(fā)達(dá), 已被作為支架材料做過相關(guān)研究[3-5]。 骨髓來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，較容易向成骨方向定向誘導(dǎo)和分化，取材方便，增殖能力強(qiáng)，易于操作，同種異體BMSCs移植免疫排斥反應(yīng)較弱，分離和使用也不存在倫理學(xué)問題，因此常被作為骨組織工程種子細(xì)胞的首要選擇。

本試驗是建立在對兔自體骨髓、海螵蛸及玻璃酸鈉聯(lián)合修復(fù)兔橈骨缺損研究[6-7]基礎(chǔ)上的進(jìn)一步改良，體外構(gòu)建自體BMSCs-海螵蛸復(fù)合生物支架，參照《醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)》[8]，通過肌肉植入試驗，對復(fù)合支架進(jìn)行生物安全性評估，為下一步修復(fù)骨缺損研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗試劑：DMEM 培養(yǎng)液(LG、F/12)，Hyclone公司；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶，Gibco 公司；兔骨髓干細(xì)胞分離液試劑盒、兔CD29抗體，天津灝洋公司。實驗動物：清潔級新西蘭大白兔50只，雌雄不限，體重2.5 kg左右，購于貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，許可證號SCXK(黔)2013-001。實驗中藥材：海螵蛸，貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中藥房提供。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs制備[9]

10%水合氯醛腹腔麻醉白兔，髂后上棘處骨髓穿刺，抽骨髓4 mL，采用兔骨髓干細(xì)胞分離試劑盒提取細(xì)胞，密度梯度離心聯(lián)合貼壁法培養(yǎng)BMSCs。取3～4代BMSCs進(jìn)行實驗。

1.2.2 孔隙率檢測

1)橫斷截取海螵蛸，脫脂脫蛋白，環(huán)氧乙烷熏蒸消毒，備用。

2)采用孔隙率檢測-壓酒精法[10]，取5個海螵蛸樣品支架(φ3 mm×10 mm，已消毒烘干)進(jìn)行檢測：電子天平稱重，5個海螵蛸支架樣品總重W0；比重瓶倒?jié)M100%酒精，稱重W1；將5個海螵蛸支架樣品浸入100%酒精，待充分脫氣,使酒精完全充盈于復(fù)合物樣本微孔中,加滿酒精稱重W2；取出海螵蛸樣品,稱取剩余酒精與比重瓶的和重，記為W3?？紫堵师趴杀硎緸?/p>

計算5次，取其平均值。

1.2.3 BMSCs-海螵蛸復(fù)合支架構(gòu)建

采用沉淀法[11]，構(gòu)建BMSCs-海螵蛸復(fù)合支架。選P3代BMSCs，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整密度5×105個/mL。將BMSCs接種于24孔板中海螵蛸(φ3 mm×10 mm)上，復(fù)合培養(yǎng)8 d，2～3 d換液一次。

1.2.4 細(xì)胞表型鑒定[12]

取P3代細(xì)胞，制作細(xì)胞爬片，采用免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定法，檢測細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD29，用PBS溶液替代一抗樣品，作為空白對照組。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞顯色情況，攝影。

1.2.5 BMSCs-海螵蛸復(fù)合支架鑒定

1)掃描電鏡鑒定。將復(fù)合支架固定后，置于掃描電鏡下觀察。

2)MTT檢測[13]。海螵蛸支架30個(φ3 mm×3 mm，已消毒), 分別置入5個無菌96孔板內(nèi)，6個/板。同上方法,調(diào)整P3 代BMSCs密度5×104/mL，接種于海螵蛸上，復(fù)合培養(yǎng)。分別于第1、3、5、7、8 d，取出相應(yīng)培養(yǎng)板，采用MTT檢測法，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測量各孔的吸光值(檢測波長調(diào)節(jié)為490 nm)。計算各時相點吸光度平均值，繪制細(xì)胞增殖曲線(橫坐標(biāo)為時間，縱坐標(biāo)為吸光值)。

1.2.6 肌肉植入試驗[14-15]

