兩種新萃取技術與光度法聯(lián)用測鹽酸洛美沙星

雷自榮，楊 舒，楊盛春，溫曉東

（大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000）

兩種新萃取技術與光度法聯(lián)用測鹽酸洛美沙星

雷自榮，楊 舒，楊盛春，溫曉東*

（大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000）

目的：將表面活性劑輔助-分散液液微萃取（SA-DLLME）和超聲輔助-分散液液微萃?。║A-DLLME）與紫外-可見分光光度法（UV-vis）聯(lián)用對鹽酸洛美沙星（LMFH）進行預富集和測定，比較兩種方法的分析性能。方法：優(yōu)化實驗條件，對比兩種新方法與光度法聯(lián)用測定該藥物的分析性能。結果：在最優(yōu)條件下SA-DLLME和UA-DLLME測定LMFH的檢出限（LOD）分別為4.0 μg∕L和6.0 μg∕L，富集倍數(shù)達31倍和20倍。結論：SA-DLLME表現(xiàn)優(yōu)于UA-DLLME，兩種方法都顯著提高了普通分光光度法分析測定該藥物的靈敏度，拓展了分光光度法的應用范圍。為驗證所建立方法的準確性和實用性，進行了樣品測定，結果準確。

表面活性劑輔助-分散液液微萃??；超聲輔助-分散液液微萃取；預富集；分光光度法；鹽酸洛美沙星

鹽酸洛美沙星（LMFH）為喹諾酮類廣譜抗菌藥，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及部分厭氧菌都有著強力的殺菌作用，主要用于呼吸道，泌尿生殖系統(tǒng)，以及皮膚軟組織等感染的治療，對鹽酸洛美沙星進行分析測定具有實際意義及使用價值〔1〕。目前有多種測定鹽酸洛美沙星的儀器分析方法，包括熒光分光光度法〔2〕、紫外光度法〔3〕、原子吸收（AAS）法〔4〕、液相色譜（HPLC）法〔5〕等。本實驗中采用的兩種新型液相微萃取預富集技術：表面活性劑輔助-分散液液微萃?。⊿A-DLLME）和超聲輔助-分散液液微萃?。║A-DLLME）與紫外-可見分光光度法（UV-vis）聯(lián)用對鹽酸洛美沙星進行預富集和測定的新方法未見報道。

液相微萃取技術（liquid phase microextraction，LPME）是一種早在1996年由LIU等〔6〕及JEANNOT等〔7〕幾乎在同一時間提出的微型樣品前處理技術，如今該類技術得到了不斷革新且應用前景越來越廣闊。分散液液微萃取技術（dispersive liquid liquid microextraction，DLLME）是其中之一，最初是由伊朗科學技術大學Assadi科研小組于2006年提出〔8〕。該技術具有操作簡單、成本低、富集倍數(shù)高、環(huán)境友好等優(yōu)點。超聲輔助-分散液液微萃取法（UADLLME）是在分散液液微萃取法（DLLME）基礎上輔以超聲技術取代傳統(tǒng)有機分散劑，利用超聲波在超聲過程中產(chǎn)生的熱效應、空化效應、強化擴散、乳化作用、機械攪拌等一系列效應，來加快萃取過程中的傳質作用，從而提高萃取效率〔9〕。表面活性劑輔助-分散液液微萃取（SA-DLLME）則是利用表面活性劑取代了傳統(tǒng)DLLME中的有機分散劑的一種更為新型和環(huán)境友好萃取技術〔10〕。SA-DLLME和UA-DLLME這兩種技術是最近幾年才發(fā)展起來的，僅有相對較少的文獻報道過此類研究工作〔11-13〕，查閱文獻可知，目前還沒有將這兩種技術應用于藥物分析的研究報道。

