口腔扁平苔蘚病灶中Toll樣受體4與TNF－α的表達(dá)＊

王學(xué)瑩，宋典坤

口腔扁平苔蘚病灶中Toll樣受體4與TNF－α的表達(dá)＊

王學(xué)瑩，宋典坤

目的 探討TLR4、TNF－α在口腔扁平苔蘚（OLP）發(fā)病中的可能作用。方法 采用免疫組化法檢測OLP組與正常對(duì)照組口腔黏膜蠟塊標(biāo)本中TLR4、TNF－a的表達(dá)；采用qRT－PCR法檢測TLR4的基因表達(dá)。結(jié)果OLP組中的TLR4、TNF－α蛋白及TLR4 mRNA表達(dá)均顯著高于對(duì)照組 （P＜0．05）；TNF－α蛋白與TLR4蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0．05）。結(jié)論 OLP病灶部位TLR4 mRNA表達(dá)激活，TLR4、TNF－α表達(dá)增多，與OLP局部炎癥和破壞的遷延不愈有關(guān)。

口腔扁平苔蘚；Toll樣受體4；腫瘤壞死因子α

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是一種慢性炎癥性疾病，病因不清，一般認(rèn)為是T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［1］。病理上表現(xiàn)為上皮下淋巴細(xì)胞帶狀浸潤，侵犯上皮基底細(xì)胞層，引起角質(zhì)形成細(xì)胞損傷。持續(xù)的T淋巴細(xì)胞浸潤導(dǎo)致該炎性病變遷延不愈［2］。Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）屬于模式識(shí)別受體，在固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮作用［3］。TLRs表達(dá)于多種免疫和非免疫細(xì)胞表面，識(shí)別諸如脂多糖、肽葡聚糖、脂蛋白等病原相關(guān)分子，啟動(dòng)和控制固有免疫反應(yīng)。TLRs在許多慢性炎癥性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，但其在OLP中的作用仍不明確。本研究OLP患者口腔黏膜組織中TLR4的基因表達(dá)，TLR4、TNF－α蛋白的表達(dá)，探討TLR4、TNF－α在OLP發(fā)生發(fā)展中的可能作用。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器兔抗人TLR4多克隆抗體（北京博奧森），兔抗人TNF－α多克隆抗體 （北京博奧森），小鼠超敏二步法免疫組化試劑盒pv－9002（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），RNeasy FFPE Kit（QIAGEN，German），PrimeScript RT reagent Kit（TAKARA，Japen），SYBR Premix Ex TaqTMII（TAKARA，Japen），TLR4 （引 物 序 列 F－5’－CTGGAAATATGACCACAGTCAGAA－3’，R－5’－TCAATCACCCTAGACCTGCTCAA－3’），內(nèi)參基因GAPDH（引物序列：F－5’－GCACCGTCAAGGCTG AGAAC－3’，R－5’－TGGTGAAGACGCCAGTGGA－ 3’），Light Cycler○R480 system（Roche Diagnostics，瑞士）。

1．2 材料收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院病理科2011年7月—2012年2月間病理診斷為OLP的蠟塊標(biāo)本30例（男9，女21），患者年齡22～65歲，平均（45．2±9．4）歲。其中頰黏膜20例，舌部黏膜8例，下唇黏膜1例，前庭溝黏膜1例，將30例OLP病損黏膜按病變類型分為兩組：糜爛型（16例）和非糜爛型（14例）。另取10例正?？谇火つぃ∟OM）作為對(duì)照組。

1.3 免疫組化法檢測口腔黏膜組織TLR4及TNF－α蛋白的表達(dá)采用SP法進(jìn)行免疫組化染色。TLR4抗體工作濃度1∶100，TNF－α抗體工作濃度1∶50，以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒顯色，蘇木素輕度復(fù)染，系列乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：采用著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率綜合分析法。著色強(qiáng)度計(jì)分：按陽性細(xì)胞著色無、弱（淡黃）、中（棕黃）、強(qiáng)（棕褐）分別計(jì)0、1、2、3分；每例對(duì)象切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野觀察，按陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例計(jì)分：0%～10%、11%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，分別計(jì)0、1、2、3、4分。按上述兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)之和分級(jí)作為表達(dá)強(qiáng)度：0～1分為（－）；2～3分為弱陽性（+）；4～5分為中等陽性（++）；6～7分為強(qiáng)陽性（+++）。

