豬霍亂沙門菌菌蛻的制備及免疫保護(hù)效力研究

單曉楓，陳龍，李茂輝，康元環(huán)，孫武文，張偉，錢愛東

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

豬霍亂沙門菌菌蛻的制備及免疫保護(hù)效力研究

單曉楓，陳龍，李茂輝，康元環(huán)，孫武文，張偉，錢愛東*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

為制備豬霍亂沙門菌菌蛻并研究其免疫保護(hù)效力，克隆噬菌體phiX174裂解基因E，與pBV220連接，構(gòu)建溫控溶菌表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)入豬霍亂沙門菌TTB1中，制備菌蛻并對(duì)其裂解率、安全性以及對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效力進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：成功克隆了裂解基因E、片段大小274bp，構(gòu)建了溫控溶菌質(zhì)粒載體pBVE，制備了豬霍亂沙門菌菌蛻，其裂解率最高為99.46%、經(jīng)凍干滅活殘余活菌，安全性試驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)其安全后，對(duì)小鼠進(jìn)行了免疫保護(hù)試驗(yàn)，其保護(hù)率為70%、與弗氏佐劑滅活苗保護(hù)率相當(dāng)、優(yōu)于甲醛滅活苗。研究為豬霍亂沙門菌感染的防治奠定了基礎(chǔ)。

豬霍亂沙門菌；菌蛻；免疫保護(hù)效力；裂解基因E；裂解效率

豬霍亂沙門菌(Salmonellacholeraesuis)是沙門菌屬的一個(gè)代表種，其可以感染2～4月齡的仔豬，引起敗血癥計(jì)腸炎，是仔豬副傷寒的主要病原菌之一[1-2]。此外，該菌也侵害其他動(dòng)物，還引起人類的食物中毒、傷寒、敗血癥等，是典型的人獸共患病原菌[3-4]。預(yù)防豬霍亂沙門菌感染的有效手段是疫苗接種，目前，國(guó)內(nèi)已有減毒疫苗使用[5]，但減毒活疫苗存在毒力返強(qiáng)以及與野毒株發(fā)生重組而出現(xiàn)新毒菌株的危險(xiǎn)。

菌蛻(bacterial ghost)是近年來新發(fā)展起來的一種新型死菌苗，其一般是由phiX174噬菌體的裂解蛋白E，在格蘭陰性菌表面形成一種特異性跨膜通道，胞內(nèi)物質(zhì)通過通道排出，從而形成一個(gè)菌體完好、表面抗原結(jié)構(gòu)完整的細(xì)菌空殼[6]。由于菌蛻的各種表面抗原結(jié)構(gòu)完整，因此具有良好的免疫原性；而且，抗原蛋白、核酸等均可導(dǎo)入菌蛻中，因此菌蛻是良好的遞送系統(tǒng)具有很好的佐劑功能[7-8]。

目前，我國(guó)沙門菌菌蛻的研究并不多見[9-10]，而有關(guān)豬霍亂沙門菌菌蛻的研究更未見報(bào)道，鑒于此，研究通過構(gòu)建豬霍亂沙門菌菌蛻，并對(duì)其免疫保護(hù)效力進(jìn)行研究，為豬霍亂沙門菌引發(fā)疾病的預(yù)防奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 豬霍亂沙門菌TTB1，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離并保存；大腸桿菌DH5α,全式金公司；pBV220,上海北諾生物科技有限公司；大腸桿菌噬菌體phiX174 RFI DNA,BioLabs公司。

1.2 主要試劑 ExTaq DNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶(PstI和BamHⅠ)、T4連接酶、pMD18-T載體等,TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、氨芐西林(Amp)、膠回收試劑盒,北京索萊寶生物公司；其余均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 裂解基因E的克隆 依據(jù)phiX174 RFI裂解基因E序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物：P1： GGATCCATGGTACGCTGGACTTTG(下劃線為限制性酶切位點(diǎn)BamHI)、P2：CTGCAGTCACTCCTTCTGCACGTA(下劃線為限制性酶切位點(diǎn)PstI)，并送至華大基因公司合成。

以phiX174 RFI基因組為模板，PCR擴(kuò)增裂解基因E，擴(kuò)增條件為：94℃ 4min，94℃1min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，30循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收，與pMD18-T載體16℃連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18T-E，轉(zhuǎn)入DH5α，經(jīng)PCR及雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆送至華大基因公司測(cè)序。

1.4 溶菌質(zhì)粒載體的構(gòu)建 用PstI和BamHⅠ雙酶切pMD18T-E與pBV220質(zhì)粒，酶切反應(yīng)條件：37℃ 2h、30℃ 2 h，分別回收目的片段，16℃連接過夜，并轉(zhuǎn)化至DH5α內(nèi)，PCR鑒定，陽(yáng)性者送至華大基因公司測(cè)序，并將重組質(zhì)粒命名為pBVE。