本實驗是首次將SA-DLLME和UA-DLLME兩種新型萃取技術與紫外-可見分光光度法聯(lián)用，實現(xiàn)了對藥物鹽酸洛美沙星的含量分析，具有一定的創(chuàng)新性和研究意義。傳統(tǒng)分光光度法儀器簡單，成本低，應用廣泛，但靈敏度較低。通過將其與先進的表面活性劑輔助-分散液液微萃取技術聯(lián)用，可以極大的提高儀器的分析性能，擴展了該儀器的應用范圍，對于經(jīng)濟和科研水平相對落后地區(qū)有較大的實用價值。相對藥物分析中廣泛使用的HPLC法，經(jīng)過富集后的光度法測定該藥物的分析性能已具有一定的可比性，而分析成本大大降低，分析速度得到加快。在本研究工作中對吸收曲線及SA-DLLME和UA-DLLME各項實驗條件進行了詳細考察，獲得了極好的分析性能，并對實際樣品進行了分析測定。具體實驗內(nèi)容報告如下。

1 實驗部分

1.1儀器TU-1901型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；SB5200DT型超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；pHS-25型酸度計（上海虹益儀器儀表有限公司）；TDL-5-A型離心機（上海安亭科學儀器廠）；AL204型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；DZG-303A型純水制備儀（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）。

1.2試劑鹽酸洛美沙星（LMFH）標準儲備溶液的配制：準確稱取鹽酸洛美沙星對照品（上海仁虎制藥）0.050 0 g于燒杯中，加少量的0.01 mol∕L醋酸（四川西隴化工有限公司）溶解后，用0.01 mol∕L的醋酸定容至100 mL的量瓶中，配制成500 μg∕mL鹽酸洛美沙星（LMFH）標準儲備溶液，實驗中使用時由該標準儲備液逐級稀釋。

溴甲酚綠（BMG）溶液的配制：準確稱取0.100 g溴甲酚綠（天津市風船化學試劑有限公司）溶于10 mL 0.1 mol∕L的NaOH（天津市協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司）溶液中，用二次蒸餾水定容至100 mL的量瓶中，配制成1 000 μg∕mL的溴甲酚綠（BMG）溶液。

其他試劑（四氫呋喃、無水乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正辛醇、三氯甲烷、四氯化碳、糊精、乳糖、硬脂酸鎂、淀粉等）均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。實驗用水為純水。

1.3表面活性劑和超聲輔助-分散液液微萃取操作方法SA-DLLME以正辛醇為萃取劑，用表面活性劑Triton X-114代替了DLLME中傳統(tǒng)的有機分散劑。具體的實驗操作程序如下：準確移取3.00 mL LMFH標準工作液（10 μg∕mL）置于40 mL具塞離心管中，然后加入0.40 mL 1 000 μg∕mL BMG，充分搖蕩后加入3.00 mL 0.001 mol∕L醋酸（調(diào)節(jié)pH=5）和0.037 5%（v/v）TritonX-114，加入5.00 mL正辛醇，用蒸餾水定容至40 mL，充分振搖1 min。充分搖勻后，以3 000 r∕min的轉速離心5 min。待水相和有機相完全分離后，用注射器小心抽取上層有機相轉移至1 cm比色皿，于波長431 nm處，以試劑空白為參比測定吸光度。

UA-DLLME以正辛醇為萃取劑，用超聲處理代替了DLLME中傳統(tǒng)的分散劑，實現(xiàn)了更為高效和綠色的萃取過程。具體的實驗操作程序如下：準確移取3.00 mL LMFH標準工作液（10 μg∕mL）置于40 mL具塞離心管中，然后加入0.40 mL 1 000 μg∕mL BMG，充分搖蕩后加入3.00 mL 0.001 mol∕L醋酸（調(diào)節(jié)pH=5.0），充分搖蕩后，加入4.00 mL正辛醇，用二次蒸餾水定容至40 mL，充分搖勻后，超聲振蕩5 min，以3 000 r∕min的轉速離心5 min。待水相和有機相完全分離后，用注射器小心抽取上層有機相轉移至1 cm比色皿，于波長431 nm處，以試劑空白為參比測定吸光度。

