口蹄疫病毒VP1蛋白可溶性表達(dá)標(biāo)簽篩選

舒靜超，李賽賽，申歡歡，郭豫杰(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

口蹄疫病毒VP1蛋白可溶性表達(dá)標(biāo)簽篩選

舒靜超，李賽賽，申歡歡，郭豫杰*
(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

為了提高口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表達(dá)，根據(jù)A型口蹄疫病毒核酸序列設(shè)計(jì)并合成了口蹄疫病毒VP1片段，將其克隆到pET21b(+)載體上，設(shè)計(jì)1對(duì)通用引物擴(kuò)增10個(gè)融合標(biāo)簽Grifin、GST、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB、MBP，并分別將擴(kuò)增的融合標(biāo)簽與VP1連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明，MBP、Grifin和GST能夠促進(jìn)口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表達(dá)，其中MBP與VP1融合表達(dá)蛋白可溶部分占60%；Western blot鑒定分析結(jié)果顯示，小鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體能識(shí)別表達(dá)的重組蛋白。表明成功表達(dá)了具有免疫學(xué)活性的融合蛋白MBP-VP1。

口蹄疫病毒； VP1蛋白； 可溶性； 融合標(biāo)簽

口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒引起的偶蹄動(dòng)物烈性接觸性傳染病，主要危害牛、羊、豬等，發(fā)病率極高，傳播速度極快，易造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為A類傳染病之首，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將其劃定為一類動(dòng)物傳染病[1]。口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)屬于小RNA病毒科(Picomaviridae)、口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，有7個(gè)血清型，包括A型、O型、C型、Asia l型、SAT 1型、SAT 2型和SAT 3型等血清型，其中O型、A型口蹄疫在世界范圍內(nèi)分布廣泛，近年來(lái)A型口蹄疫的流行范圍和暴發(fā)頻率呈現(xiàn)擴(kuò)大和增強(qiáng)的趨勢(shì)。目前已知的FMDV各型之間沒(méi)有交叉免疫保護(hù)性。根據(jù)國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室疫情監(jiān)測(cè)結(jié)果，我國(guó)目前主要流行O型和A型2個(gè)血清型，2013—2014年我國(guó)共報(bào)道發(fā)生A型疫情22次，疫情主要分布于廣東、新疆、西藏、青海、云南和江蘇等6個(gè)省(自治區(qū))[2]。

FMDV存在很強(qiáng)的變異性，7個(gè)血清型又分為60多個(gè)血清亞型[3]。FMDV含有單股正鏈RNA基因組，長(zhǎng)約8 300 nt，主要包括3部分：5′非翻譯區(qū)、開放閱讀框(ORF)和 3′非翻譯區(qū)。FMDV基因組無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，5′端共價(jià)連接有病毒自身編碼的VPg蛋白，3′端為poly(A)尾巴。ORF編碼的多聚蛋白依靠自身編碼的蛋白酶(L、2A、3C)及少數(shù)的宿主因子裂解為3～4種病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)和8～9種非結(jié)構(gòu)蛋白(Lab、Lb、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)[4]。其中，結(jié)構(gòu)蛋白VP1是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要抗原表位，暴露在病毒顆粒的表面，VP1上的B細(xì)胞表位是主要的保護(hù)性抗原位點(diǎn)，在其頂部形成高度保守的Arg-Gly-Asp序列，該序列是FMDV的細(xì)胞受體位點(diǎn)[5]。VP1上另1個(gè)抗原位點(diǎn)是輔助性 T 細(xì)胞表位，與B細(xì)胞表位形成一個(gè)非連續(xù)的形態(tài)表位，在免疫中起關(guān)鍵作用[6]。研究表明，從病毒衣殼蛋白分離的VP1可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)該表位的中和性抗體[7]。因此，研究者嘗試?yán)靡職さ鞍咨系目乖砦辉O(shè)計(jì)重組基因工程抗原以檢測(cè)和預(yù)防FMD[8]。鑒于VP1結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)研究FMDV的重要意義，筆者所在課題組以人工合成的方法將FMDV VP1上的主要抗原表位串聯(lián)起來(lái)，構(gòu)建VP1多抗原表位片段，大小為636 bp。為得到高效表達(dá)的FMDV可溶性VP1蛋白，將VP1基因與Grifin 、GST、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB、MBP 10種不同融合表達(dá)標(biāo)簽相連，研究不同融合標(biāo)簽對(duì)VP1蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)效率的影響，以篩選出提高VP1蛋白可溶性表達(dá)的融合標(biāo)簽，為進(jìn)一步研究FMDV及其基因工程疫苗提供試驗(yàn)材料。

