絲裂霉素C作為瓊脂擴(kuò)散法細(xì)胞毒性試驗(yàn)陽性對(duì)照材料的探討

賈 璇，王 蕊，史建峰，賀學(xué)英

1 北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，北京市，101111

2 醫(yī)療器械檢驗(yàn)與安全性評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市，101111

絲裂霉素C作為瓊脂擴(kuò)散法細(xì)胞毒性試驗(yàn)陽性對(duì)照材料的探討

【作 者】賈 璇1,2，王 蕊1,2，史建峰1,2，賀學(xué)英1,2

1 北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，北京市，101111

2 醫(yī)療器械檢驗(yàn)與安全性評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市，101111

目的 為細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法——瓊脂擴(kuò)散法探尋具有適度細(xì)胞毒性、揮發(fā)性小且易于獲取的陽性對(duì)照材料。方法 按照ISO 10993.5-2009與YY/T 0127.9-2001規(guī)定的瓊脂擴(kuò)散法，使用L-929細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)至近匯合單層細(xì)胞，倒入瓊脂并用中性紅溶液染色，絲裂霉素C作為試驗(yàn)材料進(jìn)行試驗(yàn)，樣品濃度分別為2 mg/mL、1 mg/mL與0.5 mg/mL。結(jié)果2 mg/mL絲裂霉素C組毒性分級(jí)為3級(jí)；1 mg/mL絲裂霉素C組毒性分級(jí)為3級(jí)；0.5 mg/mL絲裂霉素C組毒性分級(jí)為2級(jí)。結(jié)論 2 mg/mL濃度的絲裂霉素C可作為瓊脂擴(kuò)散法評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性時(shí)的陽性對(duì)照材料。

瓊脂擴(kuò)散法；細(xì)胞毒性；絲裂霉素C； 陽性對(duì)照材料

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)是一種常用的體外毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，由于其成本低廉、試驗(yàn)周期短、通用性好，而廣泛應(yīng)用于醫(yī)療器械的毒性評(píng)價(jià)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)按照方法的不同可分為浸提液試驗(yàn)、直接接觸試驗(yàn)、間接接觸試驗(yàn)三類[1]，其中，瓊脂擴(kuò)散法作為間接接觸試驗(yàn)中的一種，多應(yīng)用于齒科材料的檢測[2]。目前常用的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)陽性對(duì)照材料為苯酚稀釋液，但苯酚具有揮發(fā)性，會(huì)對(duì)試驗(yàn)操作者帶來危害，且苯酚細(xì)胞毒性大、在瓊脂中擴(kuò)散性過強(qiáng)，使得同一平皿中的不同樣品放置點(diǎn)會(huì)存在干擾。絲裂霉素c(Mytomycin c，MMc)是一種高效抗腫瘤化療藥物，具細(xì)胞毒性、水溶性較好、揮發(fā)性小[3-4]、價(jià)格相對(duì)低廉且不與瓊脂反應(yīng)的特點(diǎn)。因此，我們以絲裂霉素c為試驗(yàn)樣品，探討其作為瓊脂擴(kuò)散法細(xì)胞毒性試驗(yàn)陽性對(duì)照材料的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

(1) 細(xì)胞株：L-929細(xì)胞（aTcc）

(2)試劑：胎牛血清(天津康源生物技術(shù)有限公司)、MeM培養(yǎng)基(coRNING)、2×RPMI 1640(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)、胰酶/eDTa(Gibco)、瓊脂(鼎國)、中性紅(Solarbio Life Sciences china)、注射用水(石家莊四藥有限公司)。

3 g瓊脂溶于100 mL蒸餾水制成3%瓊脂溶液，高壓蒸汽滅菌后冷卻至48oc，將1份瓊脂與1份預(yù)熱至48oc的2×培養(yǎng)液混合，使培養(yǎng)基的最終濃度為1×培養(yǎng)基。

配制1%的中性紅水溶液，用磁力攪拌器攪拌1 h后，濾紙過濾，高壓消毒，2oc～8oc避光保存，使用前，用0.01 mol/L的PBS稀釋100倍成為0.01%中性紅染液。