1.4樣品采集與制備為了驗證所建立方法的準確性以及實用性，對鹽酸洛美沙星膠囊（南京白敬宇制藥有限責任公司）和片劑（武漢東信醫(yī)藥科技有限責任公司）進行了分析測定。測定前將鹽酸洛美沙星膠囊和片劑制備為溶液進行測定，分別取該藥物膠囊和片劑各10粒，稱重后用研缽分別研成粉末，分別取該樣品粉末0.100 g，各用10 mL 0.1 mol∕L的醋酸溶解后，用水定容到100 mL，過濾后取濾液1.00 mL，用純水定容至100 mL，所得的試樣溶液濃度約10 μg∕mL。

2 結果與討論

2.1吸收曲線本工作以分光光度法為測定方法，因此首先要確定萃取后樣品的最大吸收波長，即要對富集后樣品的吸收曲線進行考察。在未確定最佳實驗條件前，根據(jù)下述萃取步驟及條件開展預實驗，進行吸收曲線的考察，以確定最佳工作波長。

UA-DLLME富集后分光光度法測定的吸收曲線：準確移取8.00 mL 10 μg∕mL LFMH標準工作液，置于40 mL具塞離心試管中，然后加入0.40 mL 1 000 μg∕mL的BMG，3.00 mL 0.001 mol∕L的醋酸溶液（調(diào)節(jié)pH=5.0），充分搖蕩后，加入2.00 mL正辛醇，用二次蒸餾水定容至40 mL，充分搖勻后，超聲振蕩5 min，以3 000 r∕min的轉速離心5 min，待水相和有機相完全分離后，用膠頭滴管吸取上層有機相，用無水乙醇復溶，用1 cm比色皿以試劑空白為參比，在波長為380～500 nm之間，測得吸收光譜圖，其最大吸收峰位于431 nm，因此在λ=431 nm處開展UA-DLLME的實驗工作。見圖1。

圖1 吸收曲線

SA-DLLME富集后分光光度法測定的吸收曲線：準確移取6.00 mL 10 μg∕mL的LFMH標準工作液，置于40mL具塞離心管中，然后加入0.40 mL 1 000 μg∕mL的BMG，3.00 mL 0.001 mol∕L醋酸（調(diào)節(jié)pH= 5），充分搖蕩后，加入0.05%（v/v）TritonX-114溶液和2.00 mL正辛醇，充分振蕩1 min，用二次蒸餾水定容至40 mL。手動搖勻后以3 000 r∕min的轉速離心5 min，待水相和有機相完全分離后，用膠頭滴管吸取上層有機相，用無水乙醇復溶，用1 cm比色皿以試劑空白為參比，在波長為380～500 nm之間，測得吸收光譜，其最大吸收峰位于431 nm，因此在λ=431 nm處開展SA-DLLME的實驗工作。同時考察了未經(jīng)萃取處理直接顯色后測定的吸收曲線。見圖1。從圖中可以看出，在未對UA-DLLME及SA-DLLME萃取條件進行優(yōu)化的條件下富集效果仍然非常明顯。同時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過萃取和復溶后測定的最大吸收波長發(fā)生藍移，可能是由于萃取劑等的加入使絡合物的光譜性質發(fā)生了改變。

2.2SA-DLLME與UA-DLLME實驗條件優(yōu)化在確定儀器分析的最大吸收波長后，詳細考察了影響SA-DLLME和UA-DLLME萃取效率的各實驗條件以獲取最佳的分析性能，包括萃取劑的種類與用量、絡合劑濃度、SA-DLLME表面活性劑用量、UADLLME超聲萃取時間、pH等條件。

2.2.1 SA-DLLME和UA-DLLME萃取劑種類及用量優(yōu)化 在液相萃取技術中，選擇合適的萃取劑是確保實驗成功并提高分析靈敏度的關鍵。在選擇萃取劑時要求對待測物的溶解能力要大，以保證取得良好的萃取效率。本實驗對正辛醇、三氯甲烷、四氯化碳、四氫呋喃等4種萃取劑的萃取分析性能進行了考察以確定萃取劑的種類。實驗表明，正辛醇對目標分析物的萃取效果最佳，經(jīng)優(yōu)化選擇正辛醇作為萃取劑開展實驗工作。