1 材料和方法

1.1 載體

含VP1多抗原表位基因載體pET21b-VP1由寶生物(大連)公司合成構(gòu)建；含有10種融合標(biāo)簽的pEX系列載體由本實(shí)驗(yàn)室保存，載體質(zhì)粒信息見表1。

表1 載體信息

1.2 試劑

DNA Marker DL2000、DL5000購(gòu)自寶生物(大連)公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、NheⅠ購(gòu)自Thermo Scientific公司；IPTG、質(zhì)粒切膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Tryptone、Yeast Extract、Agar power購(gòu)自O(shè)XIOD公司；Prestained Protein MarkerⅠ、Agarose購(gòu)自GENVIEW公司；四甲基乙二胺(TEMED)、2×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液購(gòu)自鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 含融合標(biāo)簽的T載體構(gòu)建 設(shè)計(jì)1對(duì)通用引物，上游引物為 F：5′-CTAGCTAGCTCTCACCATCACCATCACCATG-3′(下劃線部分為NheⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物為R：5′-CGGGATCCGGATTGGAAGTACAGGTTTTC-3′(下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn))，以上述10個(gè)pEX載體為模板分別擴(kuò)增融合標(biāo)簽片段。 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收后連接至pMD19-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌液涂布于LB(含Amp)固體平板，37 ℃培養(yǎng)12 h，使用上述通用引物進(jìn)行PCR鑒定，將初步鑒定為陽(yáng)性的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序鑒定。

1.3.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將測(cè)序正確的10個(gè)重組融合標(biāo)簽pMD19-T載體及pET21b-VP1質(zhì)粒用NheⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，回收相應(yīng)目的片段，使用T4 DNA連接酶把回收的10個(gè)融合標(biāo)簽片段分別與雙酶切后的pET21b-VP1質(zhì)粒連接,分別命名為pET-2—9、pET-16、pET-21。同樣方法連接產(chǎn)物分別經(jīng)轉(zhuǎn)化和單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，將經(jīng)PCR鑒定融合標(biāo)簽與pET21b-VP1質(zhì)粒成功連接的陽(yáng)性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序鑒定。

1.3.3 VP1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的10個(gè)pET重組質(zhì)粒和pET21b-VP1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)，經(jīng)轉(zhuǎn)化擴(kuò)大培養(yǎng)后通過(guò)PCR-PEF-21篩選陽(yáng)性克隆菌液。將10個(gè)pET重組質(zhì)粒和pET21b-VP1質(zhì)粒的陽(yáng)性菌液按1︰100的比例接種到50 mL LB(含100 mg/L的Amp)液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600=0.6 ～0.8時(shí)，加入IPTG至0.5 mmol/L。18 ℃、160 r/min誘導(dǎo)12 h后離心收集菌體，5 mL PBS溶液重懸，超聲波破碎(功率160 W，工作4 s，間歇8 s，持續(xù)25 min)，用12%分離膠和5%濃縮膠SDS-PAGE電泳檢測(cè)未誘導(dǎo)全菌、誘導(dǎo)后全菌、破碎后上清和沉淀中蛋白質(zhì)的表達(dá)。1.3.4 融合標(biāo)簽的篩選及鑒定 10組重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色并脫色,對(duì)比誘導(dǎo)后全菌中目的蛋白的表達(dá)量來(lái)篩選能夠提高目的蛋白表達(dá)量的融合標(biāo)簽，并比較上清中目的蛋白量篩選出能夠促進(jìn)FMDV VP1蛋白可溶性表達(dá)的融合標(biāo)簽。

取可溶性表達(dá)較好的VP1蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，初步檢測(cè)蛋白質(zhì)是否正確翻譯。取處理好的誘導(dǎo)后全菌和上清先進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，再將膜在室溫用含5%脫脂奶粉的TBST封閉40 min，隨后加入1∶3 000鼠抗6×His單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜后TBST洗膜3次，再加入1∶5 000 HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，作用60 min后TBST洗膜3次，最后用ECL試劑曝光顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 含融合標(biāo)簽的T載體構(gòu)建結(jié)果

融合標(biāo)簽PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖1)，分別在502、739、1 194、1 570、385、412、256、619、508、583 bp出現(xiàn)目的條帶，與pMD19-T載體連接后測(cè)序與預(yù)期片段大小和序列一致，表明融合標(biāo)簽與pMD19-T載體連接成功。

M：DL2000 Marker； 1—10：分別為Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB標(biāo)簽PCR產(chǎn)物圖1 融合標(biāo)簽PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果

