生物膜法應(yīng)用于濕地恢復(fù)監(jiān)測的適用性研究

摘要：生物膜法是理想的群落水平水生態(tài)監(jiān)測的方法，能夠全面反映濕地恢復(fù)前后生態(tài)健康水平，生物膜法具有重要的研究意義和應(yīng)用前景。以四川省邛海濕地五期恢復(fù)工程為研究對象，綜合運用原位生物膜法、群落分析法和生理生態(tài)學(xué)方法，通過比較五期濕地恢復(fù)工程建設(shè)前、建設(shè)期和恢復(fù)期的生物膜結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)的變化，分析生物膜對濕地恢復(fù)工程不同時期的響應(yīng)情況。結(jié)果表明，濕地恢復(fù)工程施工對生物膜的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生顯著影響，其中對藻類結(jié)構(gòu)和細(xì)菌胞外酶活性影響最大?；谒治龅母黜椫笜?biāo)，天然基質(zhì)生物膜對濕地恢復(fù)具有很好的響應(yīng)，生物膜法適用于濕地恢復(fù)的生態(tài)監(jiān)測，可進(jìn)一步建立評價方法并推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：生物膜；濕地恢復(fù)；生態(tài)監(jiān)測

中圖分類號： Q948；X17文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0506-05

濕地是界于水域和陸地之間的具有一定生態(tài)功能的交錯地帶[1]。它在為人類提供生產(chǎn)、生活等各種資源的同時也發(fā)揮著調(diào)節(jié)徑流、降解污染、調(diào)節(jié)氣候等環(huán)境生態(tài)作用，被譽(yù)為“地球之腎”。然而，隨著人類社會的不斷發(fā)展及氣候變化等自然因素，濕地面臨著不斷退化的威脅。因此，為緩解濕地與人類發(fā)展需求之間的矛盾，人工恢復(fù)濕地逐步成為濕地保護(hù)和利用的重要補(bǔ)償性辦法，并引起社會各界人士的廣泛關(guān)注[2]。而對濕地恢復(fù)過程的跟蹤監(jiān)測對于科學(xué)恢復(fù)濕地、管理濕地以及客觀評價濕地恢復(fù)效果等工作具有重要意義[3]。

濕地恢復(fù)監(jiān)測的方法和指標(biāo)，主要集中于對濕地水文、水環(huán)境、濕地土壤、氣象及濕地生物的監(jiān)測[3-5]，而常用的濕地恢復(fù)效果評價方法包括能值分析法、濕地生態(tài)系統(tǒng)健康評價法以及景觀格局分析法[6-7]。但通過對濕地的植被、水鳥等動植物的生物監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，因生境破碎化嚴(yán)重、水生生物大量滅絕、調(diào)水等問題為生物監(jiān)測帶來困難，傳統(tǒng)的生物監(jiān)測已不能滿足其生態(tài)監(jiān)測的需求[8]。而生物膜普遍存在于各種基質(zhì)的表面上[9]，代表了一種穩(wěn)定微生物細(xì)胞組成的復(fù)雜混合物的微生態(tài)系統(tǒng)，對水質(zhì)、水量、土地利用類型等環(huán)境壓力會產(chǎn)生響應(yīng)[10-11]，因而生物膜法是理想的群落水平水生態(tài)監(jiān)測的方法[12]。

邛海位于四川省涼山彝族自治州西昌市東南面，距城區(qū)僅4.5 km，是非常特殊的城郊型濕地。本次選取對原農(nóng)田濕地進(jìn)行了全方位改造的五期濕地恢復(fù)工程為研究對象，通過分析生物膜結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)的變化，來研究生物膜對濕地恢復(fù)工程不同時期的響應(yīng)情況，以期為生物膜監(jiān)測應(yīng)用于濕地恢復(fù)評價中提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1研究區(qū)概況

