子宮腺肌病患者增生期及分泌期子宮結(jié)合帶組織中GPR30、EGFR的表達觀察

周俊杰，孔紅霞，劉燕，陳雁南，楊立

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院，鄭州450052)

子宮腺肌病患者增生期及分泌期子宮結(jié)合帶組織中GPR30、EGFR的表達觀察

周俊杰，孔紅霞，劉燕，陳雁南，楊立

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院，鄭州450052)

目的 觀察子宮腺肌病患者增生期及分泌期子宮結(jié)合帶(JZ)組織中G蛋白偶聯(lián)受體30(GPR30)和表皮生長因子受體(EGFR) mRNA和蛋白的表達變化，并探討其與子宮腺肌病發(fā)病的關(guān)系。方法 42例行子宮全切術(shù)或子宮次全切術(shù)的患者中，25例子宮腺肌病患者(病例組，14例留取增殖期組織、11例留取分泌期組織)，17例宮頸病變或卵巢良性腫瘤患者(對照組，9例留取增殖期組織、8例留取分泌期組織)。獲取兩組JZ組織，采用實時熒光定量PCR法檢測GPR30、EGFR mRNA，采用免疫組化二步法檢測GPR30、EGFR蛋白。結(jié)果 對照組增生期JZ組織中GPR30、EGFR mRNA相對表達量及GPR30、EGFR蛋白陽性表達率均高于分泌期組織(P均<0.05)；病例組增生期、分泌期JZ組織中GPR30、EGFR mRNA相對表達量及GPR30、EGFR蛋白陽性表達率差異均無統(tǒng)計學意義；病例組分泌期JZ組織中EGFR mRNA相對表達量、GPR30蛋白陽性表達率高于對照組(P均<0.05)。結(jié)論 子宮腺肌病患者增生期和分泌期JZ組織中GPR30、EGFR mRNA及蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，GPR30、EGFR mRNA及蛋白的無周期性規(guī)律表達可能與子宮腺肌病的發(fā)病有關(guān)。

子宮腺肌??；子宮結(jié)合帶；G蛋白耦聯(lián)受體30；表皮生長因子受體

子宮結(jié)合帶(JZ)是由子宮基底層內(nèi)膜和內(nèi)1/3肌層構(gòu)成的區(qū)域。子宮內(nèi)膜和內(nèi)膜下肌層是在物種進化中保守的結(jié)構(gòu)功能單位，均為副中腎管起源，屬于“古子宮”；與之對應(yīng)的，內(nèi)膜下肌層之外的非副中腎管起源的平滑肌層構(gòu)成了“新子宮”。子宮腺肌病是子宮內(nèi)膜向子宮肌層生長導致的，其發(fā)病機制尚未明確。研究[1]認為子宮腺肌病是“古子宮”全層結(jié)構(gòu)或功能異常的疾病。子宮腺肌病作為激素依賴性疾病，其發(fā)生與雌激素調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)。G蛋白偶聯(lián)受體30(GPR30)作為功能性的膜受體參與雌激素的非基因組信號轉(zhuǎn)導，可作為獨立的雌激素膜受體在雌激素信號轉(zhuǎn)導及細胞生長、增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。表皮生長因子受體(EGFR)是G蛋白、細胞因子受體和整合素等多種信號通路的交匯點，介導細胞的生長、增殖、分化、黏附等生命活動，在機體的發(fā)育過程中起重要作用[2]本研究觀察了子宮腺肌病患者增生期及分泌期JZ組織中GPR30、EGFR mRNA和蛋白的表達變化，并探討其與子宮腺肌病發(fā)病的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年6月～2016年2月在鄭州大學第三附屬醫(yī)院行子宮全切術(shù)或子宮次全切術(shù)的患者42例，排除合并內(nèi)異癥、子宮內(nèi)膜息肉及子宮肌瘤者，排除合并內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)疾病和代謝性疾病者，術(shù)前3個月均未行激素類藥物治療。其中，25例子宮腺肌病患者(除外合并子宮肌瘤)為病例組，患者年齡35～52(44.7±0.8)歲，14例留取增殖期組織、11例留取分泌期組織；17例宮頸病變或卵巢良性腫瘤為對照組，患者年齡37～53(46.0±1.2)歲，9例留取增殖期組織、8例留取分泌期組織。兩組患者均月經(jīng)周期規(guī)律，一般資料具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準?；颊咝g(shù)前均簽署知情同意書。