含融合標(biāo)簽pMD19-T載體的雙酶切結(jié)果(圖2)顯示，Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB分別在502、739、1 194、1 570、385、412、256、619、508、583 bp處有相應(yīng)的融合標(biāo)簽片段，2 692 bp的片段為pMD19-T載體片段；載體pET21b-VP1雙酶切結(jié)果顯示(圖3)，在6 068 bp處有含VP1的載體片段。

M1：DL2000 Marker； M2：DL5000 Marker； 1—10：分別為MBP、NusA、SUMO、ProteinG、γ-crystallin的pMD19-T載體雙酶切(2個(gè)重復(fù));11—15：分別為Grifin、GST、Thioredoxin、ArsC、PpiB的pMD19-T載體雙酶切圖2 融合標(biāo)簽載體雙酶切結(jié)果

重組表達(dá)載體菌液PCR結(jié)果顯示(圖4)，10個(gè)重組質(zhì)粒均出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序比對(duì)完全正確，說(shuō)明融合標(biāo)簽和VP1的重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M：DL5000 Marker； 1—2：pET21b-VP1雙酶切圖3 pET21b-VP1雙酶切結(jié)果

M：DL2000 Marker； 1—10：分別為10個(gè)pET重組質(zhì)粒Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB標(biāo)簽的PCR結(jié)果圖4 重組質(zhì)粒菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 VP1重組蛋白表達(dá)鑒定

從圖5可以看出，對(duì)照組pET21b-VP1目的蛋白在28 ku的位置有目的條帶；Thioredoxin、ProteinG、ArsC 與VP1的重組載體未能表達(dá)目的蛋白；Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、γ-crystallin、PpiB與VP1融合表達(dá)之后分別在43、52、69、82.5、39、48、46 ku的位置有目的條帶，箭頭所指即為帶VP1的融合蛋白條帶。

pET21b-VP1 以及VP1與Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、γ-crystallin、PpiB等標(biāo)簽的融合表達(dá)結(jié)果; UN為未誘導(dǎo)菌體； IN為誘導(dǎo)后菌體；S為菌體超聲破碎后上清； IB為包涵體； M為Prestained Protein MarkerⅠ圖5 VP1重組蛋白SDS-PAGE分析

2.4 融合標(biāo)簽的篩選及鑒定結(jié)果

由圖5可知，pET21b-VP1目的蛋白主要表達(dá)在沉淀中，為包涵體表達(dá)，溶解度很低；Thioredoxin、ProteinG、ArsC 與VP1的重組載體雖然構(gòu)建成功，但誘導(dǎo)后沒(méi)有表達(dá)出融合蛋白；SUMO融合蛋白少量表達(dá)且在上清中，即SUMO標(biāo)簽可促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)，但表達(dá)量低；NusA、γ-crystallin、PpiB融合蛋白表達(dá)量很高，以不溶的包涵體為主，上清中目的蛋白很少，提示這些標(biāo)簽?zāi)芴岣吣康牡鞍妆磉_(dá)量，但未提高重組蛋白的可溶性；與原質(zhì)粒pET21b-VP1蛋白表達(dá)相比，Grifin、GST、MBP標(biāo)簽不僅提高融合蛋白表達(dá)量，且上清中重組蛋白比例明顯提高，表明Grifin、GST、MBP標(biāo)簽?zāi)艽龠M(jìn)VP1蛋白的可溶性表達(dá)。經(jīng)灰度分析軟件分析，10種融合標(biāo)簽中MBP標(biāo)簽表達(dá)的VP1蛋白可溶部分占60%，明顯促進(jìn)VP1可溶性表達(dá)。

取pET-4(MBP)誘導(dǎo)后全菌及上清進(jìn)行Western blot鑒定，在69 ku位置有陽(yáng)性條帶，即pET-4(MBP)重組表達(dá)蛋白與6×His的抗體特異性結(jié)合，證實(shí)該蛋白為MBP-VP1融合蛋白(圖6)。

M：Prestained Protein Marker Ⅰ； 1.pET-4(MBP)誘導(dǎo)后全菌； 2.pET-4(MBP)上清圖6 VP1重組蛋白 Western blot結(jié)果

3 結(jié)論與討論

口蹄疫重組蛋白亞單位疫苗作為新型基因工程疫苗正在受到越來(lái)越高的重視[9-10]，亞單位疫苗由于只含病毒衣殼蛋白不含核酸，不僅在體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫方面具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，而且具有很高的安全性。VP1片段是FMDV的主要抗原位點(diǎn)，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體。大腸桿菌、酵母、桿狀病毒和痘病毒等都能被用作表達(dá)目的蛋白的載體，其中大腸桿菌以其自身優(yōu)點(diǎn)經(jīng)常被用作宿主菌。Kleid等[12]首次在大腸桿菌中成功表達(dá)FMDV A12株VP1重組蛋白抗原，該重組蛋白抗原能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，免疫動(dòng)物后能抵御同源病毒的攻擊，不僅證明了VP1蛋白是FMDV重要的保護(hù)性抗原之一，也為研制重組亞單位口蹄疫表位疫苗提供了理論依據(jù)。

