補(bǔ)腎調(diào)沖方劑灌胃的卵巢早衰大鼠血清性激素水平和卵巢組織VEGF、bFGF蛋白表達(dá)變化

徐文君，高慧，李楊

(1華北理工大學(xué),河北唐山 063000;2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

補(bǔ)腎調(diào)沖方劑灌胃的卵巢早衰大鼠血清性激素水平和卵巢組織VEGF、bFGF蛋白表達(dá)變化

徐文君1，高慧2，李楊1

(1華北理工大學(xué),河北唐山 063000;2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的 觀察補(bǔ)腎調(diào)沖方劑灌胃的卵巢早衰大鼠血清性激素水平和卵巢組織VEGF、bFGF蛋白表達(dá)變化。方法 將60只SD雌性大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。分別設(shè)為對(duì)照組、模型組、補(bǔ)腎調(diào)沖方低劑量組、補(bǔ)腎調(diào)沖方中劑量組、補(bǔ)腎調(diào)沖方高劑量組、西藥組。對(duì)照組正常飲水。模型組給予75 mg/kg雷公藤多苷溶液灌胃,1次/d，連續(xù)14 d。補(bǔ)腎調(diào)沖低、中、高劑量組大鼠上午9點(diǎn)給予75 mg/kg雷公藤多苷溶液灌胃，1次/d，連續(xù)14 d；下午7點(diǎn)分別給予6、12、24 g/kg補(bǔ)腎調(diào)沖方湯劑灌胃，1次/d，連續(xù)36 d。西藥組大鼠上午9點(diǎn)給予75 mg/kg雷公藤多苷溶液灌胃，1次/d，連續(xù)14 d；下午7點(diǎn)給予0.625 mg/kg結(jié)合雌激素溶液灌胃，1次/d，連續(xù)36 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)，采用免疫組化法測(cè)算各組大鼠卵巢組織VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)蛋白平均積分光密度(IOD)值。結(jié)果 ①與對(duì)照組相比，模型組血清FSH 、LH升高(P均<0.05)，血清E2降低(P<0.05)。與模型組相比，補(bǔ)腎調(diào)沖低、中、高劑量組和西藥組血清FSH、LH降低(P均<0.05)，E2升高(P均<0.05)。補(bǔ)腎調(diào)沖低、中、高劑量組血清FSH、E2及補(bǔ)腎調(diào)沖低劑量組血清LH與西藥組相比,P均>0.05，補(bǔ)腎調(diào)沖中、高劑量組血清LH高于西藥組(P均<0.05)。各組血清P相比,P均>0.05。②與對(duì)照組相比，模型組卵巢組織VEGF、bFGF蛋白IOD值降低(P均<0.05)。與模型組相比，補(bǔ)腎調(diào)沖低、中、高劑量組和西藥組VEGF、bFGF蛋白IOD值升高(P均<0.05)。補(bǔ)腎調(diào)沖低劑量組VEGF蛋白和補(bǔ)腎調(diào)沖低、中劑量組bFGF蛋白IOD值與西藥組相比(P均<0.05)，補(bǔ)腎調(diào)沖中、高劑量組VEGF蛋白和補(bǔ)腎調(diào)沖高劑量組bFGF蛋白與西藥組相比,P均>0.05。結(jié)論 補(bǔ)腎調(diào)沖方灌胃的卵巢早衰大鼠血清FSH、LH降低，E2升高，卵巢組織VEGF、bFGF表達(dá)升高。12、24 g/kg補(bǔ)腎調(diào)沖方湯劑灌胃的效果與0.625 mg/kg結(jié)合雌激素溶液灌胃的效果相當(dāng)。

補(bǔ)腎調(diào)沖方；卵巢早衰；卵泡刺激素；黃體生成素；雌二醇；孕酮；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子

