三種不同滅活方法對新城疫病毒血凝和RT-PCR試驗結果的影響

陳羽琪，南文龍，秦立得，鞏明霞，張悅勇，陳義平

(1．中國動物衛(wèi)生與流行病學中心診斷試劑研究室，山東青島 266032；2.西交利物浦大學生物科學系，江蘇蘇州 215123)

三種不同滅活方法對新城疫病毒血凝和RT-PCR試驗結果的影響

陳羽琪1,2，南文龍1，秦立得1，鞏明霞1，張悅勇1，陳義平1

(1．中國動物衛(wèi)生與流行病學中心診斷試劑研究室，山東青島 266032；2.西交利物浦大學生物科學系，江蘇蘇州 215123)

為研究熱滅活、甲醛、β-丙內酯(BPL)三種不同滅活方法對新城疫病毒(NDV)血凝和RT-PCR試驗結果的影響，將收獲的NDV雞胚尿囊液分別用濃度為0.1%～0.5%的甲醛37 ℃滅活24 h或4 ℃滅活48 h、濃度為0.02%～0.2%的BPL 37 ℃滅活9 h、60 ℃熱滅活30～90 min，并于滅活前后進行血凝試驗和RT-PCR檢測。結果表明，用0.02%的BPL 37 ℃滅活9 h或0.1%的甲醛4 ℃滅活48 h，不影響NDV的血凝價；采用熱滅活30 min或0.02%的BPL 37 ℃滅活9 h，不影響NDV核酸檢測。本研究可為相關病原檢測以及診斷制品制備過程中滅活方法的選擇提供參考。

新城疫病毒；滅活；血凝；RT-PCR

在動物疫病檢測時，為確保生物安全，常需對臨床樣品或分離培養(yǎng)的病原微生物進行滅活處理。滅活也是動物疫病診斷制品制備過程中的重要環(huán)節(jié)，通過滅活可有效消除制品在使用過程中潛在的病原擴散風險。常用的物理滅活方法包括熱、超聲波、紫外線和γ-射線等，化學滅活方法包括甲醛、戊二醛、β-丙內酯(beta-propiolactone, BPL)、二乙烯亞胺、鹽酸聚六亞甲基胍等[1]。不同處理方法的滅活原理不同，滅活時對病原微生物組分(如蛋白、核酸等)造成的破壞也有所差異。滅活后，進行疫病檢測分析時，其檢測結果與滅活前相比會受到不同程度的影響。本研究以新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)為模型，分別研究熱、甲醛及BPL這3種常用滅活方法對其血凝(HA)和RT-PCR試驗結果的影響，以期為相關病原檢測及診斷制品制備過程中滅活方法的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 NDV La Sota株，由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心提供；10日齡SPF雞胚，購于濟南斯帕法斯家禽有限公司；甲醛購自國藥集團化學試劑有限公司；BPL購自Serva公司；病毒RNA提取試劑盒購自康為世紀公司；TransScript II One-Step RT-PCR SuperMix檢測試劑盒購自全式金公司。

1.2 病毒擴增 用滅菌生理鹽水將NDV La Sota種毒進行10-4稀釋，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.1mL/枚，接種后置37 ℃繼續(xù)孵化，棄去24 h內死亡雞胚，取出隨后死亡的雞胚置4 ℃，120 h時取出全部雞胚，收獲雞胚尿囊液。4 ℃ 2500 r/min離心10 min，取上清，測定血凝價。

1.3 病毒滅活

1.3.1 甲醛滅活 40%的甲醛溶液經(jīng)稀釋后加入到5份等量的100 mL NDV病毒液中，充分混勻，使甲醛終濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。將5份含有不同甲醛終濃度的NDV病毒液分為兩組，一組置37 ℃滅活24 h，另一組置4 ℃滅活48 h。

1.3.2 BPL滅活 將BPL溶液稀釋后加入到5份等量的100 mL NDV病毒液中，充分混勻，使BPL終濃度分別為0.02%、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%，置37 ℃滅活9 h。1.3.3 熱滅活 將3等份NDV病毒液(100 mL/份)置60 ℃水浴中，分別滅活30 min、60 min、90 min。

1.4 滅活檢驗 取上述滅活樣品各5 mL，參照《獸用生物制品質量標準》[2]附錄中滅活檢驗法。將各滅活留樣，接種10日齡SPF雞胚，0.1 mL/枚，每個樣品接種6枚。接種后置37 ℃繼續(xù)孵化，每日照蛋2～4次，隨時取出死亡雞胚并置4 ℃，活胚繼續(xù)孵化至120 h時，然后取出所有雞胚，置4 ℃過夜，收獲尿囊液并測定血凝價。將24 h雞胚死亡數(shù)≤1，48～120 h無死亡胚，且尿囊液HA=0的滅活樣品視為完全滅活。