普通外源基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌之后一般為包涵體表達(dá)，包涵體對(duì)于蛋白質(zhì)的進(jìn)一步應(yīng)用是不利的[13]。研究者采用了很多的方法來(lái)提高蛋白質(zhì)的可溶性，比如降低誘導(dǎo)的溫度[14]、改變宿主菌[15]、改變啟動(dòng)子、改變誘導(dǎo)的條件[16]、采用分子伴侶和折疊調(diào)節(jié)因子的共表達(dá)[17]。然而，在很多情況下，改變以上這些條件也無(wú)法解決在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)蛋白形成包涵體[18]。蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)有3個(gè)重要因素：溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)劑濃度，溫度太高易形成包涵體，IPTG本身對(duì)細(xì)菌有毒性，所以濃度不宜太高。目前，蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化已不再是技術(shù)難題，但重組蛋白的可溶性表達(dá)依然是個(gè)瓶頸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不可溶有2個(gè)主要因素，1個(gè)是蛋白質(zhì)翻譯的速率，另1個(gè)是蛋白質(zhì)折疊的速率[19]。Costa等[20]曾在研究中使用ubiquitin、SUMO、MBP、GST、Thioredoxin和NusA 6種融合標(biāo)簽對(duì)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶13和生長(zhǎng)分化因子8等公認(rèn)的難溶蛋白的可溶性表達(dá)進(jìn)行對(duì)比，得出不同的融合標(biāo)簽對(duì)不同蛋白質(zhì)的促可溶效果不同，其中，SUMO 和NusA提高重組蛋白的表達(dá)水平和溶解度最為明顯。Miroux等[14]發(fā)現(xiàn)，Grifin、GST、NusA、MBP等常用融合標(biāo)簽可以提高重組蛋白的溶解度。為了篩選提高FMDV蛋白可溶性表達(dá)的融合標(biāo)簽，本研究將目的基因與Grifin、GST、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB、MBP等10種融合標(biāo)簽連接，在18 ℃條件下，經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12 h，研究10種融合標(biāo)簽對(duì)FMDV蛋白VP1在大腸桿菌中的表達(dá)量和可溶性表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)SUMO標(biāo)簽融合蛋白溶解度高，但表達(dá)量很低；NusA、γ-crystallin、PpiB標(biāo)簽促進(jìn)蛋白質(zhì)高表達(dá)，但可溶性表達(dá)不高；Thioredoxin、ArsC 和ProteinG未能誘導(dǎo)出重組蛋白；MBP、Grifin和GST標(biāo)簽不僅能提高FMDV蛋白的表達(dá)量，又能促進(jìn)其可溶性表達(dá)。綜合表達(dá)量和可溶性兩方面的結(jié)果，MBP標(biāo)簽提高重組蛋白表達(dá)量和溶解度效果最好，Western blot結(jié)果顯示，誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)為帶6×His的目的蛋白。本研究通過(guò)在融合部位的N端放置TEV標(biāo)簽，作為蛋白質(zhì)酶切割位點(diǎn)[22]，在獲得高純度蛋白質(zhì)后，便于從N端進(jìn)行切割來(lái)獲得不帶融合標(biāo)簽的口蹄疫VP1蛋白，為后續(xù)口蹄疫VP1蛋白及口蹄疫亞單位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

本研究中構(gòu)建的10個(gè)原核表達(dá)載體以及FMDV VP1蛋白的可溶性表達(dá)，不僅有利于目的蛋白的純化，為其生物學(xué)功能和A型口蹄疫亞單位疫苗研究提供試驗(yàn)材料，也為融合標(biāo)簽的研究提供參考。

[1] Domingo E,Baranowski E,Escarmis C,etal.Foot-and-mouth disease virus[J].Comp Immun Microbiol Infect Dis,2002, 25(5/6):297-308.

[2] 何繼軍,郭建宏,劉湘濤.我國(guó)口蹄疫流行現(xiàn)狀與控制策略[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2015(6):10-14.

[3] 殷震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997:395-413.

[4] Sobrino F.Foot and mouth disease:Current perspectives[M].Horizon Bioscience,2004:19-76.

