大鼠被動皮膚過敏反應(yīng)實驗條件的優(yōu)化

陳文培，張子揚，周成浩，劉 涵，胥 彤，郭宇琳，林寶琴

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

·實驗方法·

大鼠被動皮膚過敏反應(yīng)實驗條件的優(yōu)化

陳文培，張子揚，周成浩，劉 涵，胥 彤，郭宇琳，林寶琴

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

目的通過卵白蛋白（OVA）致敏大鼠優(yōu)化被動皮膚過敏反應(yīng)（PCA）的實驗條件。方法1 ～2月齡SD大鼠ip給予OVA（每只0.2，1.0和5.0 mg）與弗氏完全佐劑的混合乳液，隔日1次，共3次，進行致敏。分別于末次致敏后1，3，5，7，10，12，14，16和18 d用ELISA檢測血清總IgE（T-IgE）水平和OVA特異性IgE（OVA-sIgE）水平。大鼠致敏后12 ～16 d制備致敏血清。大鼠皮內(nèi)注射致敏血清被動皮膚致敏后，于0.5，1.5，3，6，12，24，36，48和60 h后iv給予同等劑量OVA和伊文思藍激發(fā)，于激發(fā)后10，30和60 min測量大鼠皮膚藍斑直徑。結(jié)果OVA致敏大鼠血清T-IgE和OVA-sIgE水平分別于末次致敏后3 ～7 d和12 ～16 d達高峰；在OVA 0.2 ～5.0 mg劑量范圍內(nèi)，OVA-sIgE與T-IgE水平無明顯關(guān)聯(lián)性；OVA 1.0和5.0 mg致敏大鼠血清能誘發(fā)大鼠PCA；皮內(nèi)注射致敏血清0.5 ～3 h后激發(fā)的皮膚藍斑形態(tài)規(guī)則，范圍最大；激發(fā)后30 ～60 min檢測的皮膚藍斑范圍大，界線清晰，形狀規(guī)則，且著色較深。結(jié)論PCA優(yōu)化條件為1 ～2月齡大鼠隔日每只ip給予OVA 1.0 ～5.0 mg，共致敏3次，致敏后12 ～16 d制備致敏血清。在被動皮膚致敏0.5 ～3 h后，進行激發(fā)，30 ～60 min后檢測皮膚內(nèi)層藍斑直徑。

卵白蛋白；Ⅰ型過敏反應(yīng)；IgE；被動皮膚過敏反應(yīng)；大鼠

過敏反應(yīng)又稱超敏反應(yīng)。根據(jù)病理機制和臨床特點，過敏反應(yīng)分為4型，其中Ⅰ型過敏反應(yīng)由免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)［1］，其機制為過敏原刺激呼吸道和消化道黏膜固有層淋巴組織中的B細胞轉(zhuǎn)變?yōu)闈{細胞，漿細胞釋放IgE抗體。IgE抗體與肥大細胞或嗜堿性粒細胞膜上的特異受體結(jié)合，使機體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)相同過敏原再次進入機體，接觸到結(jié)合了IgE的肥大細胞或嗜堿性粒細胞，則后者會“脫顆?！贬尫懦鲞^敏介質(zhì)如組胺和白三烯等，這些介質(zhì)刺激鄰近的血管或神經(jīng)，從而引起血管擴張和平滑肌收縮等［2-3］。