(3) 對(duì)照材料：陰性對(duì)照為氯化鈉注射液（華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司）；陽性對(duì)照為苯酚（北京化學(xué)試劑公司）溶液，用蒸餾水配制20%苯酚溶液，過濾除菌。

(4) 試驗(yàn)樣品絲裂霉素c(sigma)，加入注射用水后分別配制成2 mg/mL、1 mg/mL與0.5 mg/mL的溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1) 將配制好的2.5×105U/mL細(xì)胞懸液接種于直徑90 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿加入10 mL，水平轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻分散，置co2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，形成近匯合單層細(xì)胞。

(2) 棄去培養(yǎng)液，將配制好的瓊脂培養(yǎng)基10 mL沿培養(yǎng)皿壁加入皿內(nèi)，水平轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使瓊脂培養(yǎng)基分布均勻并在室溫下凝固。每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)加入10 mL中性紅染液，置培養(yǎng)箱37oc避光保持15 min后棄去多余染液。

(3) 分別吸取0.01 mL樣品或?qū)φ詹牧先芤?，加于直徑? mm圓形濾紙片中，將濾紙片放置在瓊脂表面。將培養(yǎng)皿置co2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

(4) 置顯微鏡下觀察試樣周圍及下方的細(xì)胞反應(yīng)區(qū)域是否有溶解及褪色現(xiàn)象。參照表1進(jìn)行結(jié)果判定。

表1 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)Tab.1 Reactivety grades for agar diffusion test

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下可明顯看到陽性對(duì)照材料20%苯酚溶液試樣下面及周邊反應(yīng)區(qū)域超出試樣1.0 cm以上，細(xì)胞溶解率大于80%。陰性對(duì)照材料氯化鈉注射液試樣周圍和試樣下方未觀察到反應(yīng)區(qū)域。2 mg/mL絲裂霉素c組反應(yīng)區(qū)域邊緣距試樣邊緣大于5.0 mm小于10.0 mm，細(xì)胞溶解率大于60%小于80%，毒性分級(jí)為3級(jí)；1 mg/mL絲裂霉素c組反應(yīng)區(qū)域邊緣距試樣邊緣小于5.0 mm，細(xì)胞溶解度大于20%小于40%，毒性分級(jí)為3級(jí)；0.5 mg/mL絲裂霉素c組反應(yīng)區(qū)域局限在試樣下方范圍，細(xì)胞溶解度小于20%，毒性分級(jí)為2級(jí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 瓊脂擴(kuò)散法樣品細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)結(jié)果Tab. 2 Results of the agar diffusion tests

3 討論

瓊脂擴(kuò)散法是一種半定量的細(xì)胞生物學(xué)方法，由于它具有快速、簡便、價(jià)廉、靈敏的特點(diǎn)，便于推廣應(yīng)用，長期以來被廣泛應(yīng)用并被ISo和各國標(biāo)準(zhǔn)化組織定為生物材料細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法。尤其適用于牙科充填材料的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，含有血清的瓊脂覆蓋層具有模仿牙本質(zhì)層的仿生學(xué)特征[5]。而陽性材料則是指按既定的方法進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)可重現(xiàn)細(xì)胞毒性反應(yīng)的材料，其目的是驗(yàn)證相應(yīng)試驗(yàn)系統(tǒng)的反應(yīng)。由于瓊脂擴(kuò)散法系統(tǒng)本身的局限性，陽性對(duì)照材料不能選擇無法通過瓊脂層擴(kuò)散的可瀝濾物或與瓊脂反應(yīng)的物質(zhì)；瓊脂擴(kuò)散法細(xì)胞毒性結(jié)果的評(píng)定是通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化及褪色范圍的大小，受主觀影響大，只能得到半定量化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此陽性材料宜選擇細(xì)胞毒性反應(yīng)級(jí)別大于2級(jí)的材料，以得到明確的結(jié)果?？紤]到實(shí)際的試驗(yàn)過程，陽性材料還需具有溶解性好、價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定、易于獲取等特點(diǎn)。