[5] 張顯升,劉在新,趙啟祖.口蹄疫病毒基因組RNA結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].病毒學(xué)報(bào),2001,17(4):375-380.

[6] 柳紀(jì)省.口蹄疫研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,1999(3):17-22.

[7] Golde W T,Nfon C K,Toka F N.Immune evasion during foot-and-mouth disease virus infection of swine[J].Immunol Rev,2008,225:85-95.

[8] He D M,Qian K X,Shen G F,etal.Stable expression of foot-and-mouth disease virus protein VP1 fused with cholera toxin B subunit in the potato (Solanumtuberosum)[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2007,55(2):159-163.

[9] Chan E W,Wong H T,Cheng S C,etal.An immunoglobulin G based chimeric protein induced foot-and-mouth disease specific immune response in swine[J].Vaccine,2000,19(4/5):538-546.

[10] Zhang Y L,Guo Y J,Wang K Y,etal.Enhanced immunogenicity of modified hepatitis B virus core particle fused with multiepitopes of foot-and-mouth disease virus[J].Scandinavian Journal of Immunology,2007,65(4):320-328.

[11] Kleid D G,Yansura D,Small B,etal.Cloned viral protein vaccine for foot-and-mouth disease:Responses in cattle and swine[J].Science,1981,214(4525):1125-1129.

[12] 朱紅裕,李強(qiáng).外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)策略[J].過(guò)程工程學(xué)報(bào),2006,6(1):150-155.

[13] Hammarstrom M,Hellgren N,van Den Berg S,etal.Rapid screening for improved solubility of small human proteins produced as fusion proteins inEscherichiacoli[J].Protein Sci,2002,11(2):313-321.

[14] Miroux B,Walker J E.Over-production of proteins inEscherichiacoli:Mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels[J].Journal of Molecular Biology,1996,260(3):289-298.

[15] Qing G,Ma L C,Khorchid A,etal.Cold-shock induced high-yield protein production inEscherichiacoli[J].Nature Biotechnology,2004,22(7):877-882.

[16] de Marco A,De Marco V.Bacteria co-transformed with recombinant proteins and chaperones cloned in independent plasmids are suitable for expression tuning[J].Journal of Biotechnology,2004,109 (1/2):45-52.

[17] Chayen N E.Turning protein crystallisation from an art into a science[J].Current Opinion in Structural Biology,2004,14(5):577-583.

[18] Widmann M,Christen P.Comparison of folding rates of homologous prokaryotic and eukaryotic proteins[J].The Journal of Biological Chemistry,2000,275(25):18619-18622.

[19] Marblestone J G,Edavettal S C,Lim Y,etal.Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems:Enhanced expression and solubility with SUMO[J].Protein Science,2006,15(1):182-189.

[20] Costa S,Almeida A,Castro A,etal.Fusion tags for protein solubility,purification,and immunogenicity inEscherichiacoli:The novel Fh8 system[J].Front Microbiol,2014,5:63.

Screening of Fusion Tags that Enhanced Expression and Solubility of Type A Foot-and-mouth Disease Virus VP1 Protein

SHU Jingchao,LI Saisai,SHEN Huanhuan,GUO Yujie*
(Key Laboratory of Animal Biochemistry and Nutrition of Ministry of Agriculture/Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

In order to improve the soluble expression of FMDV VP1 protein,FMDVVP1 gene fragment was designed and synthesized according to the nucleic acid sequence of type A FMDV,and was cloned into the vector pET21b (+).A pair of universal primers and ten fusion tags(Grifin,GST,NusA,SUMO,Thioredoxin,ProteinG,γ-crystallin,ArsC,PpiB,MBP)were recombinanted with VP1 respectively,and then they were transformed intoE.coliBL21(DE3) and induced by 0.5 mmol/L IPTG,respectively.The results of SDS-PAGE showed that MBP,Griffin and GST increased the solubility of the FMDV VP1 protein,which worked best with MBP,and the proportion of soluble cellular lysate was 60%.Western blot analysis showed that the recombinant protein could be recognized by mouse anti-his tag monoclonal antibody.It indicated that the fusion protein MBP-VP1 with immunological activity was successfully expressed.

FMDV; VP1 protein; solubility; fusion tags

2016-02-10

農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)(2014ZX0801015B)

舒靜超(1990-)，男，河南安陽(yáng)人，在讀碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)生物技術(shù)。E-mail:shujch1995@163.com

*通訊作者：郭豫杰(1978-)，女，河南商丘人，講師，博士，主要從事生物化學(xué)研究。E-mail:cngyuj@163.com

S855.3

A

1004-3268(2016)09-0114-06