高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定板栗中58種農(nóng)藥殘留

侯霞，趙雁冰，麻兵繼，楊紅，查麗娟

（1.唐山出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北唐山063000；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南鄭州450002）

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定板栗中58種農(nóng)藥殘留

侯霞1，趙雁冰1，麻兵繼2，楊紅1，查麗娟1

（1.唐山出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北唐山063000；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南鄭州450002）

為建立適用于板栗多種農(nóng)藥殘留檢測的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）分析方法，以乙腈為提取溶劑，樣品經(jīng)高速均質(zhì)提取，PSA、C18固相萃取柱凈化后用HPLC分離，以AgilentC18（2.7滋m，2.1 mm×100 mm）為色譜柱，甲醇和0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫30℃，進(jìn)樣量5.0滋L、流速300滋L/min，在ESI離子源、正離子掃描、動態(tài)MRM模式下，以保留時間和質(zhì)荷比對分離的組分定性，外標(biāo)法峰面積定量。結(jié)果表明：58種農(nóng)藥在各自的線性范圍內(nèi)相關(guān)性良好（r＞0.99），各農(nóng)藥的加標(biāo)回收率范圍為60%～120%，符合殘留檢測要求。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)；板栗；農(nóng)藥殘留

板栗素有“干果之王”的美稱，其含有大量的不飽和脂肪酸，對高血壓、冠心病、動脈硬化患者具有調(diào)養(yǎng)之功效；還含有豐富的蛋白質(zhì)，對人體有特殊的保護(hù)作用，能保持人體心血管壁的彈性，阻止動脈粥樣硬化，減少皮下脂肪，防止肝腎中結(jié)締組織萎縮，提高肌體的免疫能力[1～3]。隨著市場對板栗需求的擴(kuò)大，栗農(nóng)為了增產(chǎn)高收，常常在板栗生長過程中使用一些除草劑、殺菌劑等。而這些農(nóng)藥大部分可以通過根部吸收傳輸?shù)焦麑?shí)，當(dāng)人們食用了含有農(nóng)藥殘留的板栗時，身體健康就會受到威脅，嚴(yán)重時會致殘、致畸、致基因突變等[4～7]。世界各國在進(jìn)出口食品方面均有最大農(nóng)藥殘留限量（MRLs）的規(guī)定。據(jù)有關(guān)資料顯示，歐盟、美國、日本、韓國等11個國家或組織規(guī)定的堅(jiān)果（包括板栗）MRLs達(dá)299項(xiàng)，這成為影響我國板栗出口的貿(mào)易壁壘。因此，建立快速檢測板栗中農(nóng)藥多殘留的方法具有重要意義。

目前，國內(nèi)外對板栗中農(nóng)藥多殘留的報(bào)道和文獻(xiàn)相對較少。有些方法缺乏針對性，只適用于水果和蔬菜，而對板栗并不適用[8～11]。有些方法只對植物性食品中1種或幾種農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測，且樣品凈化方式較為復(fù)雜，耗時、耗材、耗人力[12～14]。常用的農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相（液相）色譜-質(zhì)譜法等[15～17]，其中，前2種方法定性檢測能力較差，容易產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象，要求的前處理?xiàng)l件也較為苛刻，且檢測樣品數(shù)量少；氣相（液相）色譜-質(zhì)譜法是目前應(yīng)用最為廣泛的檢測方法[18～20]，但是，部分板栗常用農(nóng)藥不在其檢測標(biāo)準(zhǔn)和檢測范圍之內(nèi)。因此，迫切需要建立一個針對性強(qiáng)、檢測項(xiàng)目多、覆蓋面廣、快速簡單、準(zhǔn)確可靠的板栗農(nóng)藥多殘留檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)板栗為鮮板栗，采自唐山市某板栗生產(chǎn)基地。

所有儀器設(shè)備有API 5000型四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB公司）、1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、X1R離心機(jī)（美國Thermo公司）、Turbo Vap LV氮?dú)獯蹈蓛x（美國Biotage公司）、12位固相萃取裝置（美國Supelco公司）、Rotavapor R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）、T25均質(zhì)器（德國IKA公司）。