1.2 JZ組織取材方法 參考文獻[3]方法將術(shù)中切下的子宮腔Y字形剖開，先輕輕刮取子宮內(nèi)膜，在內(nèi)膜基底層下5～8 mm內(nèi)取材作為JZ層。取1 cm3的組織標本，分為兩部分，一部分立即置入液氮罐中保存，用于實時熒光定量PCR檢測；余下部分用甲醛常規(guī)固定，用于免疫組化染色。

1.3 JZ組織中GPR30、EGFR mRNA檢測 將JZ組織剪碎，參照TRIzol法抽提RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。引物序列由奧科鼎盛生物公司合成。GPR30 mRNA上游引物序列為5′-CCTCACGGGCCACATTGTCA-3′，下游引物序列為5′-ACTGCTCGGTGCTGTCTGGAAT-3′；EGFR mRNA上游引物序列為5′-GCCAAGGCACGAGTAACAAG-3′，下游引物序列為5′-AGGGCAATGAGGACATAACCA-3′；內(nèi)參β-actin基因上游引物序列為5′-GCGGGAACTGCCTGACT-3′，下游引物序列為5′-CTCGTTGCCGATGGTGAT-3′。將生成的cDNA加入20 μL SYBR Green I實時熒光定量PCR的混合體系采用ABI7500熒光定量PCR儀進行擴增。參考文獻[4]方法，以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

1.4 JZ組織中GPR30、EGFR蛋白檢測 將JZ組織標本常規(guī)包埋、脫蠟和水化。分別加入GPR30抗體(1∶80)和EGFR抗體(1∶50)過夜。采用免疫組化二步反應(yīng)法進行染色，以PBS代替一抗作陰性對照，高倍鏡(400×)下觀察染色結(jié)果。每張切片至少觀察5個高倍鏡視野，以細胞質(zhì)和(或)細胞膜呈棕黃色或棕褐色為陽性細胞染色。按染色強度和陽性細胞百分比進行結(jié)果判定：無色計0分，輕度著色計1分，中度著色計2分，重度著色計3分；陽性細胞百分比<5%計0分，5%～<25%計1分，25%～<50%計2分，≥50%計3分；上述兩項評分乘積>3為蛋白表達陽性，≤3為蛋白表達陰性。

2 結(jié)果

2.1 兩組增生期及分泌期JZ組織中GPR30、EGFR mRNA表達比較 對照組增生期JZ組織中GPR30、EGFR mRNA相對表達量高于分泌期組織(P均<0.05)；病例組增生期、分泌期JZ組織中GPR30、EGFR mRNA相對表達量相比，P均>0.05；病例組分泌期JZ組織中EGFR mRNA相對表達量高于對照組(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組增生期及分泌期JZ組織中GPR30、EGFR mRNA相對表達量比較±s)

2.2 兩組增生期及分泌期JZ組織中GPR30、EGFR蛋白表達比較 GPR30、EGFR蛋白在JZ組織中均有表達，GPR30主要定位于細胞膜、部分表達于細胞質(zhì)，EGFR在細胞膜和細胞質(zhì)中均有表達。病例組增生期、分泌期JZ組織中GPR30蛋白陽性表達分別為13、8例，EGFR蛋白陽性表達分別為12、10例；對照組增生期、分泌期JZ組織中GPR30蛋白陽性表達分別為7、1例，EGFR蛋白陽性表達分別為8、1例。對照組增生期JZ組織中GPR30、EGFR蛋白陽性表達率高于分泌期組織(P均<0.05)；病例組增生期、分泌期JZ組織中GPR30、EGFR蛋白陽性表達率相比，P均>0.05；病例組分泌期JZ組織中GPR30蛋白陽性表達率高于對照組(P<0.05)。

