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    低分子量聚谷氨酸的制備及其在眼科靶向藥物中的應(yīng)用研究

    2016-02-14 02:40:56譚李玉鄔莉娜畢群杰
    當(dāng)代化工 2016年12期
    關(guān)鍵詞:絲裂霉素鈦白粉眼表

    陳 卓,石 蕊,譚李玉,鄔莉娜,畢群杰,夏 銳,張 蕾

    (1. 西安醫(yī)學(xué)院 陜西 西安 710021; 2. 陜西省人民醫(yī)院眼科,陜西 西安 710068)

    低分子量聚谷氨酸的制備及其在眼科靶向藥物中的應(yīng)用研究

    陳 卓1,石 蕊2,譚李玉1,鄔莉娜1,畢群杰1,夏 銳1,張 蕾1

    (1. 西安醫(yī)學(xué)院 陜西 西安 710021; 2. 陜西省人民醫(yī)院眼科,陜西 西安 710068)

    人體角膜難以吸收分子量較大的藥物分子,為了減少高毒藥物治療眼表疾病時經(jīng)角膜吸收導(dǎo)致的眼內(nèi)副作用,設(shè)計了絲裂霉素C的L-聚谷氨酸衍生物高分子前藥。為了減少市售鏈狀大分子聚谷氨酸修飾后,絲裂霉素C被其包纏導(dǎo)致的藥效降低,將市售的L-聚谷氨酸先進(jìn)行定量水解,獲得了一系列較低分子量的L-聚谷氨酸(1~5 k),通過電泳法確證其分子量,并將其應(yīng)用制備了系列低分子量L-聚谷氨酸衍生物高分子絲裂霉素C前藥。

    低分子量聚谷氨酸;前藥;高分子修飾;絲裂霉素C

    聚谷氨酸(polyglutamic acid, PGA)是以枯草芽孢桿菌通過發(fā)酵技術(shù)制備的一種高分子化合物[1]。PGA以其低毒性和免疫原性、高降解性、不易蓄積性在藥學(xué)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。被廣泛應(yīng)用于緩控釋以及靶向藥物的載體[2]。市售的聚谷氨酸的分子量通常在300~1 000 kDa之間, 陳國廣等報道了分子量在20~60 kDa之間低聚谷氨酸的制備工藝[3]。

    人眼如長期受到外界剌激,如日光、風(fēng)沙、霧霾等,常易在瞼裂部球結(jié)膜引起贅生性病變。首先,贅生生長浸潤角膜可導(dǎo)致角膜曲率改變而引起不同程度的散光、眼球轉(zhuǎn)動障礙、視力下降,嚴(yán)重影響了病人的生活質(zhì)量;其次,贅生組織本身也易引發(fā)反復(fù)發(fā)生的眼紅、磨不適,導(dǎo)致結(jié)膜炎反復(fù)發(fā)生及由此產(chǎn)生的長期治療費(fèi)用;第三,贅生的生長嚴(yán)重影響了病人的眼部外觀。

    在臨床治療時,多采用手術(shù)切除法,但單純術(shù)后極易復(fù)發(fā),其術(shù)后高復(fù)發(fā)率是一個十分棘手的問題,復(fù)發(fā)原因與手術(shù)創(chuàng)傷加快了成纖維細(xì)胞增生有關(guān),復(fù)發(fā)通常發(fā)生于術(shù)后短期時間內(nèi),復(fù)發(fā)組織進(jìn)展快,常較原發(fā)者擴(kuò)大。因此,在治療中必須在術(shù)中、術(shù)后聯(lián)用絲裂霉素C(Mitomycin C , MMC)等高毒性抗代謝藥物[4]。目前沒有其他替代方案。當(dāng)這些高毒藥物眼表施用后極易通過角膜吸收進(jìn)入眼球內(nèi),導(dǎo)致眼內(nèi)組織如晶狀體、玻璃體及視網(wǎng)膜等受損[4]。因此,此類藥物的靶點(diǎn)位于眼表,但其眼內(nèi)副作用則由角膜吸收所導(dǎo)致。