1.5 血凝價測定 參照《獸用生物制品質量標準》[2]附錄中紅細胞凝集試驗法，測定各滅活留樣的血凝價，并與滅活前病毒液血凝價比較。

1.6 RT-PCR測定 分別取滅活前病毒液以及各滅活留樣，采用無菌生理鹽水10倍遞進稀釋，從10-1稀釋至10-6。病毒RNA提取參照RNA提取試劑盒說明書進行。引物參照《新城疫診斷技術》(GB/T 16550-2008)[3]所用的檢測引物，由寶生物工程(大連)有限公司合成。反應體系按RT-PCR檢測試劑盒說明書配制，反應條件為：50 ℃反轉錄30 min；94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應結束后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析結果，PCR 產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司測序。測定各滅活留樣可檢出的病毒最高稀釋倍數(shù)，并與滅活前病毒液比較。

2 結果

2.1 滅活檢驗 按所述方法檢測各滅活留樣的滅活效果，采用濃度為0.1%～0.5%的甲醛滅活時，無論37 ℃滅活24 h或4℃滅活48 h，滅活的病毒樣品再次接種雞胚后，收獲的尿囊液血凝價均為0，證明滅活完全；采用濃度為0.02%～0.2%的BPL 37 ℃滅活9 h，經(jīng)檢測均滅活完全；采用60 ℃30 min、60 min、90 min熱滅活，經(jīng)檢測均滅活完全。

2.2 滅活前后血凝試驗檢測 結果見表1。病毒滅活前，經(jīng)測定病毒液血凝價為 210。用甲醛滅活，滅活溫度為37 ℃時，隨著甲醛濃度從0.1%增加至0.5%，滅活后的病毒液血凝價下降到29～26；滅活溫度為4 ℃時，在不同的滅活濃度下，滅活后的病毒液血凝價與滅活前保持一致，均為210。用BPL滅活時，滅活濃度從0.02%增加至0.2%，滅活后的病毒液血凝價與滅活前保持一致，均為210。采用60 ℃熱滅活，滅活時間從30 min增加至90 min，滅活后的病毒液均檢測不到血凝價。

表1 不同滅活處理方法對NDV血凝價的影響

“/”代表無數(shù)據(jù)；HA效價為“0”代表無凝集

2.3 滅活前后RT-PCR檢測 結果見表2。病毒滅活前，RT-PCR可檢測到的病毒最高稀釋倍數(shù)為10-3。甲醛滅活時，無論采用37 ℃或4 ℃滅活，或是滅活濃度從0.1%增加至0.5%，滅活后的病毒液均檢測不到病毒核酸。BPL滅活時，滅活濃度為0.02%時，滅活后可檢測到的病毒最高稀釋倍數(shù)與滅活前一致，仍為10-3；隨著滅活濃度從0.025%增加至0.2%，滅活后可檢測到的病毒最高稀釋倍數(shù)有所下降，但仍可檢測到10-2稀釋的病毒液。60 ℃熱滅活時，滅活時間從30 min增加至90 min，滅活后可檢測到的病毒最高稀釋倍數(shù)均和滅活前一致，為10-3。

表2 不同滅活方法處理后RT-PCR可檢測到NDV的最高稀釋倍數(shù)

“/”代表無數(shù)據(jù)；可檢測稀釋倍數(shù)“-”代表檢測結果為陰性

3 討論

甲醛是傳統(tǒng)的滅活劑[6-7]，通過對蛋白和核酸的烷化作用使病毒或細菌喪失感染性[4]。本研究中，37 ℃或4 ℃條件下0.1%～0.5%甲醛滅活后，NDV核酸結構受損，RT-PCR檢測結果均為陰性。37 ℃滅活時，隨甲醛濃度升高，NDV血凝價呈下降趨勢，這可能與血凝素蛋白變性發(fā)生交聯(lián)反應而致抗原性破壞有關。采用4 ℃滅活，則可抑制上述交聯(lián)反應，有效保存血凝素蛋白的抗原性。不過，在相關診斷制品(如新城疫抗原、禽流感抗原等)制備過程中，甲醛滅活濃度、溫度、時間，還需依據(jù)生物材料的特性及具體工藝，靈活選擇。