卵巢早衰主要表現(xiàn)為女性40歲以前出現(xiàn)的性器官萎縮及持續(xù)閉經(jīng)，發(fā)病率逐年增加且呈現(xiàn)低齡化趨勢(shì)。卵巢早衰患者促卵泡刺激素(FSH)及黃體生成素(LH)升高，雌二醇(E2)降低。中藥補(bǔ)腎調(diào)沖方是根據(jù)“腎主生殖”“沖任學(xué)說(shuō)”等理論創(chuàng)立的方劑[1]。主要組成為菟絲子、巴戟天、肉蓯蓉、補(bǔ)骨脂、當(dāng)歸、川芎、熟地、五味子、紫石英九味中藥。全方合用共奏滋補(bǔ)肝腎,平衡陰陽(yáng),疏達(dá)肝氣, 調(diào)理沖任氣血之效[2]。臨床上使用本方治療卵巢早衰取得了較好的效果，但其機(jī)制不明。本研究在用雷公藤多苷片制作大鼠卵巢早衰動(dòng)物模型的同時(shí)給予補(bǔ)腎調(diào)沖方湯劑灌胃，觀察大鼠血清FSH、LH、E2、孕酮(P)水平和卵巢組織VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)表達(dá)變化，旨在探討補(bǔ)腎調(diào)沖方湯劑治療大鼠卵巢早衰的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)SD雌性大鼠20只，12周齡，體質(zhì)量250～270 g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(京)2014-0004。中藥補(bǔ)腎調(diào)沖方組方由菟絲子15 g、黃精15 g、熟地15 g、肉蓯蓉10 g、巴戟天10 g、當(dāng)歸10 g、川芎6 g、紫石英15 g、五味子6 g組成，藥品購(gòu)自安國(guó)市長(zhǎng)安中藥材有限公司，批號(hào)20150824,由同濟(jì)大藥房按常規(guī)方法煎煮，濾紙濃縮至生藥2.5 g/mL，4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＠坠俣嘬掌科坠俣嘬?0 mg，購(gòu)自遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司，批號(hào)20150617,研碎后加入等體積雙蒸水融化，稀釋后備用。結(jié)合雌激素片規(guī)格0.625 mg/片，購(gòu)自新疆新資源生物制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)20150608,研碎后加入等體積雙蒸水融化,稀釋后備用。大鼠的FSH、LH、E2、P酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20150605；兔抗鼠VEGF多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森公司；兔抗鼠bFGF多克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司；即用型免疫組化試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司。Multiskan MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自芬蘭Thermo公司；Thermo ExcelsiorTMES自動(dòng)組織脫水機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo Electron公司;顯微鏡照相系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Lecia公司。

1.2 大鼠分組及造模、補(bǔ)腎調(diào)沖方應(yīng)用方法 將60只SD雌性大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為對(duì)照組、模型組、補(bǔ)腎調(diào)沖低劑量組、補(bǔ)腎調(diào)沖中劑量組、補(bǔ)腎調(diào)沖高劑量組、西藥組。對(duì)照組自由飲水。模型組給予75 mg/kg雷公藤多苷溶液灌胃,1次/d，連續(xù)14 d。補(bǔ)腎調(diào)沖低、中、高劑量組大鼠上午9點(diǎn)給予75 mg/kg雷公藤多苷溶液灌胃，1次/d，連續(xù)14 d；下午7點(diǎn)分別給予6、12、24 g/kg補(bǔ)腎調(diào)沖方湯劑灌胃，1次/d，連續(xù)36 d。西藥組大鼠上午9點(diǎn)給予75 mg/kg雷公藤多苷溶液灌胃，1次/d，連續(xù)14 d；下午7點(diǎn)給予0.625 mg/kg結(jié)合雌激素溶液灌胃，1次/d，連續(xù)36 d。

1.3 各組血清性激素水平檢測(cè) 用藥完成后將各組大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置、離心分離血清，采用ELISA法檢測(cè)FSH、LH、E2、P。操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 各組卵巢組織VEGF、bFGF蛋白檢測(cè) 用藥完成后將各組大鼠麻醉，無(wú)菌取卵巢組織，多聚甲醛固定，自動(dòng)脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片后待測(cè)。檢測(cè)時(shí)將切片脫蠟，PBS清洗，微波爐內(nèi)梯度加熱，滴加H2O2和封閉液后，繼續(xù)用PBS沖洗，滴加VEGF、bFGF抗體，抗體濃度為1∶50，37 ℃溫箱內(nèi)孵育30 min，4 ℃過(guò)夜。次日加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液、二抗工作液，37 ℃孵育25 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染,中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，陽(yáng)性區(qū)域呈棕黃色。200倍光鏡下用顯微攝像系統(tǒng)隨機(jī)攝取5個(gè)視野，用IPP6.0軟件測(cè)算VEGF、bFGF平均積分光密度(IOD)值。