    角膜是保護(hù)眼內(nèi)組織的重要屏障,其屏障作用主要通過分子量限制、極性限制和P蛋白外排作用來實現(xiàn),其中,分子量限制使分子量達(dá)到500以上的化合物難以通過角膜吸收[5]。本課題組將絲裂霉素C與PGA等高分子化合物[6]通過化學(xué)合成的方法制備為高分子前藥,以減少其角膜吸收,從而使其在翼狀胬肉等結(jié)膜、眼表疾病的應(yīng)用中,降低了全眼副作用。

    PGA是多羧基聚合物,其鏈上的羧基使其具有pH響應(yīng)性,在低pH值環(huán)境下,呈直鏈狀;在眼部的生理pH值7.35~7.45下則呈卷曲狀。這時,無論市售的300~1 000 kDa的超聚谷氨酸或20~60 kDa的低聚谷氨酸的修飾的絲裂霉素C將被包纏、遮蓋、空間位阻大,難以被酯酶水解釋放活性代謝物物質(zhì)絲裂霉素C。因此,用于制備眼表靶向前藥的PGA的適宜分子量應(yīng)當(dāng)僅略大于使藥物難以進(jìn)入角膜的500 Da,從而減少對藥物本體的包纏遮蔽。目前,適宜于眼表疾病藥物研究的1至5 kDa之間的低聚谷氨酸及其前藥制備應(yīng)用研究未見文獻(xiàn)報道。

    1 儀器與試劑

    紫外分光光度計為UV-1780型(日本島津制作所);冷凍干燥機(jī)為FD-1000型(日本東京理化株式會社);磁力攪拌低溫槽為PSL-1810型(日本東京理化株式會社);電泳儀為DYCP-31DN型(北京六一)。

    絲裂霉素 C 為化學(xué)純(Sigma-Aldrich);PGA(300~1 000 kDa) 為化學(xué)純(Sigma-Aldrich);Tris試劑(Sigma-Aldrich),瓊脂糖(Sigma-Aldrich)吡啶為分析純(天津科密歐);1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亞胺鹽酸鹽(EDC)為分析純(上海源葉生物科技);N-羥基琥珀酰亞胺為分析純(上海源葉生物科技);水為雙蒸水;透析袋(MWCO 1000及MWCO 5000, 百靈威科技);柱層析所使用薄層硅膠為硅膠H(青島海洋化工);其他常見有機(jī)溶劑、試劑均為分析純,必要時干燥。

    2 低分子量聚谷氨酸的制備研究

    2.1 低分子量聚谷氨酸的制備

    取聚谷氨酸(分子量300~1 000 kDa)20 g,溶于以鹽酸調(diào)節(jié)至~H=1-7的水中,在-10~80 ℃下攪拌8 h;反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液使用透析袋進(jìn)行分離,截取分子量1 000~5 000的聚谷氨酸,冷凍干燥得到白色固體即為低分子量聚谷氨酸。

    2.2 低聚谷氨酸的制備工藝研究

    2.2.1 產(chǎn)物的純化研究

    透析袋是一種成熟市售的基于滲透壓分子量截留原理對溶液中一定分子量的化合物進(jìn)行分離的產(chǎn)品。

    由于需要1至5 kDa的聚谷氨酸,我們采用雙層透析層的裝置進(jìn)行分離。取直徑29 mm的截留分子量1 000的透析袋作為外層,其中置入直徑11 mm的截留分子量5 000的透析袋為外層。將反應(yīng)液加入內(nèi)袋中,密封上口,將此裝置置于盛有800 mL蒸餾水的燒杯中,室溫攪拌4 d,期間每8 h更換燒杯中蒸餾水一次。透析結(jié)束后將內(nèi)袋提出棄去后,將外袋中液體冷凍干燥即得白色固體聚谷氨酸(分子量1至5 kDa)。采用電泳法測定、驗證產(chǎn)物的分子量。

    2.2.3低聚谷氨酸的制備工藝考察

    由于在產(chǎn)物純化中已將未水解至目標(biāo)分子量的產(chǎn)物及副產(chǎn)物除去,因此通過考察反應(yīng)的質(zhì)量收率即可反映制備工藝情況??疾炝朔磻?yīng)液pH值,溫度兩項指標(biāo)。