BPL在國外廣泛用于疫苗滅活，其作用于病原體DNA或RNA，通過與核酸的嘌呤堿基(主要是鳥嘌呤)反應破壞核酸結構，但不直接作用于蛋白質，因此能保持良好的抗原活性。同時，BPL滅活病原時間短，且易水解為無毒性的人體脂肪代謝產(chǎn)物β-羥基丙酸，故不必考慮在成品中的殘留[8]。本研究采用0.02%～0.2%BPL進行滅活，在NDV完全滅活的情況下，滅活前后血凝價保持不變，效果較為理想。同時，BPL雖然直接作用于核酸，當采用0.02%的濃度進行滅活時，滅活前后RT-PCR檢測結果未受影響；當濃度增加到0.025%～0.2%時，RT-PCR可檢測病毒最高稀釋倍數(shù)降低至10-2，但與甲醛相比，BPL滅活對RT-PCR檢測結果影響相對較小。本研究表明，用0.02%的BPL 37 ℃ 9h滅活效果較好，既保持了NDV血凝素蛋白的抗原性，又不會影響RT-PCR 檢測。

熱滅活簡單易行，但容易造成病原體蛋白質變性，進而使抗原活性受到影響。本研究采用熱滅活后，均檢測不到血凝價，說明血凝素蛋白變性而失去其抗原性。但熱滅活對核酸檢測影響較小，滅活30～90 min，均不會影響RT-PCR檢測結果，該方法較適用于分子檢測試劑的質控品、對照品的制備。

本研究顯示，3種滅活方法對NDV血凝性的影響，依次為熱滅活﹥甲醛﹥BPL；對NDV核酸檢測的影響，依次為甲醛﹥BPL﹥熱滅活。因此，新城疫血凝和血凝抑制試驗時，推薦采用0.02%的BPL 37 ℃滅活9 h或0.1%的甲醛4 ℃滅活48 h；NDV核酸檢測時，建議熱滅活30 min，也可用0.02%的BPL 37 ℃滅活9 h。實際應用中，可根據(jù)檢測目的以及病原微生物的種類和生物學特性，合理選擇滅活方法及滅活條件。

[1] 徐守振，尹燕博，王新．動物疫苗中常用抗原滅活劑的研究進展[J]．中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(9)：162-167．

[2] 中華人民共和國農業(yè)部．中華人民共和國獸用生物制品質量標準[S]．北京：中國農業(yè)科技出版社，2001．

[3] 新城疫診斷技術(GB/T 16550-2008)[M]．北京：中國農業(yè)科技出版社，2001．

[4] 姜平．獸醫(yī)生物制品學[M]．第2版．北京：中國農業(yè)出版社，2006．

[5] 徐守振，王新，尹燕博．四種不同滅活劑對新城疫病毒的滅活效果研究[J]．中國家禽，2011，33(14)：15-19．

[6] Jagt H J，Bekkers M L，Van Bommel S A,etal．The influence of the inactivating agent on the antigen content of inactivated Newcastle disease vaccines assessed by theinvitropotency test[J]．Biologicals，2010，38：128-134．

[7] Habib M，Hussain I，F(xiàn)ang W H，etal．Inactivation of infectious bursal disease virus by binary ethylenimine and formalin[J]．Zhejiang Univ Science B，2006，7(4)：320-323．

[8] 衛(wèi)龍興，王福泉．動物疫苗中滅活劑與佐劑的種類及其作用[J]．現(xiàn)代農業(yè)科技，2009，19：321-322．

(編輯：李文平)

Influence of Three Different Inactivation Methods on Newcastle Disease Virus Hemagglutinin Test and RT-PCR Assay

CHEN Yu-qi1,2, NAN Wen-long1, QIN Li-de1, GONG Ming-xia1,ZHANG Yue-yong1, CHEN Yi-ping1

(1.LaboratoryofDiagnosticsDevelopment,ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter,Qindao,Shangdong266032,China;2.DepartmentofBiologicalSciences,Xi’anJiaotong-LiverpoolUniversity,Suzhou,Jiangsu215123,China)

In order to investigate the influence of different inactivation methods on Newcastle disease virus (NDV) hemagglutinin (HA) test and RT-PCR assay, viral suspensions were inactivated by 0.1%～0.5% formaldehyde for 37 ℃24 h and 4 ℃ 48 h, 0.02%～0.2%β-propiolactone (BPL) for 37 ℃ 9 h and 60 ℃ water bath for 30～90 min, respectively. Then the suspensions were detected by HA test and RT-PCR assay. The results showed that the optimal inactivation conditions for HA were 0.02% BPL at 37 ℃ for 9 h or 0.1% formaldehyde at 4 ℃ for 48 h; for RT-PCR were 60 ℃ water bath for 30 min or 0.02% BPL at 37 ℃ for 9 h. This study provided suggestions for the selection of appropriate inactivation methods, which were used in detecting related pathogens and preparing diagnostic reagents.

Newcastle disease virus; inactivation; hemagglutinin; RT-PCR

國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0501609)

陳羽琪， 從事微生物相關研究。

陳義平。 E-mail: cyp777@163.com

2016-07-23

A

1002-1280 (2016) 09-0011-04

S852.65