HPLC法測(cè)定肝龍膠囊中肌苷的含量

李宇馳，徐 妍，楊永壽，肖培云*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

HPLC法測(cè)定肝龍膠囊中肌苷的含量

李宇馳1，徐 妍1，楊永壽2，肖培云1*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

目的：建立肝龍膠囊中肌苷的含量測(cè)定方法，為肝龍膠囊的質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法：采用Gemini 5u C18110A（250 mm× 4.6 mm）色譜柱，流動(dòng)相水（含0.05%TFA）：乙腈（含0.05%TFA），采用梯度洗脫方式，流速0.8 mL∕min，柱溫30℃，DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果：肌苷在0.202～2.020 μg范圍之間峰面積值與進(jìn)樣量（μg）線性關(guān)系良好，平均回收率（n=9）為96.9%，RSD為2.18%。結(jié)論：建立的肝龍膠囊中肌苷含量測(cè)定方法科學(xué)、簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，可作為提高肝龍膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)項(xiàng)目。

肝龍膠囊；肌苷；含量測(cè)定

肝龍膠囊是由藥用昆蟲美洲大蠊（Periplaneta americana）的干燥蟲體經(jīng)提取得到的活性部位研制而成，是治療病毒性乙型肝炎和肝纖維化作用的中藥二類新藥，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為YBZ04142005-2011Z，具有疏肝理脾，活血解毒的功效，并具有抗肝損傷作用〔1〕。該藥具有療效好，價(jià)格低，給藥方便等優(yōu)點(diǎn)。研究表明，肝龍膠囊不僅對(duì)防治乙肝病毒有較好的療效，還具有抗病毒、抗氧化、防治慢性酒精性肝損傷，提高機(jī)體免疫功能等作用〔2-8〕。由于肝龍膠囊的質(zhì)量控制方面的研究較少，目前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的含量測(cè)定項(xiàng)以總氨基酸為測(cè)定指標(biāo)，缺乏專屬性。研究表明，肌苷是肝龍膠囊活性部位中的已知成分〔9〕，為進(jìn)一步提高肝龍膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的可控性，本文采用高效液相法對(duì)肝龍膠囊中肌苷的含量測(cè)定方法進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

1.1儀器1100型高效液相色譜儀（包括G1311A四元泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B DAD檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司）；超聲波清洗器（SK3200LH型，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；分析天平（AL240-IC型，梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2材料肝龍膠囊（昆明賽諾制藥公司，批號(hào)：15122002、15101201、15091701、15082002、15062401、 15042202）；肌苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140669-201305，Mr=268）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1色譜條件以及肌苷峰的確定采用Gemini 5u C18110A（250 mm×4.6 mm）色譜柱，流動(dòng)相水（含0.05%三氟乙酸，以下簡(jiǎn)稱含0.05%TFA）：乙腈（含0.05%TFA），采用梯度洗脫方式，流速0.8 mL∕min，柱溫30℃，DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，進(jìn)樣量10 μL，按表1中的梯度洗脫程序進(jìn)行洗脫，色譜圖見圖1，可知供試品的S峰與肌苷保留時(shí)間一致，并利用DAD檢測(cè)器對(duì)其圖譜進(jìn)行二維檢測(cè)，光譜圖見圖2，結(jié)果顯示，供試品的S峰與肌苷峰的紫外吸收?qǐng)D譜相同，進(jìn)一步確定S峰即為肌苷峰。

表1 梯度洗脫條件

圖1 肌苷色譜圖

圖2 對(duì)照品與供試品中肌苷峰掃描圖

2.2溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取肌苷對(duì)照品適量，加蒸餾水制成每1 mL含0.202 mg的溶液，混勻，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 取同一批次的膠囊20粒，傾出內(nèi)容物，計(jì)算平均粒重，充分研細(xì)，混勻。精密稱取研細(xì)后的內(nèi)容物約70 mg于10 mL量瓶中，加適量蒸餾水超聲15 min溶解，定容至刻度，混勻，過濾。取續(xù)濾液適量，用0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.3線性關(guān)系精密吸取對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 μL注入色譜儀，按“2.1”色譜條件測(cè)定。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性方程為Y=2 050.7X-298.63，r=0.999 5，結(jié)果表明肌苷在0.202～2.020 μg范圍內(nèi)峰面積值與進(jìn)樣量（μg）呈良好的線性關(guān)系。

2.4精密度實(shí)驗(yàn)取“15062401”批次的肝龍膠囊按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，以肌苷峰面積進(jìn)行計(jì)算，RSD為0.24%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取“15062401”批次的肝龍膠囊，按“2.2.2”項(xiàng)制備6份供試液，精密吸取各供試液10 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，以肌苷峰面積計(jì)算，RSD為0.56%，經(jīng)計(jì)算得樣品含量為14.07 mg∕g，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取“15062401”批次的肝龍膠囊制備的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣10 μL，肌苷峰面積的RSD值為0.89%，表明供試品溶液中肌苷在室溫下放置12 h穩(wěn)定。