2 結(jié)果

2.1 各組血清性激素水平比較 各組血清FSH、LH、 E2、P水平見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，模型組血清FSH 、LH升高(P均<0.05)，E2降低(P<0.05)。與模型組相比，補(bǔ)腎調(diào)沖低、中、高劑量組和西藥組血清FSH、LH降低(P均<0.05)，E2升高(P均<0.05)。補(bǔ)腎調(diào)沖低、中、高劑量組血清FSH、E2及補(bǔ)腎調(diào)沖低劑量組血清LH與西藥組相比,P均>0.05，補(bǔ)腎調(diào)沖中、高劑量組血清LH高于西藥組(P均<0.05)。各組血清P相比,P均>0.05。

表1 各組血清FSH、LH、 E2、P水平比較

注:與對(duì)照組相比，#P<0.05；與模型組相比，△P<0.01；與西藥組相比，#P<0.05。

2.2 各組卵巢組織VEGF、bFGF蛋白比較 各組卵巢組織VEGF、bFGF蛋白IOD值見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，模型組卵巢組織VEGF、bFGF蛋白IOD值降低(P均<0.05)。與模型組相比，補(bǔ)腎調(diào)沖低、中、高劑量組和西藥組VEGF、bFGF蛋白IOD值升高(P均<0.05)。補(bǔ)腎調(diào)沖低劑量組VEGF蛋白和補(bǔ)腎調(diào)沖低、中劑量組bFGF蛋白IOD值與西藥組相比,P均<0.05，補(bǔ)腎調(diào)沖中、高劑量組VEGF蛋白和補(bǔ)腎調(diào)沖高劑量組bFGF蛋白與西藥組相比,P>0.05。

3 討論

雷公藤多苷為中草藥雷公藤根莖提取物中的活性成分，具有抗炎、抗腫瘤等活性成分，廣泛應(yīng)用于治療腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病,但其毒性明顯，長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、血管等造成損害[3]。高慧教授發(fā)現(xiàn)使用雷公藤藥物制劑治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎炎等疾病時(shí)，可引起女性月經(jīng)不調(diào)及閉經(jīng)等癥狀，因此懷疑雷公藤多苷片可損傷卵巢功能，并首創(chuàng)使用雷公藤藥物制劑制作大鼠卵巢早衰模型[4]。

表2 各組卵巢組織VEGF、bFGF蛋白IOD值比較

注：與對(duì)照組相比，#P<0.05；與模型組相比，△P<0.05；與西藥組相比，#P<0.05。

FSH、LH水平是反映卵巢儲(chǔ)備功能力的間接指標(biāo)，F(xiàn)SH、LH水平升高與卵巢儲(chǔ)備能力降低有關(guān)。E2是在FSH的作用下由竇狀卵泡產(chǎn)生。隨著卵泡庫(kù)存的減少，E2水平逐漸降低，從而導(dǎo)致FSH升高，因此E2可作為檢測(cè)卵巢儲(chǔ)備力的直接指標(biāo)[5]。FSH是刺激卵泡發(fā)育的最首要激素，也可用來(lái)監(jiān)測(cè)藥物對(duì)卵巢的損傷程度[6]。臨床上認(rèn)為血清FSH>10 IU/L者可能處于卵巢功能衰退的隱匿期,FSH進(jìn)一步升高即可認(rèn)為卵泡儲(chǔ)備功能降低。若血清FSH一次測(cè)定高于30 IU/L,即可診斷高促性腺激素血癥。若間隔一個(gè)月以上兩次測(cè)定FSH>40 IU/L,則患者可能己經(jīng)發(fā)展為卵巢早衰[7]。本研究發(fā)現(xiàn)造模后大鼠血清FSH、LH水平升高，E2水平降低，說(shuō)明造模成功。補(bǔ)腎調(diào)沖方各劑量組在造模同時(shí)，給補(bǔ)腎調(diào)沖方湯劑灌胃，用藥完成后，大鼠血清FSH、LH水平較模型組低，E2水平高，且以中、高劑量組干預(yù)效果明顯，提示補(bǔ)腎調(diào)沖方能有效提高血清E2水平，降低血清FSH、LH水平。

