肥達氏反應實驗方法的改進

覃艷春，曾 怡，黃干榮，韋紅玉，陸 鋼

（1.右江民族醫(yī)學院/桂西微生物感染研究重點實驗室，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000）

肥達氏反應實驗方法的改進

覃艷春1，曾 怡1，黃干榮1，韋紅玉1，陸 鋼2*

（1.右江民族醫(yī)學院/桂西微生物感染研究重點實驗室，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000）

目的 探討肥達氏反應實驗技術的改進方法，使學生操作起來更容易，減少試劑用量，縮短試驗反應時間。方法 用移液器加樣，微量孔代替試管，52℃水浴1 h。結(jié)果 微量孔法相對于試管法操作簡單快速，試劑用量少，反應時間短。結(jié)論肥達氏反應實驗采用的微量孔法可以代替試管法。

肥達氏反應；實驗方法；微量孔法

肥達氏反應實驗是醫(yī)學微生物學的一個基礎實驗，是應用血清學方法，根據(jù)已知的傷寒桿菌的“O”“H”抗原，甲型、乙型副傷寒的“H”抗原和病人感染傷寒或副傷寒后，約經(jīng)1～2周即可在血清中出現(xiàn)的抗體，在適當電解質(zhì)參與下出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，根據(jù)凝集現(xiàn)象判斷凝集效價，在臨床上用于輔助診斷傷寒及副傷寒病。

針對肥達氏反應實驗存在所用的傷寒診斷血清價格昂貴，傷寒血清制備費時、費力，反應時間長（24 h）等缺點，近年來有同行對此反應進行了改進，如丁金龍[1]的聚凝胺法，霍立新[2]的離心法加速了反應時間等。雖然如此，但他們對肥達氏反應實驗的改進仍未解決上述全部問題，因此，我實驗室對此實驗再加以改進，用微量孔法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的試管法。在學生實驗中，經(jīng)過幾年的實際運用效果良好。改進前后方法對比介紹如下。

1改進前的實驗方法——試管法[3]

1.1材料

（1）傷寒待測血清[3]1∶20稀釋）。

（2）試劑傷寒沙門氏菌菌體抗原“O”及鞭毛抗原“H”、甲型副傷寒沙門菌鞭毛抗原及乙型副傷寒沙門菌鞭毛抗原，來源于寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.2方法

（1）取潔凈小試管24支，以4排6列擺放在試管架上，試管按順序編號并標記抗原種類。

（2）用5 ml吸管吸取生理鹽水，各管加入0.5 ml。

（3）另取1 ml吸管吸取1∶20稀釋血清，分別加入每排的第1管內(nèi)，每管0.5 ml，吸吹3次充分混合，將血清稀釋為1∶40。

（4）依次類推血清對倍稀釋至各排第5管、從第5管中吸0.5 ml棄置消毒容器。此時第2、3、4、5管血清的濃度分別為1∶80，1∶160，1∶320，1∶640。

（5）第6管不加血清，作為抗原對照管。

（6）加入抗原：第1排各管加入傷寒血清“H”抗原3滴。第2排各管加入傷寒血清“O”抗原0.5 ml。第3排各管加入甲型副傷寒“A”抗原3滴。第4排各管加入乙型副傷寒“B”抗原0.5 ml。

Y2 的模型回歸方程為：Y2=-228.229+43.9125x1+8.79167x2+3.32937x3-6.78333x12-0.389583x22-0.0132083x32+0.3125x1x2-0.0475x1x3-0.001875x2x3。