2.7加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取“15062401”批次樣品適量于5 mL量瓶中，平行稱取9份，根據(jù)樣品中所含肌苷的平均含量（14.07 mg∕g），按含量的高、中、低加入對(duì)照品，依“2.2.2”項(xiàng)制備供試液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)（n=9）

2.8樣品含量測(cè)定取不同批次的樣品，按“2.2.1”項(xiàng)制備供試液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

實(shí)驗(yàn)考察了phenomenex Gemini 5u C18110A（4.60mm×250mm）、AglientZORBAXSB-C18（4.60mm× 250 mm，5 μm）及Waters Symmetry ShieldTMRP18（4.60 mm×250 mm，5 μm）的C18色譜柱，結(jié)果表明，采用phenomenex Gemini 5u C18110A（4.60 mm×250 mm）色譜柱時(shí)，色譜峰分離效果最好，且基線平穩(wěn)。在流動(dòng)相選擇時(shí)，分別考察了乙腈（0.05%TFA）-水（0.05%TFA）、乙腈-水（0.05%TFA）、乙腈-水3種洗脫體系對(duì)樣品分離的影響，結(jié)果表明，采用乙腈（0.05%TFA）-水（0.05%TFA）為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰分離度和對(duì)稱性良好。實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)在214 nm波長(zhǎng)下色譜圖的基線平穩(wěn)，且相鄰色譜峰無干擾，故選擇214 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。同時(shí)，在確定上述條件的基礎(chǔ)上，分別對(duì)流速（0.7、0.8、0.9 mL∕min）和溫度（25、30、35℃）進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，樣品在柱溫為30℃、流速在0.8 mL∕min時(shí)分離效果最好，且基線漂移較小。

本研究建立了肝龍膠囊中肌苷含量的測(cè)定方法，并測(cè)定了6批肝龍膠囊中肌苷含量，該方法回收率高、精密性良好、方便快捷。可為完善肝龍膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢查提供參考。

〔1〕夏盟愷，曾菁，牛春麗，等.肝龍膠囊和美洲大蠊脫脂膏對(duì)正常大鼠膽汁分泌的影響〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，14（2）：4-7.

〔2〕杜一民，李樹楠，陳鴻珊，等.新藥肝龍膠囊對(duì)雛鴨體內(nèi)鴨乙型肝炎病毒的抑制效果〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，5（4）：6-8.

〔3〕張旭強(qiáng)，吳紅兵，彭麗，等.肝龍膠囊對(duì)大鼠慢性酒精性肝損傷的防治作用研究〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2013，38（13）：2197-2201.

〔4〕杜一民，陳鴻珊，李樹楠，等.治療乙型肝炎新藥肝龍膠囊的藥效學(xué)初步研究〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（8）：1369-1371.

〔5〕楊永榮，繆新權(quán)，梅光濤，等.肝龍膠囊治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎的療效觀察〔J〕.云南醫(yī)藥，2008，29（2）：182-183.

〔6〕張成桂，焦春香，何正春，等.肝龍不同有效部位體外抗氧化活性的分析〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（1）：69-71.

〔7〕桂羅蘭，單華，史彩艷，等.肝龍膠囊對(duì)小鼠血糖濃度的影響〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，12（9）：11-13.

〔8〕肖笛，陳盛陽，馬坤，等.肝龍膠囊對(duì)離體在體腸肌收縮活動(dòng)的影響〔J〕.云南中醫(yī)中藥雜志，2013，34（1）：64-66.

〔9〕那凱歌，滿紅霞，譚巧云，等.肝龍膠囊中總肽含量及其分子量分布的研究〔J〕.中國(guó)生化藥物雜志，2015，36（3）：159-161.

HPLC Method for Determination of the Inosine Content in Ganlong Capsule

Li Yuchi1,Xu Yan1,Yang Yongshou2,Xiao Peiyun1*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Key Laboratory of Pharmaceutical R&D of Insects in Yunnan Province,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To establish a determination method of the content of inosine in Ganlong capsule for providing the basis for Ganlong capsule quality control.Methods:Gemini 5u C18110A（250 mm×4.6 mm）chromatographic column,mobile phase water（0.05%TFA）:acetonitrile（0.05%TFA）,gradient elution,0.8 mL∕min flow,30℃column temperature,DAD detector,214 nm detection wavelength,10 μL sample quantity were used in the study.Results:Peak area of inosine between 0.202-2.020 μg range and injection volume（μg）showed a linear relationship.The average recoveries（n=9）was 96.9%,RSD=2.18%.Conclusion:The established method of determination Ganlong capsules is scientific,simple and accurate,which can be used to improve Ganlong capsule quality standard test project.

Ganlong capsule;inosine;determination

R917

A

2096-2266（2016）12-0040-03

10.3969∕j.issn.2096-2266.2016.12.009

（責(zé)任編輯 李 楊）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81360634；81560634）；云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金資助項(xiàng)目（2015FA025）

2016-08-26

2016-09-08

李宇馳，碩士研究生，主要從事美洲大蠊活性提取物研究. *通信作者：肖培云，教授.