用于評價藥物引起Ⅰ型過敏反應(yīng)的方法有主動全身過敏反應(yīng)、主動皮膚過敏反應(yīng)和被動皮膚過敏反應(yīng)（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）實驗［1，4］。其中，PCA實驗主要用于由IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)的研究［4］，是研究藥物是否會產(chǎn)生Ⅰ型過敏反應(yīng)的較好方法。PCA的敏感動物依次為BN大鼠、豚鼠和SD大鼠，較之于BN大鼠和豚鼠，SD大鼠盡管敏感性低于前兩者，但因其來源穩(wěn)定、價格便宜和便于飼養(yǎng)等，越來越受到國內(nèi)藥物安全評價工作者的重視和使用。然而，本實驗室和不少其他GLP實驗室根據(jù)我國2010年版《最新藥品注冊法規(guī)及指導(dǎo)原則》（簡稱《原則》）中化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則［4］進行多次PCA實驗發(fā)現(xiàn)，即使是使用陽性藥如卵白蛋白（ovalbumin，OVA）對大鼠進行PCA實驗，被動皮膚致敏24或48 h激發(fā)時產(chǎn)生的皮膚藍斑邊界不清晰，難以定量，或有個別大鼠未出現(xiàn)藍斑。這一現(xiàn)象不利于準(zhǔn)確評價藥物的安全性。為此，本研究以SD大鼠為實驗對象，采用ip給予OVA與弗氏完全佐劑的混合乳液致敏，以期優(yōu)化PCA的實驗條件。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑和儀器

OVA和弗氏完全佐劑，德國Sigma公司；伊文思藍，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；OVA-特異性IgE（specific IgE，sIgE）酶聯(lián)免疫試劑盒，武漢華美生物工程有限公司；大鼠IgE ELISA試劑盒，日本Shibayagi公司。酶標(biāo)儀，美國Thermo Scientific公司。

1.2動物

SPF級SD大鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量為130 ～150 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供〔動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2013-0020〕，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室〔場地設(shè)施使用許可證號：SYXK（粵）2012-0125〕。

1.3大鼠OVA致敏血清最佳致敏時間的考察

本實驗共設(shè)2組，分別為正常對照組（4只大鼠）和OVA組（36只大鼠）。OVA組大鼠隔日ip給予OVA和弗氏完全佐劑混合乳液，每只5.0 mg OVA，給藥體積為每只1 mL（含OVA 0.5 mL，弗氏完全佐劑0.5 mL），共致敏3次。于末次致敏后1，3，5，7，10，12，14，16和18 d分別隨機取4只大鼠，用戊巴比妥鈉與賽拉嗪（xylazine）聯(lián)合麻醉后，頸動脈采血，分離血清。正常對照組大鼠則以生理鹽水替代OVA，于末次注射后1 d采血，分離血清。嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，測定血清總IgE（total IgE，T-IgE）和OVA-sIgE水平。

1.4大鼠OVA致敏血清中T-IgE與OVA-sIgE檢測

大鼠隔日ip給予OVA進行致敏，劑量為每只0.2，1.0和5.0 mg，給藥體積為每只1 mL（含OVA 0.5 mL，弗氏完全佐劑0.5 mL）。分別于末次致敏后3和12 d采血，分離血清。末次致敏后3 d分離的血清用于測定T-IgE水平，末次致敏后12 d分離的血清用于測定OVA-sIgE水平。

1.5最佳OVA劑量及皮內(nèi)注射致敏血清后最佳激發(fā)時間考察

大鼠分別隔日ip給予OVA，劑量為每只0.2，1.0和5.0 mg，給藥體積為每只1 mL（含OVA 0.5 mL，弗氏完全佐劑0.5 mL）。末次致敏后12 d制備致敏血清。將各組大鼠的致敏血清進行組內(nèi)等體積混合后，以生理鹽水按1∶0，1∶4和1∶16稀釋。各大鼠背部皮內(nèi)注射對應(yīng)致敏血清0.1 mL進行被動致敏。分別在皮膚被動致敏0.5，1.5，3，6，12，24，36，48和60 h后，靜脈注射與致敏劑量相同的OVA加等體積的1%伊文思藍染料共1 mL進行激發(fā)，激發(fā)后30 min用5倍麻醉劑量戊巴比妥鈉活殺大鼠，測量皮膚內(nèi)層的斑點大小，直徑大>5 mm者為陽性。