萃取過程中所加萃取劑的體積直接影響該方法的富集效率和富集倍數(shù)。在SA-DLLME和UADLLME中，分別考察了萃取劑正辛醇的體積為1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL的富集效果，隨著正辛醇的體積增加，吸光度逐漸增大，當加入的正辛醇體積超過某體積時吸光度略微減小。結果表明對于SA-DLLME，正辛醇體積在5.00 mL時萃取效果最好，對于UA-DLLME則選擇4.00 mL的正辛醇萃取效果最佳。見圖2。

圖2 萃取劑用量的優(yōu)化

2.2.2 BMG的濃度優(yōu)化 本實驗選用溴甲酚綠作為鹽酸洛美沙星的絡合劑（兼顯色劑）。溴甲酚綠簡稱BMG，可以與鹽酸洛美沙星結合形成疏水性絡合物而被萃取劑萃取富集，同時也起到光度法中顯色劑的作用。絡合劑（顯色劑）的用量也是影響方法富集效率的重要條件之一，本實驗對BMG濃度在1.25～15.00 μg∕mL的范圍內(nèi)進行優(yōu)化。對于兩種方法，隨著BMG的濃度增大，萃取效率提高，吸光度逐漸增大，當加入的BMG的濃度超過10 μg∕mL時，過量的絡合劑由于本身會被萃取劑萃取而干擾和影響了目標分析物的萃取效率，從而導致吸光度減小。因此溴甲酚綠濃度以10 μg∕mL為最佳，選擇此條件展開實驗工作。見圖3。

圖3 溴甲酚綠濃度的優(yōu)化

2.2.3 SA-DLLME表面活性劑TritonX-114濃度優(yōu)化在SA-DLLME技術中，表面活性劑取代了傳統(tǒng)的有機分散劑起到乳化和分散萃取劑以提高萃取效率的作用。本實驗中選用TritonX-114取代有機分散劑，分別考察了含量為0.000 0%、0.025 0%、0.037 5%、0.062 5%、0.100 0%、0.125 0%（v/v）TritonX-114溶液的萃取效率。實驗表明，在一定用量范圍內(nèi)（0.000 0%～0.037 5%，v/v）吸光度隨著TritonX-114用量的增加呈現(xiàn)顯著增大的趨勢，但當TritonX-114過量時，吸光度開始下降。當TritonX-114用量為0.000 0%，即未加入表面活性劑時，吸光度非常低，充分驗證和說明了表面活性劑在本方法中所起到的重要輔助作用。經(jīng)過優(yōu)化，在SA-DLLME中選用0.037 5%（v/v）TritonX-114萃取效果最佳，因此選擇此條件開展下面的實驗工作。見圖4。

圖4 表面活性劑濃度的優(yōu)化

2.2.4UA-DLLME超聲萃取條件優(yōu)化 在UA-DLLME中，超聲利用的是超聲波在超聲過程中產(chǎn)生的有關效應來提高萃取效率。超聲技術的使用，代替了傳統(tǒng)DLLME技術中的有機分散劑，不但使萃取效率得到了提高，并且降低了有機溶劑的使用。在該實驗中對超聲時間進行了優(yōu)化，分別考察了超聲時間0.5、1、2、4、5、6、8、10 min的萃取效率，實驗結果顯示超聲5 min的效果最佳。見圖5。

圖5 超聲萃取時間的優(yōu)化

2.2.5 pH值的影響 SA-DLLME和UA-DLLME萃取LMFH的時候，首先需要LMFH與絡合劑BMG形成疏水性的絡合物。而絡合物的形成受溶液體系的酸度條件的影響很大，從而影響萃取效率。在實驗中通過調(diào)整萃取體系溶液的pH值，可以提高目標分析物與絡合劑的絡合效果，從而提高萃取效率。為了找到本實驗的最佳酸度條件，在優(yōu)化實驗中考察了pH值在3.0～7.0范圍內(nèi)變化時的萃取效果。對于兩種萃取方法都是當pH=5.0時吸光度值最好，萃取效率達到最大，因此選擇pH=5.0為萃取實驗的最佳酸度條件。見圖6。