    從表1及圖1中 可以看出,最佳水解條件為pH=3,溫度為60 ℃,在這一條件下可以獲得10.1%的收率。

    表1 pH對目標(biāo)分子量低聚谷氨酸制備收率的影響(溫度均為室溫,約20 ℃)Table 1 Effect of pH to the yield of low molecular weight PGA

    圖1 pH對目標(biāo)分子量低聚谷氨酸制備收率的影響Fig.1 Effect of pH to the yield of low molecular weight PGA

    3 低分子量聚谷氨酸-絲裂霉素C的制備

    將低分子量聚谷氨酸1 g加入單口瓶中,加入二氧六環(huán)250 mL、N-羥基琥珀酰亞胺0.61 g、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亞胺鹽酸鹽(EDC)1.03 g和吡啶3 mL,在50 ℃下保溫10 h,蒸去溶劑,剩余物溶于100氯仿,用稀鹽酸10 mL洗滌后,氯仿層蒸干,所得物加至0.03 mol/L HBS緩沖液(pH為7.4)10 mL中,攪拌下加入絲裂霉素C 3.34 g,期間加入 0.5 mol/L 氫氧化鈉或氫氧化鉀水溶液維持pH=7.4;然后攪拌12 h反應(yīng)液后將其濃縮至干,剩余物使用硅膠柱色譜分離(洗脫液為二氯甲烷與甲醇按體積比為10∶1組成的混合物)得黃色至白色產(chǎn)物,即低分子量 L-聚谷氨酸-絲裂霉素 C(圖2)。

    圖2 低分子量聚谷氨酸-絲裂霉素C的制備Fig.2 Preparation of low molecular weight PGA-MMC

    4 討 論

    本研究發(fā)現(xiàn),在制備低分子量聚谷氨酸的水解過程中,酸性有利于水解反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行。但當(dāng)pH下降至1時,收率反而下降。這可能是因為我們的目標(biāo)分子是1至5 kDa的聚谷氨酸,當(dāng)酸性提高時,水解反應(yīng)的速率過快,更多的聚谷氨酸分子被水解至1 kDa分子量以下的小分子,從而在透析中被透析至外層膜以外除去,使目標(biāo)化合物的收率下降。

    抗癌藥物的一個發(fā)展方向是聚合物治療法。聚合物-藥物偶合物是指將適當(dāng)?shù)木酆衔镙d體、生物可降解的交聯(lián)劑和具有生物學(xué)活性的抗腫瘤藥物結(jié)合起來,這一設(shè)計思路備受人們關(guān)注,并且將很有可能成為新一代抗腫瘤藥物設(shè)計的基礎(chǔ)。

    因此,本研究所獲得的低分子量聚谷氨酸可以應(yīng)用在絲裂霉素 C進(jìn)行修飾,使其可以通過 EPR effect在增生組織中積聚,然后由cathepsin B介導(dǎo)絲裂霉素C的釋放,從而達(dá)到治療作用。而在正常組織中,由于其分子量較大,難以透過角膜進(jìn)入眼內(nèi),從而大幅降低其經(jīng)角膜通路的眼內(nèi)吸收,使其在眼表贅生組織治療的應(yīng)用中,提高藥效、降低全眼副作用。

    [1] Atsuo , Masao K. Biosynthesis and hydrolysis of poly (γ-glutami c acid)from Baci llus subtilis IFO3335 [J]. Biosci Biotech Biochem ,1992, 56(7):1031-1035.

    [2] 陳國廣,陳茂偉,韋萍,等.聚谷氨酸及其衍生物在新型藥物傳輸系統(tǒng)中的應(yīng)用[J]. 南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2003 , 25(2): 75-78.

    [3] 陳國廣, 張鈞壽, 陳茂偉,等.低分子聚谷氨酸的制備工藝研究[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報,2003 , 34(3): 225-227.

    [4] Rachmiel R, Leiba H, Levartovsky S. Results of treatment with topical mitomycin C 0.02% following excision of primary pterygium[J]. Br J Ophthalmol,1995, 79(3): 233-236.

    [5] 嚴(yán)忠勤, 鐘裕國, 溫玉明. 趨淋巴抗癌藥絲裂霉素-右旋糖酐偶聯(lián)物的合成及生物學(xué)性質(zhì)的研究[J]. 中國藥物化學(xué)雜志, 1999, 4(9): 240-244.