1.6最佳PCA檢測時間考察

大鼠隔日ip給予OVA，每只5.0 mg，給藥體積為每只1 mL（含OVA 0.5 mL，弗氏完全佐劑0.5 mL）。末次致敏后12 d制備致敏血清。將各組大鼠的致敏血清進行組內(nèi)等體積混合后，以生理鹽水按1∶0，1∶4，1∶16和1∶32稀釋，各大鼠背部皮內(nèi)注射對應(yīng)致敏血清0.1 mL進行被動致敏。在皮膚被動致敏30 min后，各大鼠靜脈注射與致敏劑量相同的OVA加等體積的1%伊文思藍染料共1 mL進行激發(fā)，分別在激發(fā)后10，30和60 min用5倍麻醉劑量戊巴比妥鈉活殺大鼠，測量皮膚內(nèi)層的藍色斑點直徑。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析，多組間兩兩比較用LSD法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1制備大鼠OVA致敏血清的最佳時間

由圖1可知，與正常對照組比較，末次致敏后3 ～14 d大鼠血清T-IgE水平顯著升高（P<0.01）；末次致敏后3 d，血清OVA-sIgE水平顯著增加（P< 0.01），12 ～16 d達到最高。因此，檢測致敏血清中T-IgE水平的時間應(yīng)在末次致敏后3 ～7 d。致敏血清制備的時間則根據(jù)OVA-sIgE水平，結(jié)合2010年版《原則》中化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則，以末次致敏后12 ～16 d為宜。

Fig.1 Total IgE（T-IgE）（A）and ovalbumin（OVA）-specific IgE（OVA-sIgE）（B）levels in serum of rats after final immunization with OVA.The rats were ip given OVA 5.0 mg per rat，once every other day，for 3 times，and then serum T-IgE and OVA-sIgE were detected at indicated time after final immunization.x±s，n=4.**P<0.01，compared with normal control group.

2.2大鼠OVA致敏血清中T-IgE與OVA-sIgE水平的關(guān)聯(lián)性

由圖2可知，與正常對照組比較，OVA各劑量組的T-IgE（P<0.05）和OVA-sIgE（P<0.01）水平均顯著提高。在OVA每只0.2 ～5.0 mg劑量范圍內(nèi)，兩者水平與OVA劑量均無明顯相關(guān)性，兩者水平無明顯關(guān)聯(lián)性。

Fig.2 Levels of serum T-IgE（A）and OVA-sIgE（B）in rats after final immunization with OVA.The rats were ip given OVA 0，0.2，1.0 and 5.0 mg per rat，respectively，once every other day，for 3 times.Serum IgE was detected on the 3rdday（T-IgE）and the 12thday（OVA-sIgE）after final immuni?zation，respectively.x±s，n=3-4.*P<0.05，**P<0.01，compared with normal control group.

2.3最佳OVA致敏劑量及皮內(nèi)注射致敏血清后最佳激發(fā)時間

由圖3、表1和表2可知，正常對照組大鼠激發(fā)后背部皮膚均未出現(xiàn)藍斑（圖3A），PCA發(fā)生率為0。OVA每只1.0和5.0 mg劑量組0.5 ～3 h激發(fā)大鼠背部皮膚均出現(xiàn)直徑>5 mm藍斑，藍斑界線清晰，形狀規(guī)則，且著色較深（圖3B1 ～3，圖3C1 ～3），PCA發(fā)生率為100%。OVA每只1.0 mg和5.0 mg劑量組6 h激發(fā)大鼠均發(fā)生PCA，背部皮膚均出現(xiàn)直徑>5 mm的藍斑，藍斑界線不清晰，形狀不規(guī)則（圖3B4，圖3C4）。OVA每只1.0 mg劑量組12 ～24 h激發(fā)大鼠和每只5.0 mg劑量組12 ～48 h激發(fā)大鼠背部皮膚可出現(xiàn)直徑>5 mm的藍斑，但大部分藍斑呈彌漫狀，著色隨皮內(nèi)注射時間的延長而逐漸變淡（圖B5 ～6，圖3C5 ～8），PCA發(fā)生率未達100%。每只1.0 mg劑量組48 h激發(fā)大鼠背部皮膚均未出現(xiàn)直徑>5 mm的藍斑（圖3B7），PCA發(fā)生率為0。每只0.2 mg劑量組激發(fā)后僅小部分大鼠背部皮膚出現(xiàn)直徑>5 mm藍斑（圖略）。由此可見，OVA劑量為每只1.0和5.0 mg能誘發(fā)大鼠PCA反應(yīng)，最佳激發(fā)時間為皮內(nèi)注射致敏后0.5 ～3 h。