3 討論

子宮腺肌病是由于JZ缺少子宮內(nèi)膜下層組織的保護作用，內(nèi)膜直接侵入與之緊密相連的子宮肌層，使JZ組織排列紊亂，同時伴有子宮平滑肌細胞反應(yīng)性增生所致。JZ結(jié)構(gòu)及功能破壞是子宮腺肌病發(fā)病的病理生理基礎(chǔ)。子宮腺肌病患者的JZ存在組織形態(tài)改變。MRI檢查示JZ彌漫性增厚超過12 mm則高度懷疑子宮腺肌病。子宮腺肌病患者的JZ在MRI圖像呈現(xiàn)彌漫性增厚的低信號強度區(qū)域，目前認為JZ增厚是平滑肌細胞過度增生引起[3]。1983年，Hricak等[5]首次借助MRI檢查提出“古子宮”的概念。研究證實，子宮腺肌病存在“古子宮”全層結(jié)構(gòu)或功能異常。JZ作為“古子宮”的一個重要區(qū)域，是子宮內(nèi)膜層和肌層間的重要連接組織。與“新子宮”相比，JZ對局部雌激素變化非常敏感。

一直以來，人們對雌激素作用途徑的研究主要集中在雌激素核受體通路上，認為雌二醇(E2)引起的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答完全由雌激素受體(ER)介導，即雌激素通過基因組效應(yīng)，激活細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，引起細胞生物學改變(如影響細胞周期)，從而導致細胞結(jié)構(gòu)和功能改變。正常情況下，細胞在多種機制下短暫激活EGFR對絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，可以防止因磷酸化激活下游產(chǎn)物ERK-1/2；而通過去磷酸化下調(diào)ERK-1/2表達，持續(xù)激活EGFR-MAPK通路則可能導致細胞過度增殖甚至發(fā)生癌變[6]。

越來越多的研究顯示，雌激素可通過結(jié)合雌激素膜受體GPR30快速激活細胞信號轉(zhuǎn)導通路及下游效應(yīng)分子[7]，介導雌激素的快速非基因組效應(yīng)[8，9]。GPR30基因位于染色體7p22，其mRNA全長為2 604 bp，編碼含375個氨基酸的蛋白。GPR30是7次跨膜G蛋白耦聯(lián)受體超家族的成員之一，其與傳統(tǒng)雌激素受體沒有同源性[10]，參與信號轉(zhuǎn)導的途徑主要有磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)途徑和MAPK途徑[11]。GPR30通過促使肝素結(jié)合表皮生長因子，反向激活EGFR，介導下游的EGFR家族激活蛋白激酶或脂質(zhì)激酶的級聯(lián)反應(yīng)，促進細胞增殖與分化，最終導致細胞功能變化[12]。GPR30還能單獨介導雌激素激活EGFR，使ER陰性的乳腺癌細胞對雌激素敏感[13]。在多種雌激素依賴性疾病中，GPR30呈高表達并參與E2介導的雌激素效應(yīng)，如刺激細胞增生、增強細胞遷移能力、調(diào)控細胞凋亡等[14,15]。

本研究選取育齡婦女的JZ組織作為研究對象，證實了GPR30和EGFR在JZ組織均有表達，且主要位于細胞質(zhì)和(或)細胞膜中，這與GPR30作為雌激素細胞外信號轉(zhuǎn)導受體的理論相吻合[12]。研究發(fā)現(xiàn)，在正常婦女子宮內(nèi)膜中，GPR30在增生期內(nèi)膜的表達水平高于分泌期內(nèi)膜，呈周期性變化，推測這種變化與其介導的雌激素效應(yīng)刺激子宮內(nèi)膜增生有關(guān)[8]。而本研究病例組中GPR30 mRNA及蛋白的表達無明顯周期性變化，呈持續(xù)高表達，這一變化可能與子宮腺肌病患者的JZ組織失去了雌激素的正常調(diào)控有關(guān)。GPR30在JZ組織中持續(xù)高水平表達可能使局部組織出現(xiàn)高雌激素狀態(tài)。GPR30可能通過雌激素介導的快速非基因效應(yīng)誘導JZ組織異常增殖和分化，導致JZ組織穩(wěn)定性遭到破壞，促進子宮腺肌病的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)病例組分泌期JZ組織中EGFR mRNA表達較對照組增強，說明EGFR對子宮腺肌病的發(fā)病有重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)雌激素能促進EGFR的合成,提高EGFR的感受性，使得與其受體結(jié)合后，通過其促有絲分裂作用而促進細胞生長與增殖。