卵巢早衰的原因主要是原始卵泡儲(chǔ)備過(guò)少、閉鎖或者耗竭太快。卵巢血流是維持卵泡生長(zhǎng),類固醇激素分泌及卵泡對(duì)促性腺激素敏感性的重要因素[8]，VEGF、bFGF為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，可修復(fù)受損卵泡，改善受損卵巢血管通透性，尤其可以特異性的促進(jìn)類固醇激素生成器官的細(xì)胞增殖存活和趨化[9]，促進(jìn)新生血管生成。bFGF在黃體生成中起到重要的作用，主要表現(xiàn)在能促進(jìn)卵泡黃體的生長(zhǎng)發(fā)育，還能給黃體實(shí)體提供營(yíng)養(yǎng)[10]。有研究報(bào)道，卵巢血流的80%～90%是供給黃體的[11]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組VEGF及bFGF的表達(dá)降低，表明卵巢早衰大鼠卵巢血管新生能力受損。補(bǔ)腎調(diào)沖低、中、高劑量組卵巢組織VEGF及bFGF的表達(dá)量與模型組相比增加，中高劑量組效果顯著，說(shuō)明補(bǔ)腎調(diào)沖方中劑量即可促進(jìn)卵巢早衰大鼠卵巢組織的血管新生。筆者推測(cè)這與補(bǔ)腎調(diào)沖方中當(dāng)歸養(yǎng)血活血、川芎活血調(diào)經(jīng)的作用有關(guān)。

補(bǔ)腎調(diào)沖法[12]含義為滋補(bǔ)肝腎，平衡陰陽(yáng)，疏達(dá)肝氣，調(diào)理沖任氣血，補(bǔ)腎實(shí)則補(bǔ)五臟六腑之虛，調(diào)沖即是疏泄肝木，調(diào)理沖任氣血陰陽(yáng)，使之達(dá)到?jīng)_和的狀態(tài)。補(bǔ)腎調(diào)沖方[13]以菟絲子、巴戟天、黃精、熟地黃、肉蓯蓉補(bǔ)腎，以當(dāng)歸、川芎、紫石英調(diào)沖為主的兩大部分組成。方中巴戟天性潤(rùn)而不燥，補(bǔ)腎陽(yáng)益精血；菟絲子能溫腎壯陽(yáng)，調(diào)補(bǔ)沖任；黃精平補(bǔ)三臟，強(qiáng)壯固本；熟地黃生精血、補(bǔ)五臟、通血脈；肉蓯蓉可養(yǎng)命門、滋腎氣；當(dāng)歸可破宿血，補(bǔ)不足；川芎可下調(diào)經(jīng)水；紫石英為血肉有情之品，可治療不孕及補(bǔ)諸不足。諸藥合用可通調(diào)氣血，滋陰補(bǔ)腎，平衡陰陽(yáng)，充分體現(xiàn)了中藥治病調(diào)整體內(nèi)外環(huán)境的平衡狀態(tài)、以平為期、以和為目的的理念?，F(xiàn)代研究也表明[14]，活血藥可促進(jìn)內(nèi)生殖器血液循環(huán)，豐富神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)，增加卵巢等內(nèi)分泌腺體的血供，改善子宮、卵巢血供，促進(jìn)卵泡發(fā)育。綜上所述，補(bǔ)腎調(diào)沖方灌胃的卵巢早衰大鼠血清FSH、LH降低，E2升高，提高卵巢組織VEGF、bFGF表達(dá)。12、24 g/kg補(bǔ)腎調(diào)沖方湯劑灌胃的效果與0.625 mg/kg結(jié)合雌激素溶液灌胃的效果相當(dāng)。

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河北省省級(jí)重大醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(zyzd2013018);河北省政府資助臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2014571024)；國(guó)家中醫(yī)藥管理局全國(guó)名老中醫(yī)藥專家高慧傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目(2015048157)。

高慧(E-mail: gaohuihbcd@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.012

R711.75

A

1002-266X(2016)47-0041-03

2016-07-15)