Fig.3 Blue spots in skin of rats stimulated by OVA 1.0 mg(B)and 5.0 mg(C)per rat.The rats were ip given OVA 1.0 and 5.0 mg per rat respectively,once every other day，for 3 times.Serum was collected on the 12thday after final immunization and diluted at the ratio of 1∶0,1∶4 and 1∶16.The rats were sensitized by different diluted serum 0.1 mL，and then stimulated by the same dose of OVA 0.5-60 h later.A:normal control;B1-B7:0.5,1.5,3,6,12,24 and 48 h stimulation;C1-C9:0.5,1.5,3,6,12,24,36,48 and 60 h stimulation.

Tab.1 Diameters of skin blue spot induced by OVA stimulation in rats

Tab.2 Positive rate of passive cutaneous anaphylaxis（PCA）induced by OVA stimulation in rats

2.4大鼠OVA激發(fā)后最佳PCA檢測時間

由表3可知，OVA激發(fā)后10，30和60 min，大鼠背部皮膚均出現(xiàn)直徑>5 mm藍斑，藍斑大小無明顯差異。但10 min組大鼠皮膚藍斑界線不清晰，顏色過淺；30和60 min組則藍斑界線清晰，形狀規(guī)則，著色較深。因此，宜在抗原激發(fā)后30 ～60 min進行PCA檢測。

Tab.3 Diameter of blue spots in skin of rats after dif?ferent time of stimulation

3 討論

一般認為，PCA的敏感動物依次是BN大鼠、豚鼠和SD大鼠。雖然BN大鼠是最易產(chǎn)生IgE的大鼠品系［5］，但因繁殖率低，自發(fā)腫瘤率高，價格昂貴，限制了其在藥物安全性評價中的應(yīng)用。豚鼠的Ⅰ型過敏反應(yīng)可由IgE和IgG介導(dǎo)［6］，后者起主要作用，而這兩種Ig所介導(dǎo)的過敏反應(yīng)出現(xiàn)的時間和程度不一致，影響PCA結(jié)果。SD大鼠多次接觸致敏原也能產(chǎn)生抗體［7-8］，而該品系大鼠在我國最易購買，且價格相對低廉，越來越受到藥物安全評價工作者的重視和使用。此外，大鼠年齡與IgE產(chǎn)生有一定關(guān)系，1 ～2月齡大鼠多次致敏產(chǎn)生的IgE水平最高，而3 ～12月齡大鼠致敏后產(chǎn)生IgE能力顯著減?。?］。因此，本研究選用1 ～2月齡，體質(zhì)量為150 ～ 170 g的SD大鼠進行研究。

OVA比牛血清白蛋白和鑰孔血藍蛋白更易產(chǎn)生IgE抗體［5，8］。研究發(fā)現(xiàn)，使用大鼠進行PCA的前提條件是加用佐劑［8，10］。常見佐劑主要有Al（OH）3、卡介苗、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑。配制方法、實驗重復(fù)性和試劑來源等問題限制了Al（OH）3和卡介苗的使用。而Sigma等公司提供的市售弗氏完全佐劑質(zhì)量穩(wěn)定，使用方便。弗氏完全佐劑致敏大鼠后可產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫反應(yīng)。因此，本研究選用了OVA和弗氏完全佐劑進行研究。此外，盡管大鼠皮下注射和腹腔注射致敏可獲得等效的PCA結(jié)果，但腹腔注射致敏的動物由于佐劑的慢性刺激，普遍出現(xiàn)腹腔內(nèi)腸黏膜炎性粘連和體質(zhì)量下降，個別出現(xiàn)睪丸紅腫［8］。所以，本研究若采用皮下注射致敏途徑進行研究則更為可靠。