邛海位于四川省西昌市，流域面積307.67 km2，系四川省第二大淡水湖泊。20世紀(jì)中后期以來，填海造田、圍海造塘、泥沙淤積、氣候變暖等各種人為、自然因素使邛海的蓄水面積由31 km2減少至27 km2，邛海的濕地生態(tài)功能受到嚴(yán)重破壞，水質(zhì)惡化嚴(yán)重。為了控制濕地的不斷退化，充分發(fā)揮濕地的生態(tài)環(huán)境功能，從2009年開始，西昌啟動總面積約為 1 333 km2，依據(jù)各自特色分六期規(guī)劃完成的邛海生態(tài)保護(hù)與濕地恢復(fù)工程建設(shè)。本次研究點“夢回田園”五期濕地于2014年5月正式開工建設(shè)，2014年12月22日竣工開園，建有5個以“河”為主題的自然生態(tài)區(qū)域，該期濕地通過恢復(fù)臨水天然濕地，改造和保留農(nóng)用土地來達(dá)到其目的。

1.2生物膜的采集

本研究分別于2014年4月（建設(shè)前）、6月、8月、10月、12月（建設(shè)期）及2015年4月（恢復(fù)期）在邛海五期濕地恢復(fù)區(qū)（S1）進(jìn)行樣品采集，并選取已完工5年的邛海一期濕地（S2）作為參照點。各濕地沿湖岸設(shè)3個采樣點，每個采樣點隨機(jī)選取2處間隔50 m以上的石頭進(jìn)行采樣，所采集的生物膜用0.2 μm濾膜過濾后的樣點水懸浮，一份加入5%甲醛固定，用于藻組成識別分析；所有樣品用冰盒保存帶回實驗室用于分析其生物量、酶活性指標(biāo)的變化。

1.3生物膜各指標(biāo)的分析

生物膜各指標(biāo)分析方法參照前期相關(guān)研究中的方法[8，13]，實驗室測定生物膜的葉綠素含量（葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c）、無灰干質(zhì)量（AFDM）、藻類組成、磷酸酶（APA）活性、胞外聚合物多糖（PSC）含量。

1.4水樣采集與理化指標(biāo)測定

同步采集水樣，保存以及測定參照《水和廢水監(jiān)測分析方法（第4版）》，現(xiàn)場測定pH值、溫度（T）、透明度（Trans）、溶解氧（DO），實驗室測定氨氮（NH3-N）、總氮（TN）、總磷（TP）、化學(xué)需氧量（COD）、高錳酸鹽指數(shù)（CODMn）、生化需氧量（BOD5）、氟化物（F-）等指標(biāo)，并使用葉綠素a、TN、TP、Trans、CODMn等5項指標(biāo)計算綜合營養(yǎng)指數(shù)（TSI）。

2結(jié)果與分析

2.1生物量

對邛海五期濕地恢復(fù)區(qū)（S1）不同時期的生物膜葉綠素a進(jìn)行比較（圖1），可見建設(shè)期和恢復(fù)期的葉綠素a濃度顯著低于建設(shè)前。參照對照點邛海一期濕地（S2）進(jìn)行分析，恢復(fù)工程開始后（6—8月）邛海五期濕地恢復(fù)區(qū)（S1）的生物膜葉綠素a濃度顯著下降，而同時段的參照點受季節(jié)影響葉綠素濃度有顯著的升高（P<0.05），說明恢復(fù)工程的建設(shè)顯著影響了藻類的生長。在建設(shè)期中葉綠素a濃度在10月較8月有所回升，該時段工程破壞較小并開始植被恢復(fù)，因而藻類生長脅迫壓力減小?；謴?fù)期較建設(shè)前同時段（4月）的葉綠素a濃度顯著降低，反映了濕地恢復(fù)后環(huán)境發(fā)生了改變。綜上說明生物膜葉綠素a濃度受濕地工程建設(shè)影響，工程建設(shè)導(dǎo)致原有植被等被破壞，葉綠素a濃度顯著降低，濕地植被恢復(fù)后葉綠素a濃度有所升高。

由圖2可見，濕地恢復(fù)區(qū)生物膜的無灰干質(zhì)量（AFDW）與參照點在建設(shè)前、建設(shè)期的變化規(guī)律相似，但對應(yīng)葉綠素a濃度在6月、8月減少，說明此段時間內(nèi)無灰干質(zhì)量主要積累為無機(jī)物，可能受工程建設(shè)水土流失的影響所致?；謴?fù)期的無灰干質(zhì)量與建設(shè)后期（10月、12月）差異不顯著（P>005），并顯著低于建設(shè)前，說明工程建設(shè)影響仍然存在，生物膜群落尚未完全恢復(fù)。