1．4 qRT－PCR法檢測蠟塊標(biāo)本中TLR4的基因表達(dá)每個(gè)組織蠟塊按RNeasy FFPE Kit說明書要求切片并提取總RNA，并測濃度和純度?？俁NA根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit要求步驟逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMII要求配置PCR反應(yīng)液，應(yīng)用LightCycler○ R480 system擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，內(nèi)參基因GAPDH與待測基因同批擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的Ct值，以2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。免疫組化表達(dá)結(jié)果采用等級(jí)資料成組Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，多組間的表達(dá)采用Kruskal－Wallis秩和檢驗(yàn)。TLR4 mRNA的表達(dá)為計(jì)量資料，以±s表示，采用成組t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；相關(guān)關(guān)系采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，P≤0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 TLR4、TNF－α免疫組化染色TLR4蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和／或細(xì)胞核，呈黃色或棕黃色顆粒。在NOM組中，TLR4只表達(dá)與上皮基底層，表達(dá)強(qiáng)度明顯弱于OLP組織，陽性率20%（2／10）；在OLP組織中，TLR4表達(dá)強(qiáng)度由基底層、棘細(xì)胞層、顆粒層、角質(zhì)層逐漸減弱，黏膜下層TLR4表達(dá)較上皮層減弱，表達(dá)于浸潤的淋巴細(xì)胞，陽性率為90%（27／30），其中，糜爛型陽性率100%，非糜爛型78．6%。OLP組的TLR4蛋白表達(dá)強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組（P＝0．000），糜爛型OLP組織TLR4表達(dá)強(qiáng)度陽性率顯著高于非糜爛型OLP組織（P＝0．005），見表1及圖1。

表1 TLR4免疫組化結(jié)果

圖1 TLR4蛋白在各組中的表達(dá)（×100）

TNF－α蛋白表達(dá)于口腔黏膜角質(zhì)形成細(xì)胞和炎性浸潤細(xì)胞，定位于細(xì)胞質(zhì)，其在NOM組中上皮全層均有散在表達(dá)，陽性率20%（2／10）；在OLP組中，TNF－α表達(dá)于上皮基底細(xì)胞層、棘層及浸潤淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，陽性率為90%（27／30），其中，糜爛型陽性率100%，非糜爛型78．6%。OLP組的TNF－α蛋白表達(dá)強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組 （P＝0．000），但兩型之間則無顯著性差異（P＝0．229），見表2及圖2。

表2 TNF－α免疫組化結(jié)果

圖2 TNF－α蛋白在各組中的表達(dá)（×100）

2．2 TLR4的mRNA表達(dá)經(jīng)單因素方差分析，NOM組TLR4mRNA表達(dá)低于非糜爛型OLP組、糜爛型OLP組（P＝0．000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而經(jīng)成組 t檢驗(yàn)，OLP組中糜爛型和非糜爛型 TLR4 mRNA的表達(dá)無明顯差異（P＝0．153）。見圖3。

圖3 TLR4 mRNA在各組的表達(dá)

2．3 TLR4與TNF－α表達(dá)的相關(guān)分析經(jīng)Spearman相關(guān)分析，TLR4蛋白表達(dá)與TLR4mRNA呈正相關(guān)（r＝0．575，P＝0．000），相關(guān)性一般；TLR4蛋白表達(dá)與TNF－α的表達(dá)顯著正相關(guān)（r＝0．836，P＜0．05）。

3 討論

目前，TLRs被認(rèn)為參與自身免疫性疾病以及肺、腎、胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病乃至癌癥的發(fā)生發(fā)展，其介導(dǎo)的上皮免疫反應(yīng)在結(jié)腸炎、牛皮癬、扁平苔蘚、復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍的等其他上皮的慢性炎癥中起著重要作用［4，5］。TLRs能識(shí)別微生物的特異性分子結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致炎癥因子和／或INF－I的增多。而不同的TLRs識(shí)別不同的微生物特異性分子結(jié)構(gòu)，如本研究涉及的TLR4能識(shí)別革蘭陰性菌LPS?？谇槐旧砭哂袕?fù)雜的微生物環(huán)境，TLR4可表達(dá)于原代培養(yǎng)的牙齦上皮細(xì)胞、健康牙齦和牙周炎的牙齦上皮、結(jié)締組織，其表達(dá)強(qiáng)度與炎癥程度正相關(guān)［6，7］。正常情況下，口腔黏膜受到一系列模式識(shí)別受體所介導(dǎo)的精確調(diào)節(jié)反應(yīng)保護(hù)，防止?jié)撛谕{入侵。革蘭陰性菌在OLP病灶部位顯著增多［8］，能識(shí)別LPS的TLR4表達(dá)也相應(yīng)增多。Yana的研究發(fā)現(xiàn)OLP組織中，TLR4的免疫組化陽性率較正常組織顯著增高［9］，在LPS誘導(dǎo)建立的OLP細(xì)胞模型中，TLR4的基因和蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)。Siponen的研究也證實(shí)了，TLR4在OLP組織中表達(dá)顯著增高，特別是在萎縮糜爛型中，基底層較中間層、表層及黏膜下炎癥浸潤層顯著增高［10］。Janarhanam等除了證實(shí)了OLP病灶TLR4的高表達(dá)，還發(fā)現(xiàn)OLP患者口腔脫落上皮細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)較正常細(xì)胞增高［11］。同樣，該研究OLP病灶中TLR4 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，TLR4蛋白的表達(dá)較正常組明顯增多，可見，TLR4通過識(shí)別病原分子，誘發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致OLP的發(fā)生。