所用試劑中，甲醇、乙腈為色譜純；氯化鈉為優(yōu)級純；無水硫酸鈉為分析純，使用前在650℃灼燒4 h，貯于干燥器中，冷卻后備用。水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品和固相萃取柱均由北京智選科匯科技發(fā)展有限公司提供。標(biāo)準(zhǔn)品純度不低于98%；固相萃取柱：ENVI C18（1 g，6 cm）；PSA（500 mg，6 cm）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和工作溶液配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液。稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，避光保存于4℃冰箱中。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。根據(jù)農(nóng)藥在儀器上的響應(yīng)靈敏度確定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各農(nóng)藥的濃度，避光保存于4℃冰箱中。

1.2.2 樣品前處理稱取鮮板栗樣品5.00 g，置于100 mL具塞的聚丙烯離心管中，加入氯化鈉5 g、乙腈20 mL，然后，10 000 r/min均質(zhì)提取1 min，4 000 r/min離心5 min，將上清液倒入雞心瓶中，重復(fù)提取1次。45℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1 mL，待凈化。

凈化。在ENVI-18柱上加無水硫酸鈉2 cm，用乙腈10 mL預(yù)淋活化，下接活化好的PSA柱。將上述濃縮液轉(zhuǎn)移到已活化的ENVI-18+PSA串聯(lián)柱上，控制過柱速度在1 mL/min以內(nèi)。用乙腈2 mL洗滌雞心瓶，并將洗滌液移入串聯(lián)柱中，重復(fù)操作3次，再用乙腈20 mL洗脫，收集洗脫液。在45℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約0.5 mL，將濃縮液置于氮?dú)獯蹈蓛x上吹干，用甲醇溶液1.0 mL定容，超聲溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定。

1.2.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.2.3.1 液相色譜條件。色譜柱：Agilent C18（2.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫30℃；進(jìn)樣量5.0 μL，流速300 μL/min，梯度洗脫見表1。

表1 流動相及梯度Table1 Mobile phase and gradient

1.2.3.2 質(zhì)譜條件。離子源及電壓：A組為ESI+源、5 500 V，B組為ESI-源、-4 500 V；離子源溫度（TEM）：550℃；掃描方式：A組為正離子掃描，B組為負(fù)離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；霧化氣：氮?dú)?；噴霧氣流速（GAS1）：45 psi；輔助加熱氣流速（GAS2）：55 psi；氣簾氣流速（CUR）：35 psi；測定農(nóng)藥的參考保留時間和參考質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的選擇

2.1.1 樣品提取溶劑的選擇選擇適宜的提取溶劑是保證農(nóng)藥殘留檢測準(zhǔn)確性的前提條件。板栗中含有大量的淀粉、不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、維生素等，根據(jù)“相似相溶”原理和待測農(nóng)藥的性質(zhì)，結(jié)合基質(zhì)的特性，選擇不同極性的提取溶劑[21]，分別試驗(yàn)了乙腈、丙酮和正己烷作為提取溶劑的效果，結(jié)果顯示，丙酮作為提取液時上層液顏色較深，雜質(zhì)較多；正己烷的回收率較低。因此，最終選擇乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 提取溶劑體積的選擇分別對乙腈10、15、20、25、30、35、35、40 mL作為提取溶劑進(jìn)行了試

驗(yàn)，結(jié)果顯示，農(nóng)藥殘留的回收率為65%～120%，乙腈體積增加，平均回收率并無較大提高。綜合考慮，確定提取溶劑乙腈的體積為20 mL。

表2 參考保留時間和質(zhì)譜參數(shù)Table2 Reference retention time and mass spectrometric parameters

2.2 凈化方式的選擇

2.2.1 固相萃取柱的選擇本研究涉及的化合物較多，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差別很大，選擇適宜的固相萃取柱可以降低樣品基質(zhì)的干擾，提高檢測靈敏度。參考李麗莉等[8]和劉紅等[22]的方法，對ENVI C18（1 g，6 cm）和PSA（500 mg，6 cm）與GPC的凈化效果和回收率進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，GPC雖然凈化效果好，但是回收率低，使用溶劑量大，操作繁瑣；而C18能很好地吸附非極性脂肪、脂溶性色素，PSA作為弱陰離子交換劑可吸附樣品中的酸性干擾物?？紤]到此類化合物的性質(zhì)，最終選擇固相萃取柱C18、PSA聯(lián)合吸附凈化的方法。該方法操作簡單，去干擾效果良好。在凈化最后一步采用高速冷凍離心，能進(jìn)一步去除脂肪類、揮發(fā)油等成分的干擾。