天然生物膜經(jīng)過長期的培養(yǎng)和演替，具有更加成熟的結(jié)構(gòu)組成和更大的生物量，有研究表明自養(yǎng)指數(shù)可以反映水體污染程度[14]，因此計算生物膜群落的自養(yǎng)指數(shù)進(jìn)行比較公式（1）。

式中：AI為自養(yǎng)指數(shù)；AFDM為無灰干質(zhì)量；chla為葉綠素a濃度。

由圖3可見，生物膜的自養(yǎng)指數(shù)在建設(shè)期初（6月）較建設(shè)前顯著增加（P<0.05），但同時期參照點無顯著差異（P<

0.05），表明建設(shè)工程的開始對水環(huán)境造成較大的污染。但建設(shè)期中10月出現(xiàn)了顯著下降（P<0.05），同時期參照點卻有所上升，說明10月工程措施的停止和植被的恢復(fù)對水環(huán)境有較大影響。綜上可見自養(yǎng)指數(shù)對于濕地工程不同建設(shè)時期有明顯的響應(yīng)。

2.2藻類結(jié)構(gòu)

由圖4可見，其中濕地恢復(fù)區(qū)（S1）不同時期的硅藻比例差異顯著（P<0.05），其中建設(shè)期較建設(shè)前的硅藻比例出現(xiàn)極顯著下降（P<0.01），而綠藻比例在建設(shè)開始初期出現(xiàn)了顯著升高（P<0.05），而同時期參照點邛海公園生物中的綠藻比例變化不顯著（P<0.05），這說明生物膜藻類結(jié)構(gòu)的變化明顯受到濕地建設(shè)工程的影響，其中硅藻、綠藻對建設(shè)工程的響應(yīng)最明顯。恢復(fù)期的生物膜藻類以硅藻為主，較建設(shè)前和建設(shè)期的硅藻比例都有所升高，說明該時期的水環(huán)境情況較好。

色素比例可以一定程度上反映藻類組成，且測定方法簡單，節(jié)約時間[15]，由圖5可見葉綠素b濃度變化規(guī)律與參照點相似，說明受濕地恢復(fù)工程影響較小。而葉綠素c濃度在建設(shè)期波動較大，且恢復(fù)期顯著高于建設(shè)前，這樣藻類結(jié)構(gòu)中硅藻的變化規(guī)律一致。說明了硅藻、葉綠素c濃度對濕地恢復(fù)工程的響應(yīng)最顯著。

2.3胞外聚合物多糖含量

胞外聚合物（EPS）的多糖（PSC）含量的測定結(jié)果（圖6）表明，濕地恢復(fù)區(qū)（S1）建設(shè)期6—8月較建設(shè)前多糖含量顯著增加，但同時期參照點增加極顯著（P<0.01），說明生物膜微生物分泌形成胞外聚合物的過程可能受到了建設(shè)工程的影響；建設(shè)期12月較建設(shè)期10月多糖含量下降達(dá)最低值，為0.114±0.229 mg/cm2，但同時期參照點含量增加；恢復(fù)期核多糖含量較建設(shè)期顯著增加（P<0.05），說明多糖含量受濕地工程建設(shè)的影響，其中建造后期和恢復(fù)期影響較大。

2.4磷酸酶活性

由圖7可見，磷酸酶活性受濕地恢復(fù)工程的影響也較大。濕地恢復(fù)區(qū)（S1）的生物膜磷酸酶活性在建設(shè)期呈逐步下降趨勢，并在恢復(fù)期較前面的時期出現(xiàn)顯著升高（P<0.05），而同時期的參照點受季節(jié)影響呈先升高后下降的趨勢。說明生物膜胞外酶活性受工程建設(shè)影響下降，但在恢復(fù)期得到升高，微生物生長恢復(fù)。