TNF－α作為一種受NF－κB調(diào)控的細(xì)胞因子［12］，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生黏附分子、趨化分子，引導(dǎo)T淋巴細(xì)胞從血管內(nèi)游出，參與炎癥反應(yīng)。NF－κB信號(hào)通路的激活是TLR4調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［13］。許野等［14］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在OLP病灶中TLR4與NF－κB p65的蛋白協(xié)同表達(dá)，提出TLR4通過對(duì)NF－κB p65的正向調(diào)節(jié)，參與OLP的病理過程。宋典坤等［15］的研究也發(fā)現(xiàn)NF－κB p65在OLP組中的表達(dá)明顯高于NOM組，陽性染色定位于棘細(xì)胞、基底層細(xì)胞及固有層淋巴細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核，與本研究中TNF－α、TLR4陽性表達(dá)位置一致。綜合上述研究及本研究結(jié)果可推測：OLP病灶部位增多的革蘭陰性菌和脫落上皮激活了OLP部位TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄，TLR4蛋白相應(yīng)表達(dá)增多，識(shí)別病原相關(guān)分子，與相應(yīng)受體結(jié)合，啟動(dòng)和激活NF－κB通路，促進(jìn)TNF－α表達(dá)增多，而TNF－α的大量表達(dá)產(chǎn)生，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞浸潤基底層，而增多的T淋巴細(xì)胞又分泌TNF－α，導(dǎo)致黏膜局部炎癥和破壞的發(fā)生和遷延不愈。

現(xiàn)有對(duì)OLP基因表達(dá)的研究多采用新鮮取材的標(biāo)本，但活檢并不是OLP診斷的必須手段，從而限制了這類研究的樣本量。本研究探索性地以商品化的試劑盒提取既往的石蠟包埋組織蠟塊中的RNA進(jìn)行TLR4基因表達(dá)的研究，可測得總的mRNA表達(dá)量，為OLP的研究提供了新的方法。OLP由于病因不清，尚無有效的治療方法。而本研究發(fā)現(xiàn)TLR4可能參與OLP發(fā)病的啟動(dòng)環(huán)節(jié)，對(duì)TLR4－NF－κB p65－TNF－α這一通路的監(jiān)測和抑制，有望成為OLP診斷和治療的新方向。

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［2015-10-15收稿，2015-11-14修回］

［本文編輯：韓仲琪］

The expression of Toll like receptor 4 and TNF－α signal pathway in oral lichen planus lesion

WANG Xue-ying，SONG Dian-kun.
Fujian Medical University Union Hospital，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350001，China

Objective To investigate the possible role of TLR4 and TNF－α in OLP．Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of TLR4，TNF－α in the oral mocusa of patients with OLP and normal oral mucosa （control group），respectively．Quantitative real－time PCR was used to detect the expression of mRNA of TLR4．ResultsThe IHC expression of TLR4，TNF－α in OLP was significantly stronger than those in control group（P＜0．05），TLR4 mRNA expression did so．There was positive correlation between the expression of TNF－α and TLR4（P＜0．05）．ConclusionThe high expression and activation of TLR4 and increased expression of TNF－α may have some relation to long－lasting inflammation and destruction in the lesion of OLP．

Oral lichen planus（OLP）；Toll like receptor 4；Tumor necrosis factor－α

R781．31

A

10.14172/j.issn1671-4008.2016.04.019

福建省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2013J01314）

350001福建福州，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院（王學(xué)瑩，宋典坤）