2.2.2 洗脫溶劑的選擇對比了乙腈、乙腈-甲苯（3∶1）、丙酮和正己烷4種洗脫溶劑的凈化效果，結(jié)果顯示，乙腈-甲苯、正己烷對雜質(zhì)的凈化效果不明顯，丙酮洗脫后干擾較大，而乙腈對樣品具有較好的洗脫凈化效果。因此，選擇乙腈作為洗脫劑。

2.2.3 洗脫體積的選擇提取液經(jīng)濃縮后從雞心瓶中轉(zhuǎn)至SPE柱，用乙腈淋洗SPE柱，每隔5 mL收集流出液，共收集40 mL，分別計(jì)算各段流出液中農(nóng)藥的回收率。結(jié)果顯示，洗脫體積超過20 mL后，平均回收率并無較大提高。綜合考慮，選擇乙腈20 mL洗脫。

2.3 定容液的選擇

參考李麗莉等[8]和曹靜等[19]的方法，比較了乙腈/水（V/V，3/2）、甲醇/水（V/V，3/2）和甲醇作為定容液的效果，結(jié)果顯示，除甲醇外，其他2種定容液對菊酯類農(nóng)藥均不能完全溶解。因此，最終選擇甲醇作為定容液。

2.4 線性范圍和測定低限

將混合對照品溶液不斷稀釋后測定，通過儀器的最低響應(yīng)值，獲得方法的測定低限（S/N=3）。各農(nóng)藥的線性范圍為0.25～500.0 μg/kg，相關(guān)系數(shù)＞0.99（表3），具有良好的線性關(guān)系，符合定量要求。

表3 分析物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及測定低限Table3 Linear regression equations，linear ranges，correlation coefficients and limits of detection of the analyte

（續(xù)表）

2.5 回收率和精密度

用陰性樣品進(jìn)行添加回收和精密度實(shí)驗(yàn)，樣品添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)后，按本方法進(jìn)行提取、凈化和測定，每個添加水平均重復(fù)6次，農(nóng)藥的添加量根據(jù)限量進(jìn)行不同濃度的添加，其添加水平回收率在60%～120%之間，精密度也均＜15%（表4）。

表4 添加回收率及精密度Table4 Recoveries and relative standard debiations

（續(xù)表）

（續(xù)表）

（續(xù)表）

（續(xù)表）

3 結(jié)論

通過對鮮板栗用乙腈均質(zhì)提取，通過ENVI C18、PSA固相萃取柱凈化后，經(jīng)高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀檢測，MRM監(jiān)測模式，外標(biāo)法定量，建立了應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測鮮板栗中58種農(nóng)藥的多殘留檢測方法。該方法快速簡單，靈敏度高，回收率和精密度均符合殘留檢測要求，多種農(nóng)藥的定量檢測低限可以滿足各國對相關(guān)產(chǎn)品設(shè)立的最高殘留限量檢測要求，可同時達(dá)到定性、定量的目的。

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Determination of 58 Pesticides in Chinese Chestnut Using High Performance Liquid Chromatographytandem Mass Spectrometry

HOU Xia1，ZHAO Yan-bing1，MA Bing-ji2，YANG Hong1，CHA Li-juan1
（1.Tangshan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Tangshan 063000，China；2.He’nan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China）

A method for the determination of 58 pesticides in Chinese chestnut was developed by using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）.The sample was extracted by acetonitrile in high-speed homogenization，cleaned by PSA，C18 Solid Phase Extraction Column and separated by HPLC.Chromatographic separation was performed on Agilent C18 column（2.7滋m，2.1 mm×100 mm）using a gradient elution of methanol and 0.1%formic acid-2 mmol/L ammonium acetate as mobile phases，at a flow rate of 300滋L/min．The column temperature was 30℃and the sample size was 5.0滋L.The peaks were detected by an electrospray ionization tandem mass spectrometry with dynamic MRM.Pesticide qualitation was based on the retention time and mass charge ratio and its quantitation was based on the peak area of fragment ion.The results indicated that the calibration curve of 58 pesticides was in good linear（r＞0.99），and the average recovery of main peaks were in the range of 60%-120%.As a result，this method is simple，fast and credible and can be applied to screen and detect these pesticide residues in Chinese chestnut.

High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）；Chinese chestnut；Pesticide residue

S664.2

：A

：1008-1631（2016）06-0097-09

2016-06-08

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目（1423004132081）

侯霞（1979-），女，河南周口人，工程師，碩士，主要從事食品安全分析工作。E-mail：houxia1213@sina.com。