2.5水質(zhì)因子測定結(jié)果

根據(jù)同期水質(zhì)監(jiān)測數(shù)據(jù)（表1）可以看出，邛海濕地的水質(zhì)狀況較好，全年月平均水質(zhì)均達(dá)到國家地表水Ⅰ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。其中受濕地恢復(fù)工程的影響，在2014年6月、8月的水體透明度（Trans）較低，且8月有機(jī)物污染較其他月份嚴(yán)重，COD、BOD5的最大值分別為15.33 mg/L和3.05 mg/L，均超過國家地表水Ⅱ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。濕地恢復(fù)后的2015年4月較恢復(fù)前水質(zhì)狀況更佳，水體綜合營養(yǎng)指數(shù)有所下降。

3討論

3.1生物膜群落對濕地恢復(fù)工程的響應(yīng)

生物膜可以對各種形式的干擾產(chǎn)生響應(yīng)，在野外環(huán)境中，生物膜會受到水文、氣候、捕食壓力、水質(zhì)狀況等各種干擾的影響。而濕地恢復(fù)工程在建設(shè)期會對植被造成破壞，產(chǎn)生大量水土流失并對水體產(chǎn)生污染，在恢復(fù)期逐步構(gòu)建新的生態(tài)景觀，這些因素都構(gòu)成了對生物膜群落的干擾。

生物膜的生物量指標(biāo)可以反映出生物因子、環(huán)境因子對群落的影響[13]。本研究中生物膜葉綠素a濃度、無灰干質(zhì)量在建設(shè)期均發(fā)生了改變。葉綠素a濃度在建設(shè)開始后出現(xiàn)顯著下降，可能是由于施工中挖掘?qū)λw的擾動及水土流失造成水體渾濁影響了藻類的生長。而恢復(fù)期的葉綠素濃度較建設(shè)前低，可能是由于濕地恢復(fù)改變了土地利用類型造成的影響，F(xiàn)indlay等對新西蘭河流的研究結(jié)果表明土地利用類型會對生物膜群落產(chǎn)生定性和定量的影響[16]。建設(shè)前該區(qū)域主要為農(nóng)田濕地，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)使用大量化肥，會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)顯著增加，進(jìn)而促進(jìn)生物膜生物量的生長，故生物量較恢復(fù)后高。

從結(jié)構(gòu)指標(biāo)上來看，生物膜藻類結(jié)構(gòu)的變化明顯受到濕地建設(shè)工程的影響，其中硅藻、綠藻對建設(shè)工程的響應(yīng)最明顯。建設(shè)期較建設(shè)前的硅藻比例出現(xiàn)極顯著下降（P<0.01），而綠藻比例在建設(shè)開始初期出現(xiàn)了顯著升高（P<0.05），而恢復(fù)期的生物膜藻類以硅藻為主，較建設(shè)前和建設(shè)期的硅藻比例都有所升高。其原因主要可能是濕地恢復(fù)工程影響了水體的透明度，進(jìn)而影響光照程度，生物膜在光照充分的情況下比較高，硅藻數(shù)目多。此外光照不僅會對生物膜組成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接的影響，還會通過影響其他環(huán)境因子進(jìn)而使得生物膜群落發(fā)生改變[17]。另一方面濕地恢復(fù)工程還會對水體的營養(yǎng)水平產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響藻類的生長，與其他藻類相比綠藻更適宜在中等營養(yǎng)狀態(tài)下生長，在高營養(yǎng)條件下綠藻生長受到藍(lán)藻的抑制，而隨著氮磷和有機(jī)污染物大量降低，不能滿足大多數(shù)綠藻的生長條件，因此綠藻比例在建設(shè)期中先升高后降低。不同的藻類含有不同的色素種類，其中，藍(lán)藻門只含葉綠素a，不含葉綠素b、葉綠素c；綠藻門含葉綠素a和葉綠素b；硅藻門、甲藻門、金藻門均含葉綠素a和葉綠素c[15]，因而葉綠素b、葉綠素c從色素水平上也反應(yīng)出了相同的藻類結(jié)構(gòu)變化。

胞外聚合物多糖含量和磷酸酶活性都與生物膜的細(xì)菌群落有密切關(guān)系。生物膜的微生物會分泌形成復(fù)雜的胞外聚合物（EPS），其中多糖占生物膜有機(jī)成分的50%～90%，因此多糖被認(rèn)為是胞外聚合物的標(biāo)志性成分。磷酸酶活性被認(rèn)為可以反映相應(yīng)環(huán)境中微生物可能進(jìn)行的聚合物的降級和代謝[8]。因此本研究中胞外聚合物多糖含量和磷酸酶活性變化，反映了由于濕地恢復(fù)而引起的細(xì)菌群落的變化。

