基于線粒體COⅠ基因序列探討卵翅蝗亞科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

胡 洲，徐吉山，毛本勇

（大理大學農(nóng)學與生物科學學院，云南大理 671003）

基于線粒體COⅠ基因序列探討卵翅蝗亞科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

胡 洲，徐吉山，毛本勇*

（大理大學農(nóng)學與生物科學學院，云南大理 671003）

基于線粒體COⅠ基因538 bp片段重建了斑腿蝗科中4亞科（卵翅蝗亞科、稻蝗亞科、禿蝗亞科和黑蝗亞科）10屬37種和錐頭蝗科1屬1種（外群）的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果顯示：（1）4亞科的親緣關(guān)系為（（（卵翅蝗亞科、稻蝗亞科）禿蝗亞科）黑蝗亞科）；（2）卵翅蝗亞科為一個單系群；（3）卵翅蝗屬、龍川蝗屬的單系性未被支持，但二者均屬于卵翅蝗亞科；（4）清水卵翅蝗種團的單系性得到支持，表明清水蝗屬并入卵翅蝗屬的合理性。

卵翅蝗亞科；系統(tǒng)發(fā)育；COI基因；斑腿蝗科；直翅目

卵翅蝗亞科Caryandinae最初由稻蝗亞科Oxyinae中分離出來，以卵翅蝗屬Caryanda為模式建立〔1〕；在中國慣用的夏氏分類系統(tǒng)〔2〕中隸于直翅目Orthoptera蝗總科Acridoidea斑腿蝗科Catantopidae下，為斑腿蝗科中的17個亞科之一，其種類主要分布于東洋區(qū)，少數(shù)分布于非洲區(qū)和澳洲區(qū)。然而，該亞科的地位一直以來頗有爭議，支持〔3-5〕和反對（或懷疑）〔6-10〕的觀點并存。在基于Otte分類系統(tǒng)的世界直翅目分類數(shù)據(jù)庫OSF（Orthoptera Species File）〔7〕中，卵翅蝗類和稻蝗類共同被隸于稻蝗亞科Oxyinae稻蝗族Oxyini。

在《中國動物志》中卵翅蝗亞科僅含卵翅蝗屬Canyanda和舟形蝗屬Lemba〔11〕。毛本勇等〔12〕將龍川蝗屬Longchuanacris移入卵翅蝗亞科，Mao等〔13〕將清水蝗屬Q(mào)inshuiacris并入卵翅蝗屬，并建議將清水卵翅蝗、峨山卵翅蝗、白斑卵翅蝗等作為一個種團。至此，卵翅蝗亞科在中國的類群包括卵翅蝗屬、龍川蝗屬和舟形蝗屬。

目前缺乏針對卵翅蝗亞科開展的分子系統(tǒng)學研究，或僅見涉及該亞科個別屬的1～2個物種的報道，所以有必要在增加屬級單元和物種數(shù)量以加大分類單元代表性的基礎(chǔ)上，進一步開展分子系統(tǒng)學研究，考查其單系性與否，考查其與近緣亞科稻蝗亞科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，確證其分類地位。

1 材料與方法

1.1實驗材料本實驗所用蝗蟲標本均為無水乙醇浸泡標本，材料取自標本的后足股節(jié)。標本的來源見表1，其中涉及6個需要另文發(fā)表的新物種。

1.2基因組總DNA的提取本實驗的DNA提取采用酚-氯仿-異戊醇法，提取到的DNA加入30～50 μL滅菌水溶解，-20℃保存。

1.3 PCR擴增及測序PCR擴增所用引物為：上游引物5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3’，下游引物5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-3’，由上海華大生物科技有限公司合成。

擴增體系為：DNA模板3 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、Taq酶1 μL、Buffer 10 μL、DNTP 2 μL、H2O 30 μL。

PCR反應條件：95℃預變性3 min，運行循環(huán)：95℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min，25℃保存。個別樣品在實驗中出現(xiàn)非特異的條帶，且經(jīng)優(yōu)化條件無法去除，故使用了DNA凝膠回收試劑盒對其進行了純化，將純化結(jié)果二次PCR后測序。PCR擴增產(chǎn)物和純化產(chǎn)物交由上海華大生物科技有限公司完成測序。

1.4實驗數(shù)據(jù)的處理和分析序列刪除兩端信號較差的堿基后，使用ClustalX軟件〔14〕進行同源性比對，共得到平均長度為619 bp的數(shù)據(jù)集，序列采用MEGA4.0〔15〕進行序列組成及飽和度分析，之后采用ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。見表1。