1.5 豬霍亂沙門菌菌蛻的制備 將溶菌質(zhì)粒pBVE轉(zhuǎn)化入自制的豬霍亂沙門菌感受態(tài)細(xì)胞中，Amp抗性篩選，挑取白色菌落接種于5 mL含Amp的液體LB培養(yǎng)基中，28℃過夜，提取質(zhì)粒，PCR鑒定，陽(yáng)性克隆繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，并于次日取100 μL轉(zhuǎn)至50 mL液體LB中，28℃ 170 r/min，培養(yǎng)至OD600為0.4時(shí)，升溫42℃，誘導(dǎo)6 h，測(cè)定OD600及活菌數(shù)，以此觀察裂解效果。

1.6 裂解率測(cè)定及電鏡觀察 分別計(jì)算42℃誘導(dǎo)前后的活菌數(shù)，依據(jù)公式：裂解率=(1-誘導(dǎo)后CFU/誘導(dǎo)前CFU)×100%，計(jì)算裂解率。

將收集的菌蛻按參考文獻(xiàn)[9]方法處理，并使用掃描電鏡觀察。

1.7 菌蛻安全性試驗(yàn) 將制備的豬霍亂沙門菌菌蛻經(jīng)凍干處理，以破壞活菌菌體，經(jīng)無菌檢驗(yàn)合格，免疫注射健康小鼠10只，每只1.0 mL。連續(xù)觀察14 d小鼠健康狀況，同時(shí)設(shè)PBS作為對(duì)照。

1.8 菌蛻免疫保護(hù)效力實(shí)驗(yàn) 分別制備豬霍亂沙門菌的甲醛滅活苗、弗氏佐劑滅活苗，并無菌檢驗(yàn)。

將120只6～8周齡昆明鼠隨機(jī)分為滅活組、滅佐組、菌蛻B(tài)G組、PBS組等4組，30只/組。其中，滅活組、滅佐組、菌蛻B(tài)G組免疫劑量為1×108CFU/只，PBS組每只注射200 μL無菌PBS。共分為3免、兩周免疫1次。將三免后的小鼠分別感染豬霍亂沙門菌TTB1，5×108CFU/只，連續(xù)觀察14 d，記錄并計(jì)算免疫保護(hù)率。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體phiX174裂解基因E的克隆 以phiX174基因組為模板，PCR擴(kuò)增裂解基因E，電泳結(jié)果顯示：在300 bp左右有目的條帶(圖1)連接pMD18-T，構(gòu)建pMD18T-E，經(jīng)雙酶切與PCR鑒定，陽(yáng)性克隆者測(cè)序，結(jié)果顯示擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)274 bp，經(jīng)比對(duì)，與phiX174裂解基因E同源性為100%。

M:DL2000 ;1:裂解基因E; 2:陰性對(duì)照?qǐng)D1 裂解基因E PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 溶菌質(zhì)粒載體的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒pBVE雙酶切，并電泳檢測(cè)，其出現(xiàn)兩條目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。溫控溶菌質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。

2.3 豬霍亂沙門菌菌蛻株的鑒定

pBVE轉(zhuǎn)化至豬霍亂沙門菌感受態(tài)細(xì)胞中，Amp抗性篩選，出現(xiàn)白色單個(gè)菌落(圖3)，挑取并擴(kuò)增培養(yǎng)，PCR鑒定，出現(xiàn)目的條帶，菌蛻株制備成功。將菌蛻株28℃ 170 r/min培養(yǎng)至OD6000.4時(shí)，開始42℃誘導(dǎo)6 h，其OD600值上升、單活菌數(shù)下降。

2.4 裂解率的測(cè)定與掃描電鏡觀察 通過活菌計(jì)數(shù)，誘導(dǎo)前活菌數(shù)為6.1×107CFU/mL，誘導(dǎo)后活菌數(shù)為3.3×105CFU/mL，依據(jù)公式，裂解率為99.46%。凍干處理后，無活菌存在。

經(jīng)掃描電鏡觀察，溶菌孔道位于細(xì)菌的兩端，有大量?jī)?nèi)容物排出，細(xì)菌形態(tài)基本沒有改變，但有明顯皺縮(圖4)。

M:DL 5000 ;1:質(zhì)粒pBVE雙酶切鑒定圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pBVE酶切鑒定結(jié)果

圖3 沙門氏菌重組菌株生長(zhǎng)結(jié)果圖

圖4 豬霍亂沙門菌TTB1菌蛻掃描電鏡圖片(20000×)