血清IgE水平與遺傳有關(guān)，受年齡、性別和種族影響［9］。本研究預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)血清T-IgE水平明顯受性別影響，雄性SD大鼠體內(nèi)的T-IgE水平較雌性高，對OVA刺激的反應(yīng)程度相近，而雌性大鼠對于OVA刺激所產(chǎn)生的IgE水平則存在明顯的個體差異。但是，雌雄大鼠受OVA刺激后所產(chǎn)生的sIgE并無明顯差異。

本研究結(jié)果表明，免疫后大鼠血清T-IgE水平和OVA-sIgE水平與過敏原的劑量無關(guān)，且同一劑量致敏后血清T-IgE水平和OVA-sIgE水平也無關(guān)聯(lián)性，這與之前的文獻報道一致［5］。這說明不能通過檢測血清T-IgE水平來預(yù)測sIgE的水平。此外，研究中也發(fā)現(xiàn)，OVA每只0.2 mg劑量致敏產(chǎn)生的致敏血清中T-IgE和OVA-sIgE雖與OVA每只1.0和5.0 mg劑量無顯著差異，但在藍斑形成能力上明顯不如后兩者。其原因可能如下：①IgE的生成量與組胺釋放量無關(guān)聯(lián)性［11］；②血清sIgE檢測的是游離sIgE，而與過敏癥狀最直接相關(guān)的是與細胞結(jié)合的sIgE。也就是說，血清sIgE水平并不能反映與細胞結(jié)合的sIgE的量。

經(jīng)過反復(fù)驗證發(fā)現(xiàn)，皮內(nèi)注射OVA后最佳的激發(fā)時間為0.5 ～3 h，藍斑形狀規(guī)則，顏色反差明顯，范圍最大。此外，過敏發(fā)生陽性率可達100%。皮內(nèi)注射6 ～48 h后再用OVA致敏原激發(fā)，則藍斑彌散，很難準(zhǔn)確測定藍斑范圍。這與之前大量的文獻報道不符。皮內(nèi)局部注射后會有一定的注射損傷，這可能會導(dǎo)致發(fā)生局部炎癥，致使血管通透性增加，產(chǎn)生假性藍斑。但是，本研究以同樣的操作重復(fù)多次，并未發(fā)現(xiàn)正常對照組大鼠出現(xiàn)藍斑。這證實了皮內(nèi)注射后0.5 ～3 h激發(fā)所出現(xiàn)的藍斑并非假陽性結(jié)果。OVA致敏大鼠后產(chǎn)生的抗體有兩種亞型，即IgE和IgGa。如是IgE，則最佳致敏期長，一般為24 ～48 h甚至更長；如是IgGa，則最佳致敏期短，一般為1.5 ～16 h［12］。OVA聯(lián)合弗氏完全佐劑致敏大鼠產(chǎn)生的抗體中，IgE會與肥大細胞或嗜堿性粒細胞膜上的特異受體結(jié)合，使機體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)相同過敏原再次進入機體，接觸到結(jié)合了IgE的肥大細胞或嗜堿性粒細胞，則后者會“脫顆粒”釋放出過敏介質(zhì)如組胺和白三烯等，從而引起血管擴張、支氣管平滑肌收縮等。因此，如是IgE介導(dǎo)的藍斑形成，則需要在皮內(nèi)致敏后24 h才能明顯出現(xiàn)。該致敏血清致敏時間與文獻報道不相符的原因可能為：①IgG也能介導(dǎo)肥大細胞脫顆粒，釋放組胺。Woolhiser等［13］通過聚合的IgG刺激人肥大細胞可引起脫顆粒。這可能也是造成T-IgE和sIgE的水平與PCA結(jié)果不平行的原因。②佐劑的選擇。Dahlb?ck等通過ip給予OVA免疫SD大鼠后僅以鋁和百日咳桿菌疫苗激發(fā)大鼠，發(fā)現(xiàn)鋁和百日咳桿菌疫苗分別通過刺激sIgE和IgG2a的產(chǎn)生增強或沉淀過敏反應(yīng)強度［14］。