綜上可見，生物膜群落可對濕地恢復(fù)工程的主要干擾產(chǎn)生不同程度的響應(yīng)，進(jìn)而可利用生物膜對濕地恢復(fù)工程進(jìn)行監(jiān)測評價。

3.2生物膜群落對水質(zhì)因子的響應(yīng)

由于邛海水體以營養(yǎng)元素和耗氧有機(jī)污染為主，因此選取包括pH值、T、Trans、COD、NH4-N、BOD5、DO、F-和TSI共9個水質(zhì)因子進(jìn)行RDA分析，以確定生物膜群落特征與各水質(zhì)因子的關(guān)系。由表2可見，水質(zhì)因子對生物膜群落具有顯著影響（P<0.05）。RDA分析的前2個排序軸特征值分別為0.407和0.344，共解釋了75.1%的生物膜群落特征變化。

從圖8可見，對于第1排序軸（Axis1），水質(zhì)因子中COD、BOD5與生物膜群落呈正相關(guān)，而pH、NH4-N、TSI與Axis1呈負(fù)相關(guān)，這些水質(zhì)因子都與營養(yǎng)狀況有關(guān)，說明該特征軸反映邛海濕地的水質(zhì)營養(yǎng)污染狀況。其中葉綠素a、藍(lán)藻比例（CYA）受pH、NH4-N、TSI的影響較大，磷酸酶活性（APA）、多糖含量（PSC）、葉綠素b、葉綠素c受有機(jī)物污染影響較大。葉綠素a、藻類組成在研究生物膜群落對水質(zhì)的響應(yīng)中被廣泛使用，在本研究中，葉綠素a濃度與水體營養(yǎng)指標(biāo)呈正相關(guān)關(guān)系，硅藻比例與水體營養(yǎng)指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與許多相關(guān)研究結(jié)果相同。第2排序軸（Axis2）與T、pH呈正相關(guān)，與Trans、DO、F-呈負(fù)相關(guān)，該特征軸主要反映邛海濕地的物理因子。在高透明度（Trans）的條件下硅藻比例（BAC）、其他藻類比例（Others）和葉綠素c/葉綠素a會相對較高，而綠藻比例（CHL）、AFDW和AI與受溫度影響顯著。其中溶解氧（DO）與生物膜群落特征的相關(guān)性較弱。生物膜群落可以對各種污染物質(zhì)產(chǎn)生響應(yīng)，而在天然水體中加上有光照、溫度、水力條件等因素的影響，使得生物膜群落的響應(yīng)并不遵從單因子情況時的規(guī)律，且與多種環(huán)境因素相關(guān)。在本研究中選定的水質(zhì)因子可以解釋生物膜群落變化的75.1%，說明生物膜群落能夠很好地響應(yīng)水質(zhì)因子的變化。

4結(jié)論

生物膜的結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)受濕地恢復(fù)工程的影響產(chǎn)生變化，其中葉綠素a濃度、硅藻比例和磷酸酶活性受建設(shè)影響出現(xiàn)顯著降低，其他指標(biāo)也有不同程度變化，可見濕地恢復(fù)工程對藻類結(jié)構(gòu)和細(xì)菌胞外酶活性影響最大，生物膜群落對于濕地恢復(fù)具有很好地響應(yīng)。RDA分析生物膜群落特征各指標(biāo)與水質(zhì)指標(biāo)顯著相關(guān)（P<0.05），生物膜群落能夠很好地響應(yīng)水質(zhì)因子的變化。綜上可見生物膜是濕地監(jiān)測評價的適宜工具，可進(jìn)一步篩選指標(biāo)建立評價體系，應(yīng)用到濕地恢復(fù)的監(jiān)測評價中。本研究僅對區(qū)域濕地恢復(fù)工程進(jìn)行了短期監(jiān)測分析，邛海濕地恢復(fù)工程巨大，目前六期工程已基本全部完工，可為其分階段長期通過生物膜法評價恢復(fù)效果提供依據(jù)。

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