（7）混勻，置于37℃電熱恒溫水浴箱18～24 h觀察結(jié)果。1.3結(jié)果

（1）觀察對照管（第6管），管度有圓形沉淀物，搖動試管，液體均勻混濁。

（2）從各排第1～5管順序觀察試驗管，大部分細菌被凝集于管底，液體輕度混濁為++。

（3）凝集效價的確定，以血清的最高稀釋度仍能出現(xiàn)明顯凝集（++）的，為被檢血清的凝集效價。

2改進后的實驗方法——微量孔法

2.1材料

（1）傷寒待測血清[3]1∶20稀釋）。

（2）試劑傷寒沙門氏菌菌體抗原“O”及鞭毛抗原“H”、甲型副傷寒沙門菌鞭毛抗原及乙型副傷寒沙門菌鞭毛抗原，來源于寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

（3）生理鹽水、U型微孔反應板、50 μl移液器（來自上海求精生化試劑儀器有限公司）、吸頭、52℃電熱恒溫水浴箱（來自國營創(chuàng)新醫(yī)療器械廠，型號S648）。

2.2方法

（1）準備4排微量U型小孔，每排6孔，標明記號。

（2）每孔加入生理鹽水50 μl。

（3）每排第一孔加入待測血清50 μl，混勻，將血清稀釋為1∶40。

（4）進行對倍稀釋，即吸取第1孔50 μl血清放置第2孔，再從第2孔吸取血清50 μl放置第3孔，以此類推連續(xù)稀釋第5孔為止，從第5孔中吸50 μl棄置消毒容器。此時第2、3、4、5孔血清的濃度分別為1∶80，1∶160，1∶320，1∶640。

（5）第6孔不加血清作陰性對照孔。（6）每排加入對應的傷寒菌液50 μl。（7）混勻，置于52℃電熱恒溫水浴箱觀察結(jié)果。

2.3結(jié)果

（1）觀察對照孔，無凝集反應，再觀察各孔的凝集情況。

（2）上清液澄清度大約50%，約50%細菌集成塊沉于孔底記++。

（3）以呈現(xiàn)++凝集現(xiàn)象的血清的最高稀釋倍數(shù)作為該血清的凝集效價。

3結(jié)論

同一份傷寒血清標本，改進后的微量孔法跟傳統(tǒng)的試管法結(jié)果（效價）相同。試管法與微量孔法試劑用量和實驗時間見表1。

表1 兩種方法使用試劑與時間的比較

4討論

從上述實驗操作過程和結(jié)論來看，改進后的微量孔法相對傳統(tǒng)的試管法有操作更簡便、試劑用量少、實驗時間短的特點。任何一門課程、學科的發(fā)展都會經(jīng)歷不斷探索、不斷完善的過程[4]，任何實驗技術也要精益求精，在此思想指引下我們對該實驗技術進行了改進。肥達氏反應實驗是我校各專業(yè)本科學生醫(yī)學微生物學實驗內(nèi)容之一，每學年要做這個實驗的學生達1 200人，在試劑用量上，按照兩個學生一組來計算，肥達氏反應用微量孔法代替試管法可以節(jié)省270 000 μl傷寒血清試劑，“O”、“H”、甲型、乙型傷寒診斷血清各節(jié)省了1 350 000 μl，在節(jié)約教學經(jīng)費的同時，也更加低碳環(huán)保。在操作上，微量孔法用的是移液器加樣相對試管法用吸管加樣對學生來說操作更簡單，也更準確。在實驗時間上，52℃水浴1 h比37℃水浴24 h看結(jié)果節(jié)省了23 h。綜上所述，肥達氏反應微量孔法有諸多優(yōu)點，可以替代試管法推廣使用。

[1]丁金龍，屠文娟.聚凝胺法在肥達反應中的應用與評價[J].江西醫(yī)學檢驗，2006，24（4）：381.

[2]霍立新.肥達反應試驗的快速法[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2007，4（5）：431. [3]柳忠輝.醫(yī)學免疫學實驗技術[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

[4]吳冰，馬煜峰，凌冠華，等.基礎醫(yī)學綜合實驗與實驗設計課程內(nèi)容改革的探索[J].基礎醫(yī)學教育，2013，15（7）：704-705.

（*通訊作者：陸鋼）

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1671-1246（2016）23-0110-02