2.5 菌蛻安全性與免疫保護(hù)效力試驗(yàn) 將菌蛻與PBS分別免疫小鼠，二組小鼠在一周內(nèi)均出現(xiàn)體重略有下降、一周后恢復(fù)正常的現(xiàn)象，其余無臨床異常現(xiàn)象。

用豬霍亂沙門菌TBB1對(duì)免疫后的小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果顯示：菌蛻B(tài)G組、甲醛滅活組、佐劑滅活組的保護(hù)率分別是：70%、60%、70%，PBS對(duì)照組發(fā)病死亡。

3 討論

菌蛻是革蘭陰性菌以物理化學(xué)方法制備的細(xì)菌空殼，其有多種制備方法。本研究是以溫控表達(dá)系統(tǒng)控制phiX174裂解基因E的表達(dá)，在42℃發(fā)揮最大裂解效應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)豬霍亂沙門菌的裂解，進(jìn)而制備菌蛻。

通過前期試驗(yàn)摸索，當(dāng)沙門菌28℃生長(zhǎng)至OD600為0.4左右時(shí)，開始42℃誘導(dǎo)，可達(dá)到理想效果，但如果大于0.4，則裂解效率較低。因此，本實(shí)驗(yàn)在沙門菌28℃生長(zhǎng)至OD600為0.4左右時(shí)42℃誘導(dǎo)6 h，裂解效率最高可達(dá)99.46%。但在誘導(dǎo)7 h甚至更長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，仍可檢測(cè)到活菌存在，這與溫晶、呂敏娜等[10-11]研究結(jié)果類似。而未被裂解的活菌蛻株膜上存有裂解E蛋白，如果進(jìn)行無保護(hù)劑的凍干，其要比沒有攜帶E蛋白的菌株更易破裂[12]，因此，為保證菌蛻使用的安全性，本研究采用凍干法將殘余活菌滅活。

在正式免疫試驗(yàn)之前，本研究對(duì)菌蛻以及其他2種疫苗進(jìn)行動(dòng)物安全性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，三種疫苗均安全可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。而在安全性試驗(yàn)中，所有免疫小鼠(包括PBS組)均出現(xiàn)體重暫時(shí)下降，而后有恢復(fù)正常，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與免疫注射產(chǎn)生的應(yīng)激有一定關(guān)聯(lián)。雖然免疫保護(hù)效力試驗(yàn)顯示，菌蛻組與佐劑滅活苗組的免疫保護(hù)效力相當(dāng)，但是菌蛻不含有甲醛、對(duì)機(jī)體沒有不良刺激，且菌蛻有佐劑功能、沒有遺傳物質(zhì)[13-15]，因此，菌蛻與傳統(tǒng)疫苗相比，其生物安全性更高，具有更好的應(yīng)用前景。

本研究成功的構(gòu)建了溫控溶菌質(zhì)粒載體pBVE，制備了豬霍亂沙門菌菌蛻，小鼠試驗(yàn)表明，其具有一定的保護(hù)力。研究為豬霍亂沙門菌菌蛻的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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(編輯：陳希)

Preparation and Immune Efficacy ofSalmonellacholeraesuisGhost

SHAN Xiao-feng，CHEN Long，LI Mao-hui，KANG Yuan-huan，SUN Wu-wen，ZHANG Wei，QIAN Ai-dong*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

In order to develop aSalmonellacholeraesuisbacterial ghost vaccine and investigate its protective immunity. This study, we cloned the lysis gene E from phage phiX174 and inserted into an temperature-induced expression plasmid pBV220 vector,and then wastransformed intoSalmonellaTTB1.We created theSalmonellacholeraesuisghost and studied its lytic efficiency and protective immunity. The results showed that the lysisgene E about 274 bp was clone, the temperature-induced lytic plasmid pBVE andSalmonellacholeraesuisbacterial ghost were created.The lysis rate can be 99.46%and no life bacteria survived after freeze drying, The results of protective immunity showed thatSalmonellaghost group providethe protection rate of 70%, The protection rate ofplasmid-typeSalmonellaghost vaccine strain was comparable with that ofSalmonellainactivated vaccine with adjuvant, which was better than that of the inactivated vaccine. The research provides a foundation for the prevention and treatment of diseases caused bySalmonellacholeraesuis.

Salmonellacholeraesuis; bacterial ghost; protective immunity; lysis gene E; lysis efficiency

吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目(201634)

單曉楓，博士，副教授，從事動(dòng)物細(xì)菌學(xué)方面的研究；陳龍，博士研究生，從事動(dòng)物分子細(xì)菌學(xué)方面研究，與單曉楓為共同第一作者。

錢愛東。E-mail: qianaidong0115@163.com

2016-07-15

A

1002-1280 (2016) 09-0022-04

S852.61