表1 樣品來源及其COⅠ基因序列GenBank登錄號

2 結(jié)果與分析

2.1序列數(shù)據(jù)集特征比對后的38種蝗蟲COⅠ數(shù)據(jù)集序列長度為538 bp，其中一致性位點為383 bp，占整體序列長度的71.1%，變異位點占據(jù)整體序列長度的29.9%，處于正常水平，說明該基因種間差異較小，為較為保守的基因。通過對序列分歧度（同一位點的堿基多樣性）進行分析，發(fā)現(xiàn)這些變異位點分布較為平均，數(shù)據(jù)集中不存在簡約信號位點集中區(qū)域，所有的位點均包含系統(tǒng)發(fā)育信息，應全部應用于系統(tǒng)樹的構(gòu)建中。

通常，受隨機突變作用的影響，昆蟲線粒體基因組通常存在明顯的堿基偏向性，在復制過程中CT及AG轉(zhuǎn)化非常普遍。在蝗蟲中，傾向于AT的突變偏好是其不同物種中獨特序列特異性的重要影響因素。本研究中同樣發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象，數(shù)據(jù)集中序列整體的GC值為33.8，僅為AT含量的一半。對于各堿基而言，T的堿基含量最高，為33.5%，而G的含量最低，僅為17.3%。堿基特異的方向性突變的發(fā)生頻率與突變作用的強弱正向關(guān)聯(lián)。分子數(shù)據(jù)集還包含有更深入的信息有待挖掘。

2.2堿基替換飽和度分析替換飽和是檢驗一個數(shù)據(jù)集是否滿足建樹要求的重要參數(shù)。本研究使用F84遺傳距離對數(shù)據(jù)組進行了替換飽和分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)換（同類堿基）與顛換（異類堿基）的比率均隨著遺傳距離的增加而上升，顛換逐漸多于轉(zhuǎn)換，與線粒體基因中堿基CT及AG突變較多的情況相吻合。轉(zhuǎn)換與顛換的曲線均呈現(xiàn)出向平臺期過渡的趨勢，即出現(xiàn)飽和狀態(tài)的傾向。飽和狀態(tài)一般代表分子標記存在多重替換從而掩蓋有效發(fā)育信號的現(xiàn)象，但在本研究中，該傾向并不明顯，且僅有較少有數(shù)據(jù)分布于過渡區(qū)域的附近，說明實際序列未達到飽和狀態(tài)，過渡區(qū)的表象可能是所選擇的物種親緣關(guān)系較近導致序列相似度較高原因所致。整體而言，盡管序列整體上較為保守，但構(gòu)建的數(shù)據(jù)集的飽和度在較低的水平上，說明作為常用的分子標記，COⅠ基因包含足夠的遺傳信息可以用于解析本研究所構(gòu)建數(shù)據(jù)集的分類關(guān)系。見圖1。

2.3系統(tǒng)發(fā)育分析利用實驗所得COⅠ序列數(shù)據(jù)集構(gòu)建的ML樹如圖2所示。所有物種的分類地位均得到了唯一的解析，獲得的ML合意樹擁有極高的置信值，說明該樹結(jié)果可靠。

2.3.1 卵翅蝗亞科與其他3亞科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系從ML合意樹可以發(fā)現(xiàn)，研究所選的4個親緣關(guān)系較近的亞科（卵翅蝗亞科、稻蝗亞科、禿蝗亞科和黑蝗亞科）基本以單一分支方式與外群相連接，外群短額負蝗位于樹根基部，說明外群選取合理。就各亞科的位置而言，黑蝗亞科位于最基部，接近外群，為較早分化的類群；其次為禿蝗亞科，再次為稻蝗亞科，卵翅蝗亞科位于樹的末端，為較晚分化的類群。卵翅蝗亞科作為一個單系群，與稻蝗亞科的小稻蝗形成姐妹群關(guān)系，它們同聚為一支的稻蝗亞科另外4屬形成一對姐妹群，其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系為：（（（（卵翅蝗亞科、小稻蝗）稻蝗亞科）禿蝗亞科）黑蝗亞科），但鑒于本次實驗僅涉及COⅠ部分序列，結(jié)合形態(tài)特征，上述關(guān)系可合意為（（（卵翅蝗亞科、稻蝗亞科）禿蝗亞科）黑蝗亞科）。由此可見，卵翅蝗亞科雖然與稻蝗亞科的親緣關(guān)系十分密切，但鑒于其種類沒有與其他亞科的種類相互交叉，其單系性是明確的，將卵翅蝗亞科作為一個獨立的亞科看待具有合理性。