綜上，對PCA進行以下條件優(yōu)化：對1 ～2月齡SD大鼠采用易產(chǎn)生抗體的給藥方法如皮內(nèi)或ip給予OVA與弗氏完全佐劑的混合乳液，隔日1次，共免疫3次；末次致敏后12 ～16 d制備致敏血清。激發(fā)采用大鼠背部皮膚皮內(nèi)注射梯度稀釋度的致敏血清0.1 mL，0.5 ～3 h后iv給予與致敏劑量相同的OVA加等體積的1%伊文思藍染料共1 mL。激發(fā)注射0.5 ～1 h后測量皮膚的藍色斑點，直徑>5 mm者為陽性。其中，“皮內(nèi)注射后最佳的激發(fā)時間為0.5 ～3 h”與現(xiàn)行傳統(tǒng)方法和文獻報道不同，能否作為預(yù)測新藥致敏性的改進方法加以推廣并應(yīng)用于新藥安全性評價尚待進一步驗證。

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Optimization of parameters of passive cutaneous anaphylaxis in rats

CHEN Wen-pei，ZHANG Zi-yang，ZHOU Cheng-hao，LIU Han，XU Tong，GUO Yu-lin，LIN Bao-qin
（School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE To optimize the parameters of passive cutaneous anaphylaxis（PCA）in rats immunized by ovalbumin（OVA）.METHODS 1-2 month-old Sprague-Dawley rats were immu?nized by ip injection of OVA（0.2，1.0 and 5.0 mg per rat）mixed with complete Freund′s adjuvant once every other day 3 times.Serum was collected on the 12th-16thdays after final immunization.Then the rats were intracutaneously injected with sensitized serum and then stimulated by iv injection of the same dose of OVA mixed with Evans blue after a latent period of 0.5，1.5，3，6，12，24，36，48 and 60 h.Finally，the diameters of blue spots in the skin were measured at stimulation.RESULTS Serumtotal-IgE（T-IgE）and OVA-specific IgE（sIgE）levels increased significantly and reached the peak on the 3rd-7thdays and 12th-16thdays after final immunization，respectively.There was no correlation between the serum T-IgE level and OVA-sIgE level when the rats were immunized with OVA at OVA 0.2-5.0 mg per rat.The rats experienced PCA after injection of OVA 1.0 and 5.0 mg per rat.Diameters of blue spots in the skin reached the maximum value after rats were sensitized for 0.5-3 h.Moreover，the shape，color and size of blue spots were better 30-60 min after stimulation.CONCLUSION Optimized PCA is as follows：1-2 month-old rats are immunized on the 1st，3rdand 5thdays by ip injection of OVA 1.0-5.0 mg.The immunizing serum is collected at 12-16 d after final immunization.The rats are stimulated by OVA and Evans blue after a latent period of 0.5-3 h.Diameters of blue spots in rats′skin are then measured 30-60 min after stimulation.

ovalbumin；typeⅠhypersensitivity；IgE；passive cutaneous anaphylaxis；rats

LIN Bao-qin，Tel：(020)39358085，E-mail：linbqcpu@126.com

R965.2

：A

：1000-3002-（2016）07-0747-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.07.007

2015-08-31接受日期：2016-06-29）

（本文編輯：齊春會）

陳文培，碩士研究生，主要從事新藥研究。

林寶琴，E-mail：linbqcpu@126.com，Tel：（020）39358085