    [6] 陳卓,石蕊,譚李玉,等.聚乙二醇單甲醚偶聯(lián)的絲裂霉素C前藥的合成[J]. 應(yīng)用化工,2015,44(10):1971-1972.

    鈦精礦狂漲鈦白粉傷不起 產(chǎn)業(yè)鏈要互利

    近期鈦精礦價格上漲顯著,又遭攀枝花地區(qū)環(huán)保曝光。目前攀西地區(qū)38品位以上鈦中礦價格在800-850元/噸(不含稅)左右,46品位10鈦精礦價格在1250-1400元/噸(不含稅)間,47品位鈦精礦價格在1100-1200元/噸(不含稅)間。進(jìn)口鈦礦價格新單成交價同樣走高。進(jìn)入10月后至今,鈦精礦價格狂漲以及運(yùn)輸新規(guī)實施帶來的運(yùn)費(fèi)增加,使鈦白粉漲“停不下來”更“傷不起”。

    以攀枝花鈦礦為例,自2013年年初的1500元/噸左右跌至年底的500元/噸,同期2013年上半年金紅石型鈦白粉市場均價約為14500元/左右,2013年年底大約均價為14000元/噸,鈦礦跌價幅度與鈦白粉價格跌幅不成正比。

    2015年國內(nèi)鈦礦基本維持在400-600元/噸之間,可金紅石型鈦白粉市場價格從年初的12500元/噸飛流直下跌破9000元/噸,鈦白粉跌幅與鈦礦價格不成比例。

    2015年金紅石型鈦白粉跌破9000元/噸的情況下,涂料企業(yè)普遍“盆豐缽滿”,據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示,2015年我國涂料行業(yè)平均利潤實現(xiàn)8%-10%的增長。

    產(chǎn)業(yè)鏈?zhǔn)钱a(chǎn)業(yè)價值實現(xiàn)和增值的根本途徑。我們從以上數(shù)據(jù)或可以“略見一斑”,在緊密相關(guān)的產(chǎn)業(yè)鏈上,違背了市場規(guī)律,產(chǎn)業(yè)鏈將會斷裂,如今已經(jīng)不存在暴利時代,暴漲暴跌的年代已經(jīng)過去,產(chǎn)業(yè)鏈中暴漲暴跌一個環(huán)節(jié),或造成“鏈斷”傷不起。

    新常態(tài)下,企業(yè)轉(zhuǎn)型升級是必由之路。鈦白粉產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和轉(zhuǎn)型升級的大環(huán)境下把握機(jī)遇、順勢而為,提升產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)國際先進(jìn)水平,為下游企業(yè)提供“性價比”優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品是發(fā)展的前提,產(chǎn)業(yè)鏈互利是產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展的基礎(chǔ),在互利中企業(yè)才能獲得最大效益。

    Preparation of Low Molecular Weight Polyglutamic Acid and Its Application in Targeting Ophthalmic Prodrug

    CHEN Zhuo1, SHI Rui2, TAN Li-yu1, WU Li-na1, BI Qun-jie1, XIA Rui1, ZHANG Lei1

    (1. Xi’an Medical University , Shaanxi Xi’an 710021, China;2. Shaanxi Provincial People’s Hospital, Shaanxi Xi’an 710068, China)

    Large molecular weight drugs cannot be absorbed by human corneas. In order to minimize the side effects caused by absorption into eyeball trough cornea in the application of the highly toxic Mitomycin C in ocular surface diseases, PGA derivative macromolecule prodrug PGA-MMC was designed. To reduce the package wrapping effect on MMC using the chain-like macromolecules modifying such as PGA, which can make the pesticide effect reduce, PGA was first quantitative hydrolyzed to get lower molecular weight PGA(1~5 k).And then series of low molecular weight PGA-MMC was synthesized .

    PGA with lower molecular weight; prodrug; macromolecules modifying; mitomycin C

    R9; TQ463

    A

    1671-0460(2016)12-2787-03

    陜西省教育廳專項科研計劃項目,項目號:15JK1620。

    2016-11-28

    陳卓(1985-),男,陜西西安人,講師,碩士,研究方向:從事藥物化學(xué)研究工作。E-mail:352304625@qq.com。

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