2.3.2 卵翅蝗亞科所含屬、種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 本實驗選取了卵翅蝗亞科卵翅蝗屬（23種，其中方板卵翅蝗有后足股節(jié)綠色、紅綠色和紅色3種色型）、龍川蝗屬（6種）、舟形蝗屬（1種）共30種同聚為一支，但卵翅蝗屬、龍川蝗屬的物種并未分別按屬各聚為一簇，盡管這3屬的示差特征十分明顯，表明這2屬的單系性未被支持。也許COⅠ基因序列提供信息量尚不足以揭示其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，這有待結(jié)合其他基因片段提供的信息聯(lián)合建樹來嘗試解析。

圖1 序列堿基替換飽和度分析

圖2 ML法構(gòu)建的38種蝗蟲的系統(tǒng)樹

從ML樹還能發(fā)現(xiàn)，清水卵翅蝗、峨山卵翅蝗、新平卵翅蝗和白斑卵翅蝗聚為一簇，成為一個單系群。這一結(jié)果首次從分子系統(tǒng)學的層面印證了基于形態(tài)學將清水蝗屬并入卵翅蝗屬以及對清水卵翅蝗種團劃分的合理性〔13〕。

3 討論

前人基于形態(tài)或分子在解析蝗總科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系時，涉及了卵翅蝗亞科的地位和單系性問題，支持〔3-5〕和反對（或懷疑）〔6-10〕的觀點并存，但取樣量小，目前已登錄的有效的基因序列僅10條，相關(guān)研究也僅涉及該亞科個別屬的1～2個物種。本文針對該亞科的分子系統(tǒng)學研究取樣量大，具有廣泛的代表性，實驗結(jié)果說明的問題應該更加接近實際情況。本研究目前已經(jīng)向GenBank提交清水卵翅蝗的COⅠ基因序列（KT998894），尚有29個本亞科物種的COⅠ基因序列在陸續(xù)提交中，其中有關(guān)龍川蝗與舟形蝗屬的COⅠ基因序列為首次提交，這為解析卵翅蝗亞科各物種的分類關(guān)系提供了有效數(shù)據(jù)。

前人針對卵翅蝗亞科的形態(tài)學的研究已經(jīng)相當深入，近年來更多研究涉及種團的劃分〔16-18〕，但有關(guān)其分子系統(tǒng)學的研究則極少。雖然COⅠ是有效的系統(tǒng)發(fā)育基因，然而單純使用線粒體基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹在缺乏足夠的近緣物種的情況下很可能受吸附效應的影響而出現(xiàn)相互連接的現(xiàn)象。未來對于卵翅蝗亞科的進化分析應重視使用全線粒體基因組，乃至添加核基因信息，進行綜合分析來加以評判。

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Phylogenetic Relationships of Caryandinae based on Mitochondrial COI Gene Sequences

Hu Zhou,Xu Jishan,Mao Benyong*
（College of Agriculture and Biology Science,Dali University,Dali,Yunnan 671003,China）

With the species Atractomorpha sinensis as an outgroup,the phylogenetic relationships of 37 species belonging to 10 genera from 4 subfamilies（Caryandinae,Oxyinae,Podisminae and Melanoplinae）of Catantopidae were reconstructed based on COⅠgene 538 bp sequence data.The results suggested that:1）the phylogenetic relationships among 4 subfamilies can be expressed as（（（Caryandinae,Oxyinae）Podisminae）Melanoplinae）;2）Caryandinae was supported as a monophyletic group;3）the monophyly of Canyanda and Longchuanacris can not be supported,but the two belong to the Caryandinae;4）the monophyly of C.viridis species group was supported which indicated the rationality of merging the Qinshuiacris into the Caryanda genus.

Caryandinae;phylogenetic;COⅠgene;Catantopidae;Orthoptera

Q96

A

2096-2266（2016）12-0057-05

10.3969∕j.issn.2096-2266.2016.12.014

（責任編輯 李 楊）

國家自然科學基金資助項目（31260520；31560605）

2016-10-24

2016-10-27

胡洲，助理實驗師，主要從事昆蟲分子生物系統(tǒng)學研究. *通信作者：毛本勇，教授，博士.