對BMSCs-海螵蛸復(fù)合支架進(jìn)行安全性評估。健康新西蘭兔，40只，隨機(jī)分為試驗組及對照組，編號記錄。麻醉白兔，術(shù)區(qū)脫毛，消毒鋪敷，于脊旁1.5 cm處做1～2 cm縱形切口，鈍性分離肌肉組織，深度為1～2 cm，分別植入BMSCs-海螵蛸復(fù)合支架(試驗組)或海螵蛸支架(對照組)，縫合，一周后拆線。術(shù)后注射適量青霉素，以防止感染。于7、14、28、56 d進(jìn)行檢測觀察，一是血常規(guī)及肝腎功能檢測，二是病理切片檢測。于術(shù)后第7、14、28、56 d，切取支架周圍0.5～1.0 cm厚肌肉組織，行病理切片觀察，結(jié)果評價見表1、2。

表1 炎性細(xì)胞反應(yīng)分級

表2 肌肉植入試驗結(jié)果評定參考標(biāo)準(zhǔn)

主要觀察指標(biāo)如下：

1)海螵蛸支架孔隙率檢測；

2)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測表面抗原CD29；

3)BMSCs-海螵蛸復(fù)合支架電鏡掃描；

4)復(fù)合支架MTT生長曲線；

5)安全性評估肌肉檢測試驗結(jié)果是否符合《醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)》。

2 結(jié)果

2.1 海螵蛸孔隙率檢測

組織工程中對支架材料的要求之一就是具有多孔性，以促進(jìn)細(xì)胞的黏附、爬行、生長和分化。本試驗測得海螵蛸支架孔隙率為81.730%±6.770%(見表3)，較符合文獻(xiàn)要求[16]。

表3 海螵蛸支架的孔隙率測定值

2.2 表面抗原CD29檢測

經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，可見絕大部分細(xì)胞胞漿為棕紅色或棕褐色，表明細(xì)胞表面抗原CD29呈陽性(見圖1)。此結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致[16]，說明本實驗提取純化的細(xì)胞是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，不是成纖維細(xì)胞或造血干細(xì)胞。

圖1 BMSCs表面抗原CD29免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果(光學(xué)顯微鏡100×)Fig.1 Immunoctochemistry Detection-Surface antigen CD29. Optical microscope (100×)

2.3 復(fù)合支架結(jié)構(gòu)觀察

如圖2所示，BMSCs與海螵蛸支架復(fù)合培養(yǎng)第5天，經(jīng)掃描電鏡觀察,見細(xì)胞爬行于海螵蛸支架表面，胞漿突起，逐漸伸出片狀偽足，形態(tài)以橢球形、多角形、梭形為主，細(xì)胞周圍有細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，但細(xì)胞生長區(qū)域較分散，在黏附數(shù)量上效果欠佳。

圖2 復(fù)合支架掃描電鏡圖(1500×)Fig.2 Scanning electron microscopy test of BMSCs-cuttlebone composite scaffold(1500×)

2.4 復(fù)合支架MTT檢測

第1、3、5、7 d之間吸光值兩兩比較，P<0.05，各組間數(shù)值存在差異，有統(tǒng)計學(xué)意義，細(xì)胞呈逐漸增殖趨勢；第7、8 d比較，P>0.05,無統(tǒng)計學(xué)差異，第8 d細(xì)胞無明顯增殖(見表4)。

表5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-海螵蛸生物支架(實驗組)和海螵蛸支架(對照組)植入兔肌肉后不同時相點對血常規(guī)的影響(n=5，±S)

注：各指標(biāo)內(nèi)，*與對照組同時相點值相比較，P<0.05。

Note:*compared with the control group at the same phase point,P<0.05.

表4 各時間點上各組吸光度值及細(xì)胞相對增值率(n=6，±S)

注：*與第1 d比較，P<0.05；#與第3 d比較，P<0.05；△與第5 d比較，P<0.05。

Note:*with the day 1 comparativeP<0.05.#with the day 3 comparativeP<0.05;△with the day 5 comparativeP<0.05.

圖3的細(xì)胞生長曲線顯示：第1 d，細(xì)胞數(shù)量較少，但有開始增殖的趨勢；第1～3 d,細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)增長期;第3～5 d，細(xì)胞仍能繼續(xù)保持增殖趨勢；第7 d，細(xì)胞數(shù)量達(dá)最高值；第7～8 d，細(xì)胞增殖速度減慢，開始呈下降趨勢。

圖3 細(xì)胞生長曲線Fig.3 The cell growth curve

2.5 安全性評估檢測

2.5.1 肌肉植入術(shù)后血液檢測結(jié)果

隨著術(shù)后時間延長，到第8周時血液常規(guī)、血生化檢測值基本達(dá)到正常參考值[18-19]范圍，且在不同時相點兩組間各指標(biāo)值大部分無明顯差異(見表5、6)。這說明，BMSCs-海螵蛸復(fù)合支架未對白兔肌肉組織產(chǎn)生明顯的排斥反應(yīng)及肝腎功能損害。