絲裂霉素c是從頭狀鏈霉菌培養(yǎng)液中分離提取的一種廣譜抗腫瘤抗生素，對(duì)多種癌癥有抗癌作用。絲裂霉素c可使細(xì)胞的DNa解聚，同時(shí)阻礙DNa的復(fù)制，從而抑制腫瘤細(xì)胞分裂，細(xì)胞毒性較強(qiáng)[6]，相對(duì)分子量為334.327，溶解性好，固體狀態(tài)性質(zhì)穩(wěn)定，較為容易獲取，可通過瓊脂層擴(kuò)散且不與瓊脂反應(yīng)，具有作為瓊脂擴(kuò)散法細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的前提條件。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，三種濃度的絲裂霉素c均呈現(xiàn)細(xì)胞毒性，且具有一定的量效關(guān)系。其中2 mg/mL濃度組褪色區(qū)邊緣距試樣邊緣大于5.0 mm小于10.0 mm，褪色區(qū)域明顯，易于觀察到；在直徑為90 mm培養(yǎng)皿中，不同褪色區(qū)域相互之間不會(huì)接觸或重疊；該組細(xì)胞溶解度大于60%小于80%，光學(xué)顯微鏡下可以觀察到明顯的陽性反應(yīng)。1 mg/mL濃度的絲裂霉素c為中度毒性，但其反應(yīng)區(qū)域面積小于2 mg/mL濃度組，考慮到試驗(yàn)操作的可行性，及絲裂霉素c本身的價(jià)格相對(duì)低廉，可認(rèn)為1 mg/mL濃度的絲裂霉素c作為陽性對(duì)照品的效果不及2 mg/mL組；0.5 mg/mL濃度的絲裂霉素c僅具有輕度細(xì)胞毒性，不適于作為陽性材料。

綜上所述，2 mg/mL的絲裂霉素c可作為瓊脂擴(kuò)散法細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)的陽性材料。但需要注意的是，絲裂霉素c在水溶液狀態(tài)下并不不穩(wěn)定，試驗(yàn)時(shí)需要即用即配。

[1] ISo. ISo 10993-5: 2009 Biological evaluation of medical devices --Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity[S].

[2] 國家食品藥品監(jiān)督管理局. YY/T 0127.9-2009 口腔醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第二單元: 試驗(yàn)方法 細(xì)胞毒性試驗(yàn): 瓊脂擴(kuò)散法及濾膜擴(kuò)散法[S].

[3] 曲秋蓮, 張英鴿, 楊留中, 等. 納米活性炭吸附絲裂霉素c腹腔化療的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華腫瘤雜志, 2006, 28(4): 257-260.

[4] 王堅(jiān), 林茂, 吳平, 等. 絲裂霉素c與表達(dá)Smac/DIaBLo的腫瘤靶向腺相關(guān)病毒聯(lián)用對(duì)抗惡性黑色素瘤的效果[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2012, 33(4): 460-465.

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Study on the Applicability of Mytomycin C as a Positive Control Material for Agar Diffusion Cytotoxicity Test

【 Writers 】JIA Xuan1,2, WANG Rui1,2, SHI Jianfeng1,2, HE Xueying1,2
1 Beijing Institute of Medical Device Testing, Beijing, 101111
2 Beijing Key Laboratory of Medical Device Control, Beijing, 101111

agar diffusion, cytotoxicity, Mytomycin C, positive control material

R114

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2016.03.014

1671-7104(2016)03-0209-03

2015-12-04

賀學(xué)英，e-mail: hexueying@bimt.org.cn

【 Abstract 】Objective To find a non-volatile positive material control which showed moderately or severely cytotoxic and could be obtained easily. Methods The in vitro cytotoxicity study was conducted according to the agar diffusion method in ISO 10993.5-2009 and YY/T 0127.9-2001. Each sample was placed in contacted with the surface of an agar layer overlaying a monolayer of L-929 Mouse Fibroblast cells which were stained with neutral red vital stain at the bottom of the plate. As the sample, Mytomycin C was diluted to 2 mg/mL, 1 mg/mL and 0.5 mg/mL. Results In the group of 2 mg/mL Mytomycin C, it was observed that the cytotoxicity grade was 3. In the group of 1 mg/mL Mytomycin C, it was observed that the cytotoxicity grade was 3. In the group of 0.5 mg/mL Mytomycin C, it was observed that the cytotoxicity grade was 2. Conclusion 2 mg/mL Mytomycin C could be used as a positive material control of agar diffusion.