基于線粒體COⅠ基因序列探討卵翅蝗亞科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

胡 洲，徐吉山，毛本勇

（大理大學農(nóng)學與生物科學學院，云南大理 671003）

基于線粒體COⅠ基因序列探討卵翅蝗亞科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

胡 洲，徐吉山，毛本勇*

（大理大學農(nóng)學與生物科學學院，云南大理 671003）

基于線粒體COⅠ基因538 bp片段重建了斑腿蝗科中4亞科（卵翅蝗亞科、稻蝗亞科、禿蝗亞科和黑蝗亞科）10屬37種和錐頭蝗科1屬1種（外群）的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果顯示：（1）4亞科的親緣關(guān)系為（（（卵翅蝗亞科、稻蝗亞科）禿蝗亞科）黑蝗亞科）；（2）卵翅蝗亞科為一個單系群；（3）卵翅蝗屬、龍川蝗屬的單系性未被支持，但二者均屬于卵翅蝗亞科；（4）清水卵翅蝗種團的單系性得到支持，表明清水蝗屬并入卵翅蝗屬的合理性。

卵翅蝗亞科；系統(tǒng)發(fā)育；COI基因；斑腿蝗科；直翅目

卵翅蝗亞科Caryandinae最初由稻蝗亞科Oxyinae中分離出來，以卵翅蝗屬Caryanda為模式建立〔1〕；在中國慣用的夏氏分類系統(tǒng)〔2〕中隸于直翅目Orthoptera蝗總科Acridoidea斑腿蝗科Catantopidae下，為斑腿蝗科中的17個亞科之一，其種類主要分布于東洋區(qū)，少數(shù)分布于非洲區(qū)和澳洲區(qū)。然而，該亞科的地位一直以來頗有爭議，支持〔3-5〕和反對（或懷疑）〔6-10〕的觀點并存。在基于Otte分類系統(tǒng)的世界直翅目分類數(shù)據(jù)庫OSF（Orthoptera Species File）〔7〕中，卵翅蝗類和稻蝗類共同被隸于稻蝗亞科Oxyinae稻蝗族Oxyini。

在《中國動物志》中卵翅蝗亞科僅含卵翅蝗屬Canyanda和舟形蝗屬Lemba〔11〕。毛本勇等〔12〕將龍川蝗屬Longchuanacris移入卵翅蝗亞科，Mao等〔13〕將清水蝗屬Q(mào)inshuiacris并入卵翅蝗屬，并建議將清水卵翅蝗、峨山卵翅蝗、白斑卵翅蝗等作為一個種團。至此，卵翅蝗亞科在中國的類群包括卵翅蝗屬、龍川蝗屬和舟形蝗屬。

目前缺乏針對卵翅蝗亞科開展的分子系統(tǒng)學研究，或僅見涉及該亞科個別屬的1～2個物種的報道，所以有必要在增加屬級單元和物種數(shù)量以加大分類單元代表性的基礎(chǔ)上，進一步開展分子系統(tǒng)學研究，考查其單系性與否，考查其與近緣亞科稻蝗亞科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，確證其分類地位。

1 材料與方法

1.1實驗材料本實驗所用蝗蟲標本均為無水乙醇浸泡標本，材料取自標本的后足股節(jié)。標本的來源見表1，其中涉及6個需要另文發(fā)表的新物種。

1.2基因組總DNA的提取本實驗的DNA提取采用酚-氯仿-異戊醇法，提取到的DNA加入30～50 μL滅菌水溶解，-20℃保存。

1.3 PCR擴增及測序PCR擴增所用引物為：上游引物5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3’，下游引物5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-3’，由上海華大生物科技有限公司合成。

擴增體系為：DNA模板3 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、Taq酶1 μL、Buffer 10 μL、DNTP 2 μL、H2O 30 μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，運行循環(huán)：95℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min，25℃保存。個別樣品在實驗中出現(xiàn)非特異的條帶，且經(jīng)優(yōu)化條件無法去除，故使用了DNA凝膠回收試劑盒對其進行了純化，將純化結(jié)果二次PCR后測序。PCR擴增產(chǎn)物和純化產(chǎn)物交由上海華大生物科技有限公司完成測序。

1.4實驗數(shù)據(jù)的處理和分析序列刪除兩端信號較差的堿基后，使用ClustalX軟件〔14〕進行同源性比對，共得到平均長度為619 bp的數(shù)據(jù)集，序列采用MEGA4.0〔15〕進行序列組成及飽和度分析，之后采用ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。見表1。