本研究結(jié)果顯示，子宮腺肌病患者增生期和分泌期JZ組織中GPR30、EGFR mRNA及蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，GPR30、EGFR mRNA及蛋白的無周期性規(guī)律表達可能與子宮腺肌病的發(fā)病有關(guān)。這為研究GPR30信號轉(zhuǎn)導通路與子宮腺肌病的關(guān)系提供了依據(jù)。但由于本研究納入樣本量有限，上述結(jié)論和推測尚待進一步證實。

[1] 李曉川,郎景和.古子宮與子宮內(nèi)膜異位癥[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2011,46(3):219-221.

[2] Hackel PO, Zwick E, Prenzel N, et al. Epidermal growth factor receptors: critical mediators of multiple receptor pathways[J] . Curr Opin Cell Biol, 1999,11(2):184-189.

[3] 王珺,張恒輝.雌激素受體-α在子宮腺肌病子宮內(nèi)膜肌層交界區(qū)中的表達[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2010,90(27):1914-1917.

[4] 劉晶晶,段華.一氧化氮在子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜-肌層交界區(qū)平滑肌細胞中的表達及意義[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2013,48(7):504-507.

[5] Hricak H, Alpers C, Crooks LE, et al. Magnetic resonance imaging of the female pelvis: initial experience[J]. AJR Am J Roentgenol, 1983,141(6):1119-1128．

[6] 徐學麟,林俊,江秀秀,等.GPR30在子宮平滑肌瘤細胞增殖中的作用研究[J].實用腫瘤雜志,2014,29(3):234-238.

[7] Pandey DP, Lappano R, Albanito L, et al. Estrogenic GPR30 signalling induces proliferation and migration of breast cancer cells through CTGF[J]. EMBO J, 2009,28(5):523-532.

[8] Mehasseb MK, Taylor AH, Pringle JH, et al. Enhanced invasion of stromal cells from adenomyosis in a three-dimensional coculture model is augmented by the presence of myocytes from affected uteri[J]. Fertil Steril, 2010,94(7):2547-2551.

[9] Filardo EJ, Quinn JA, Bland KI, et al. Estrogen-induced activation of Erk-1 and Erk-2 requires the G protein-coupled receptor homolog,GPR30,and occurs via trans-activation of the epidermal growth factor receptor through release of HB-EGF[J]. Mol Endocrinol, 2000,14(10):1649-1660.

[10] 陳淑玲,王庭槐.新型雌激素受體GPR30/GPER1及其在乳腺癌中的作用[J].生理科學進展,2012,43(1):75-80.

[11] Revankar CM, Cimino DF, Sklar LA, et al. A transmembrane intracellular estrogen receptor mediates rapid cells ignaling [J]. Science, 2005,307(5715):1625-1630.

[12] Prossnitz ER, Maggiolini M. Non-genomic signaling by steroids[J]. Mol Cell Endocrinol, 2009,308(1-2):1-2.

[13] Vassart G, Costagliola S. G protein-coupled receptors:mutations and endorine dieases[J].Nat Rev Endocrinol, 2011,7(6)：362-372.

[14] Chevalier N, Vega A, Bouskine A, et al. GPR30,the Non-Classical Membrance G protein Related Estrogen Receptor, Is Overexpressed in Human Seminoma and Promotes Seminoma Cell Proliferation[J]. PLoS One, 2012,7(4):e34672.

[15] Ruan SQ, Wang SW, Wang ZH, et al. Regulation of HRG-betal-induced proliferation,migration and invasion of MCF-7 cells by upregulation of GPR30 expression[J]. Mol Med Report, 2012,6(1):131-138.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.029

R711.74

B

1002-266X(2016)47-0092-03

2016-07-18)