2.5.2 肌肉植入試驗組織切片病理學(xué)檢查結(jié)果

支架材料周圍肌肉組織切片HE染色結(jié)果如圖4所示，可看出BMSCs-海螵蛸復(fù)合支架與海螵蛸支架檢測結(jié)果無明顯差異。植入7 d后，炎癥反應(yīng)程度為Ⅲ～Ⅳ級≤Ⅳ級；植入14d，炎癥反應(yīng)程度為Ⅱ～Ⅲ級≤Ⅲ級；植入28d，炎癥反應(yīng)程度為Ⅰ～Ⅱ級≤Ⅱ級；植入56d，炎癥反應(yīng)程度為0～Ⅰ級≤Ⅰ級。這與文獻(xiàn)報道[19]相仿。結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-海螵蛸復(fù)合支架符合肌肉植入試驗結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)，具有較好的組織相容性。

表6 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-海螵蛸復(fù)合支架(實驗組)和海螵蛸支架(對照組)植入兔肌肉后不同時相點對肝功能、腎功能的影響(n=5，±s)

注：各指標(biāo)內(nèi)，*與對照組同時相點值相比較,P<0.05。

Note:*compared with the control group at the same phase point,P<0.05.

圖4 不同植入時間病理檢測(20×)。(a)第1周復(fù)合支架組；(b)第1周海螵蛸支架組；(c)第2周復(fù)合支架組；(d)第2周海螵蛸支架組；(e)第4周復(fù)合支架組；(f)第4周海螵蛸支架組；(g)第8周復(fù)合支架組；(h)第8周海螵蛸支架組Fig.4 Pathological detection of different implantation time(20×).(a)Composite scaffold group for first week；(b)Cuttlebone group for first week；(c)Composite scaffold group for second week；(d)Cuttlebone group for second week；(e)Composite scaffold group for the fourth week；(f)Cuttlebone group for the fourth week；(g)Composite scaffold group for the eighth week；(h)Cuttlebone group for the eighth week

3 討論

骨組織工程的出現(xiàn)為骨缺損的修復(fù)提供了新思路，它主要分為3個基本階段：自體或異體分離、提取、擴(kuò)增靶細(xì)胞；將細(xì)胞接種于適合的支架上，形成細(xì)胞/支架復(fù)合物(CSC)；將CSC植入動物試驗靶部位，進(jìn)行相關(guān)處理，最終修復(fù)缺損。整個過程主要包含3個主要因素：起支架作用的載體材料、引導(dǎo)組織構(gòu)建分化的種子細(xì)胞，以及組織形成過程中在各機(jī)制系統(tǒng)間起聯(lián)絡(luò)傳遞作用的信號分子。

載體支架材料的選擇對骨組織再生與構(gòu)建至關(guān)重要，本實驗選擇中藥海螵蛸作為支架材料主要從以下幾方面考慮：

1)結(jié)合國情，創(chuàng)新思路，挖掘中藥新用法。海螵蛸是海洋生物烏賊的內(nèi)殼，性微溫，味咸、澀，具有收澀、止血、固精、斂瘡的作用，歸于肝腎二經(jīng)，“肝在體合筋，腎在體主骨”，肝血充盈能濡養(yǎng)筋骨，腎精充足能主骨生髓。中藥海螵蛸的補(bǔ)益肝腎作用，對骨質(zhì)的生長有推動和促進(jìn)作用。

2)立足于文獻(xiàn)，有前期實驗基礎(chǔ)。本課題組以往就曾對兔自體骨髓移植、海螵蛸及玻璃酸鈉聯(lián)合治療骨缺損的作用做過相關(guān)試驗研究，并取得了較好的效果。因此，綜合前人實驗成果，選用海螵蛸作為組織工程支架修復(fù)骨缺損，具有一定的可行性。

3)海螵蛸含有多樣成分，具有較高的研究價值。海螵蛸(cuttlebone)[20]中含有碳酸鈣、殼角質(zhì)、黏液質(zhì)、磷酸鈣、氯化鈉和10多種無機(jī)元素，以及17種氨基酸[21]，同時還含有作為支架材料相當(dāng)重要的元素——甲殼素[22]。甲殼素是源于動物的天然多糖，是一種能完全降解的生物材料，臨床上也可作為可吸收手術(shù)縫合線的原料。由此可見，海螵蛸具有較良好的可吸收降解性能。