表1 樣品來源及其COⅠ基因序列GenBank登錄號

2 結(jié)果與分析

2.1序列數(shù)據(jù)集特征比對后的38種蝗蟲COⅠ數(shù)據(jù)集序列長度為538 bp，其中一致性位點為383 bp，占整體序列長度的71.1%，變異位點占據(jù)整體序列長度的29.9%，處于正常水平，說明該基因種間差異較小，為較為保守的基因。通過對序列分歧度（同一位點的堿基多樣性）進行分析，發(fā)現(xiàn)這些變異位點分布較為平均，數(shù)據(jù)集中不存在簡約信號位點集中區(qū)域，所有的位點均包含系統(tǒng)發(fā)育信息，應(yīng)全部應(yīng)用于系統(tǒng)樹的構(gòu)建中。

通常，受隨機突變作用的影響，昆蟲線粒體基因組通常存在明顯的堿基偏向性，在復(fù)制過程中CT及AG轉(zhuǎn)化非常普遍。在蝗蟲中，傾向于AT的突變偏好是其不同物種中獨特序列特異性的重要影響因素。本研究中同樣發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象，數(shù)據(jù)集中序列整體的GC值為33.8，僅為AT含量的一半。對于各堿基而言，T的堿基含量最高，為33.5%，而G的含量最低，僅為17.3%。堿基特異的方向性突變的發(fā)生頻率與突變作用的強弱正向關(guān)聯(lián)。分子數(shù)據(jù)集還包含有更深入的信息有待挖掘。

2.2堿基替換飽和度分析替換飽和是檢驗一個數(shù)據(jù)集是否滿足建樹要求的重要參數(shù)。本研究使用F84遺傳距離對數(shù)據(jù)組進行了替換飽和分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)換（同類堿基）與顛換（異類堿基）的比率均隨著遺傳距離的增加而上升，顛換逐漸多于轉(zhuǎn)換，與線粒體基因中堿基CT及AG突變較多的情況相吻合。轉(zhuǎn)換與顛換的曲線均呈現(xiàn)出向平臺期過渡的趨勢，即出現(xiàn)飽和狀態(tài)的傾向。飽和狀態(tài)一般代表分子標記存在多重替換從而掩蓋有效發(fā)育信號的現(xiàn)象，但在本研究中，該傾向并不明顯，且僅有較少有數(shù)據(jù)分布于過渡區(qū)域的附近，說明實際序列未達到飽和狀態(tài)，過渡區(qū)的表象可能是所選擇的物種親緣關(guān)系較近導(dǎo)致序列相似度較高原因所致。整體而言，盡管序列整體上較為保守，但構(gòu)建的數(shù)據(jù)集的飽和度在較低的水平上，說明作為常用的分子標記，COⅠ基因包含足夠的遺傳信息可以用于解析本研究所構(gòu)建數(shù)據(jù)集的分類關(guān)系。見圖1。

2.3系統(tǒng)發(fā)育分析利用實驗所得COⅠ序列數(shù)據(jù)集構(gòu)建的ML樹如圖2所示。所有物種的分類地位均得到了唯一的解析，獲得的ML合意樹擁有極高的置信值，說明該樹結(jié)果可靠。

2.3.1 卵翅蝗亞科與其他3亞科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系從ML合意樹可以發(fā)現(xiàn)，研究所選的4個親緣關(guān)系較近的亞科（卵翅蝗亞科、稻蝗亞科、禿蝗亞科和黑蝗亞科）基本以單一分支方式與外群相連接，外群短額負蝗位于樹根基部，說明外群選取合理。就各亞科的位置而言，黑蝗亞科位于最基部，接近外群，為較早分化的類群；其次為禿蝗亞科，再次為稻蝗亞科，卵翅蝗亞科位于樹的末端，為較晚分化的類群。卵翅蝗亞科作為一個單系群，與稻蝗亞科的小稻蝗形成姐妹群關(guān)系，它們同聚為一支的稻蝗亞科另外4屬形成一對姐妹群，其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系為：（（（（卵翅蝗亞科、小稻蝗）稻蝗亞科）禿蝗亞科）黑蝗亞科），但鑒于本次實驗僅涉及COⅠ部分序列，結(jié)合形態(tài)特征，上述關(guān)系可合意為（（（卵翅蝗亞科、稻蝗亞科）禿蝗亞科）黑蝗亞科）。由此可見，卵翅蝗亞科雖然與稻蝗亞科的親緣關(guān)系十分密切，但鑒于其種類沒有與其他亞科的種類相互交叉，其單系性是明確的，將卵翅蝗亞科作為一個獨立的亞科看待具有合理性。