圖6 溶液pH的影響

2.3干擾實驗在考察兩種方法的抗干擾能力時，在0.75 μg∕mL的LMFH溶液中加入相當于其含量50倍的硬脂酸鎂，100倍的糊精、乳糖、淀粉等，按照SA-DLLME和UA-DLLME的實驗方法操作，在優(yōu)化的實驗條件下，測定其吸光度。實驗表明，當加入上述含量的干擾物質時，其吸光度與0.75 μg∕mL的LMFH標準溶液按照其實驗方法操作所得的吸光度相比差異無統(tǒng)計學意義。因此，在測定藥物的膠囊及片劑時，經(jīng)過過濾后，可以用該方法進行測定。

2.4方法分析性能在最優(yōu)實驗條件下，對方法的分析性能進行了考察，總結和對比了經(jīng)過UA-DLLME萃取、經(jīng)過SA-DLLME萃取及不萃取直接顯色測定的分析性能。見表1。

2.5樣品分析為驗證所建立方法的實用性和準確性，將該方法用于鹽酸洛美沙星膠囊和片劑的測定。在測定藥品膠囊和片劑的實驗中，分別取2.0 mL約為10 μg∕mL的鹽酸洛美沙星膠囊試樣溶液及片劑試樣溶液，各于40 mL的具塞離心管中，按優(yōu)化的實驗條件進行SA-DLLME和UA-DLLME萃取和分析測定（樣品儲備液在此過程中稀釋了20倍），并進行了加標回收實驗，加標回收率在92.5%～101.0%。見表2。

表1 分析性能

表2 鹽酸洛美沙星膠囊和片劑樣品溶液的分析結果（）

表2 鹽酸洛美沙星膠囊和片劑樣品溶液的分析結果（）

實際樣品 富集方法鹽酸洛美沙星膠囊鹽酸洛美沙星藥片■■■■■ ■■■■■UA-DLLME SA-DLLME UA-DLLME SA-DLLME實際樣品中檢測值∕(mg∕L) 0.446±0.021 0.479±0.023 0.435±0.019 0.466±0.022加標量∕(mg∕L) 1.0 1.0 1.0 1.0回收率∕% 101.0 100.0 92.5 94.6

3 結論

本實驗建立了表面活性劑輔助-分散液液微萃取（SA-DLLME）和超聲輔助-分散液液微萃?。║A-DLLME）與紫外-可見分光光度法（UV-vis）聯(lián)用測定LMFH含量的新方法，實驗結果表明該方法具有富集倍數(shù)高，操作簡單，成本低，環(huán)境友好等優(yōu)點。本方法是對傳統(tǒng)的分散液液微萃取技術的提升和擴展，同時顯著提高了普通分光光度法在藥物分析方面的分析性能，具有一定的實用價值和研究意義。

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Investigation of Two Novel Extraction Methods Coupled with Spectrophotometry for the Detection of Lomefloxacin Hydrochloride

Lei Zirong,Yang Shu,Yang Shengchun,Wen Xiaodong*
（College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:Surfactant-assisted dispersive liquid-liquid microextraction（SA-DLLME）and ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction（UA-DLLME）were coupled with conventional spectrophotometer to pre-concentrate and determine lomefloxacin hydrochloride（LMFH）,as well as to compare their analytical performances.Methods:The experimental conditions were optimized and the analytical performances of the two kinds of DLLME techniques for LMFH determination were compared.Results: After optimization,the LODs were 4.0 μg∕L and 6.0 μg∕L for SA-DLLME and UA-DLLME,respectively,with the enhancement factors of 31 and 20 folds.Conclusion:The analytical performance of SA-DLLME was obviously better than UA-DLLME.The developed methods were applied to the determination of LMFH in real samples with satisfactory analytical results.

surfactant-assisteddispersiveliquid-liquidmicroextraction;ultrasound-assisteddispersiveliquid-liquidmicroextraction; pre-concentration;spectrophotometer;lomefloxacin hydrochloride

R917

A

2096-2266（2016）12-0030-06

10.3969∕j.issn.2096-2266.2016.12.007

（責任編輯 李 楊）

國家自然科學基金資助項目（21165001；21465001）

2016-09-22

2016-11-09

雷自榮，碩士研究生，主要從事藥物分析研究. *通信作者：溫曉東，教授，博士.