4)結(jié)構(gòu)適宜，孔隙發(fā)達(dá)。海螵蛸支架內(nèi)部具有相互連通的多孔隙結(jié)構(gòu)，是促進(jìn)新骨形成的重要條件。本實驗測得，海螵蛸的孔隙率為81.730%±6.770%。根據(jù)研究報道，載體材料孔隙率需達(dá)到80%以上，才利于細(xì)胞的爬行黏附[17]，才利于骨組織的形成及新生組織的爬行替代。

在生物學(xué)評估方面，BMSCs-海螵蛸復(fù)合支架的各項生物學(xué)指標(biāo)均符合應(yīng)用要求。肌肉植入試驗顯示，兩組新西蘭白兔的血常規(guī)、肝功能、腎功能檢查在8周試驗期內(nèi)均逐漸達(dá)到正常參考值，且兩組間的檢測結(jié)果大部分未見明顯差異(P>0.05)。病理學(xué)檢查顯示，隨著時間延長,材料周圍肌肉組織的炎癥反應(yīng)逐漸減輕,組織結(jié)構(gòu)逐步恢復(fù)正常,符合肌肉植入試驗結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn),顯示BMSCs-海螵蛸復(fù)合支架具有良好的組織相容性，符合生物組織工程支架應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

綜合上述實驗及檢測，可以得出以下結(jié)論：自體BMSCs能與中藥海螵蛸聯(lián)合培養(yǎng)構(gòu)建復(fù)合支架,且此復(fù)合物組織相容性良好，符合生物材料應(yīng)用要求，在骨組織工程修復(fù)骨缺損方面具有較大的研究價值和廣闊的應(yīng)用前景。

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Safety Assessment of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells-Cuttlebone Composite Scaffold

Peng Ya1Qin Yu1Gu Chunsong2Yi Hongcheng2

1(GuizhouProvinceOsteologicalHospital,Guiyang550002,China)2(TheSecondAffiliatedHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,China)

This study is aimed to conduct fabrication and safety evaluation for the rabbit BMSCs-Cuttlebone composite scaffold. BMSCs were separated by density gradient centrifugation and adherence screening method. The BMSCs-Cuttlebone scaffold was cultivated by precipitation method. The composite scaffold was examined by SEM observation and cell viability assay (MTT test). The biological safety of the composite scaffold was evaluated through muscle implantation test. A total of 40 New Zealand rabbit were randomly divided into two groups, and then BMSCs-cuttlebone scaffold (experimental group) or cuttlebone (control group) were implanted. BMSCs of CD29 positive were obtained by the method of density gradient centrifugation effectively. Scanning electron microscope observation showed that the porosity of cuttlefish bone scaffold was 81.730%±6.770%. The cells adhered on the cuttlebone bracket creeping growth and secreted extracellular matrix. Results obtained from MTT assay showed that the number of viable cells on scaffold increased over time. On the day 1, 3, 5, 7 of cultivation, the cells kept proliferating; while on the day 7 and 8, the proliferation decreased and almost stopped on the day 8. Muscle implantation test showed no significant difference existed between the composite scaffold (experimental group) and cuttlebone group (control group) in the blood routine and blood biochemical tests. In the pathological observation, on the day 7, tissue inflammation grade III-IV for both experimental group and control group; on theday 14, the tissue inflammation grade was II-III for the two groups; on the day28, the tissue inflammation was I-II for the two groups; on the day 56, the tissue inflammation was 0-I grade for the two groups; all of which were within the limit of standard. The rabbit BMSCs could be co-cultured with cuttlebone to build complex biological scaffold. The cells embedded in the scaffold kept proliferation for 7 days. The composite scaffold exhibited good biocompatibility in the muscle implantation test.

rabbit bone marrow mesenchymalstem cells;cuttlebone; composite scaffold;biologicalsafety assessment;bone tissue engineering

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 05.007

2015-11-30， 錄用日期:2016-07-18

貴陽市科技局2013社會發(fā)展與民生科技計劃(2013103-40);貴州省教育廳自然科學(xué)研究項目(黔教育KY發(fā)(2012)040號)

R318

A

0258-8021(2016) 05-0555-07

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: yihongcheng223@sina.com