2.3.2 卵翅蝗亞科所含屬、種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 本實驗選取了卵翅蝗亞科卵翅蝗屬（23種，其中方板卵翅蝗有后足股節(jié)綠色、紅綠色和紅色3種色型）、龍川蝗屬（6種）、舟形蝗屬（1種）共30種同聚為一支，但卵翅蝗屬、龍川蝗屬的物種并未分別按屬各聚為一簇，盡管這3屬的示差特征十分明顯，表明這2屬的單系性未被支持。也許COⅠ基因序列提供信息量尚不足以揭示其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，這有待結(jié)合其他基因片段提供的信息聯(lián)合建樹來嘗試解析。

圖1 序列堿基替換飽和度分析

圖2 ML法構(gòu)建的38種蝗蟲的系統(tǒng)樹

從ML樹還能發(fā)現(xiàn)，清水卵翅蝗、峨山卵翅蝗、新平卵翅蝗和白斑卵翅蝗聚為一簇，成為一個單系群。這一結(jié)果首次從分子系統(tǒng)學的層面印證了基于形態(tài)學將清水蝗屬并入卵翅蝗屬以及對清水卵翅蝗種團劃分的合理性〔13〕。

3 討論

前人基于形態(tài)或分子在解析蝗總科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系時，涉及了卵翅蝗亞科的地位和單系性問題，支持〔3-5〕和反對（或懷疑）〔6-10〕的觀點并存，但取樣量小，目前已登錄的有效的基因序列僅10條，相關(guān)研究也僅涉及該亞科個別屬的1～2個物種。本文針對該亞科的分子系統(tǒng)學研究取樣量大，具有廣泛的代表性，實驗結(jié)果說明的問題應(yīng)該更加接近實際情況。本研究目前已經(jīng)向GenBank提交清水卵翅蝗的COⅠ基因序列（KT998894），尚有29個本亞科物種的COⅠ基因序列在陸續(xù)提交中，其中有關(guān)龍川蝗與舟形蝗屬的COⅠ基因序列為首次提交，這為解析卵翅蝗亞科各物種的分類關(guān)系提供了有效數(shù)據(jù)。

前人針對卵翅蝗亞科的形態(tài)學的研究已經(jīng)相當深入，近年來更多研究涉及種團的劃分〔16-18〕，但有關(guān)其分子系統(tǒng)學的研究則極少。雖然COⅠ是有效的系統(tǒng)發(fā)育基因，然而單純使用線粒體基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹在缺乏足夠的近緣物種的情況下很可能受吸附效應(yīng)的影響而出現(xiàn)相互連接的現(xiàn)象。未來對于卵翅蝗亞科的進化分析應(yīng)重視使用全線粒體基因組，乃至添加核基因信息，進行綜合分析來加以評判。

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Phylogenetic Relationships of Caryandinae based on Mitochondrial COI Gene Sequences

Hu Zhou,Xu Jishan,Mao Benyong*
（College of Agriculture and Biology Science,Dali University,Dali,Yunnan 671003,China）

With the species Atractomorpha sinensis as an outgroup,the phylogenetic relationships of 37 species belonging to 10 genera from 4 subfamilies（Caryandinae,Oxyinae,Podisminae and Melanoplinae）of Catantopidae were reconstructed based on COⅠgene 538 bp sequence data.The results suggested that:1）the phylogenetic relationships among 4 subfamilies can be expressed as（（（Caryandinae,Oxyinae）Podisminae）Melanoplinae）;2）Caryandinae was supported as a monophyletic group;3）the monophyly of Canyanda and Longchuanacris can not be supported,but the two belong to the Caryandinae;4）the monophyly of C.viridis species group was supported which indicated the rationality of merging the Qinshuiacris into the Caryanda genus.

Caryandinae;phylogenetic;COⅠgene;Catantopidae;Orthoptera

Q96

A

2096-2266（2016）12-0057-05

10.3969∕j.issn.2096-2266.2016.12.014

（責任編輯 李 楊）

國家自然科學基金資助項目（31260520；31560605）

2016-10-24

2016-10-27

胡洲，助理實驗師，主要從事昆蟲分子生物系統(tǒng)學研究. *通信作者：毛本勇，教授，博士.