藍(lán)莓原漿聯(lián)合益生菌灌胃治療大鼠非酒精性脂肪肝的效果及其機(jī)制

趙珮伶，任婷婷，祝娟娟，程明亮，王珺

(1貴州醫(yī)科大學(xué),貴陽 550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

藍(lán)莓原漿聯(lián)合益生菌灌胃治療大鼠非酒精性脂肪肝的效果及其機(jī)制

趙珮伶1，任婷婷1，祝娟娟1，程明亮1，王珺2

(1貴州醫(yī)科大學(xué),貴陽 550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的 觀察藍(lán)莓原漿聯(lián)合益生菌灌胃治療大鼠非酒精性脂肪肝的效果，并探討其機(jī)制。 方法 選取50只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常組(NC組)、模型組(MC組)、藍(lán)莓原漿益生菌低劑量組(BPL組)、藍(lán)莓原漿益生菌中劑量組(BPM組)、藍(lán)莓原漿益生菌高劑量組(BPH組)。除NC組外其余4組均喂養(yǎng)高脂飼料制備非酒精性脂肪肝模型。BPL、BPM、BPH組造模后給予藍(lán)莓原漿原漿0.25、0.5、1.0 mL/100g和益生菌0.53×107、1.05×107、2.10×107CFU灌胃，1次/d。共12 周。第12周末觀察各組大鼠一般情況，然后處死大鼠，取血分離血清，檢測血清ALT、AST、TG、TC、LDL、HDL；取肝組織行HE及油紅O染色，光鏡下觀察肝組織病理變化；用TUNEL法檢測肝組織肝細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)；用免疫組化法和Western blotting法檢測肝組織Fas、FasL蛋白；用實(shí)時熒光定量PCR法檢測肝組織Fas、FasL mRNA 。 結(jié)果 與MC組相比，BPL、BPM、BPH組大鼠血清中HDL、TG、TC、ALT、AST降低(P均<0.05)、LDL升高(P均<均0.05), 肝組織脂肪沉積減少, 肝細(xì)胞AI降低(P均<0.05), Fas、FasL蛋白和mRNA表達(dá)均降低(P均<0.05)。與BPL、BPM組相比，BPH組上述變化下降較為顯著。結(jié)論 藍(lán)莓原漿聯(lián)合益生菌治療高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪肝，能改善肝功能，減輕肝組織病理損傷，其機(jī)制可能與藍(lán)莓原漿聯(lián)合益生菌抑制肝細(xì)胞Fas、FasL表達(dá)繼而抑制肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。

藍(lán)莓原漿；益生菌；非酒精性脂肪性肝??；脂肪酸合成酶；脂肪酸合成酶配體；細(xì)胞凋亡

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)包括非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關(guān)肝硬化。病理性氧化應(yīng)激致使肝細(xì)胞受損，進(jìn)一步誘發(fā)肝細(xì)胞過度凋亡是NAFLD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[1，2]。NAFLD發(fā)生過程中，細(xì)胞凋亡是肝細(xì)胞損傷和炎癥與脂肪化的樞紐，持續(xù)氧化應(yīng)激加劇炎癥反應(yīng)及肝細(xì)胞變性，進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞并誘發(fā)凋亡，加快NAFLD發(fā)展[3]。脂肪酸合成酶(Fas)及其配體FasL參與細(xì)胞凋亡相關(guān)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[4]。益生菌可改善腸道內(nèi)菌群失調(diào)，減輕腸道內(nèi)毒素水平及肝細(xì)胞凋亡。本課題組前期研究表明, 藍(lán)莓原漿有顯著的抗氧化效能且可預(yù)防大鼠的NAFLD。但未見將藍(lán)莓原漿和益生菌聯(lián)合治療大鼠NAFL的報(bào)道。本研究觀察了藍(lán)莓原漿聯(lián)合益生菌灌胃對NAFL大鼠肝功能、肝臟病理損傷程度、肝細(xì)胞凋亡程度和肝組織Fas、FasL表達(dá)的影響，評價藍(lán)莓原漿聯(lián)合益生菌治療大鼠NAFL的效果并探討其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠50只, 清潔級, 體質(zhì)量(155±20)g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心(批號SYXK黔2012-0001)。藍(lán)莓原漿購自貴州省麻江縣藍(lán)莓原漿基地。益生菌(含嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌活菌)購自上海信誼藥業(yè)有限公司，規(guī)格: 210 mg /膠囊，含活菌5×107CFU/g。高脂飼料成分為88.2%普通飼料+10%豬油+1.5%膽固醇+0.2%膽酸鈉，購自江蘇美迪森生物有限公司，批號MD1205。Tunnel試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，兔抗鼠Fas、FasL多克隆抗體購自Abcam公司，兔抗鼠Fas、FasL多克隆抗體(Abcam公司)，兔抗鼠一抗和β-actin購自博士德生物技術(shù)有限公司，羊抗兔二抗標(biāo)記物辣根過氧化物酶購自上?；蚬こ滩?，BCA定量蛋白試劑盒購自Biomiga公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自百樂公司，總RNA提取純化試劑盒購自Biomiga公司，SYBR PremixEx Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)、RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)購自寶生物工程有限公司(批號RR047A)，F(xiàn)as、FasL、β-actin引物購自寶生物工程有限公司,ViiA7 Real-time PCR System購自美國Applied 公司，NANO-drop 2000超微量分光光度計(jì)購自美國Thermal scientific公司，EPS-601電泳儀購自美國Amersham公司，SynergyH4多功能酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司，Olympus BX41顯微鏡圖像采集系統(tǒng)購自日本Olympus公司。

1.2 大鼠分組及藍(lán)莓原漿、益生菌應(yīng)用 將50只大鼠隨機(jī)分為正常組(NC組)、模型組(MC組)、藍(lán)莓原漿益生菌低劑量組(BPL組)、藍(lán)莓原漿益生菌中劑量組(BPM組)、藍(lán)莓原漿益生菌高劑量組(BPH組)，每組10只。除NC組外其余4組均喂養(yǎng)高脂飼料制備NAFL模型。BPL、BPM、BPH組造模后給予藍(lán)莓原漿原漿0.25、0.5、1.0 mL/100 g[5]和益生菌0.53×107、1.05×107、2.10×107CFU灌胃，1次/d。共12 周。NC和MC組每天給予等量生理鹽水灌胃,共12 周。

1.3 各組大鼠一般情況觀察 觀察記錄第12周各組大鼠一般情況，包括精神、反應(yīng)、活動。

1.4 各組大鼠血清肝功能、血脂指標(biāo)檢測 第12周末處死各組大鼠，眼動脈放血取血，分離血清，用全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST、TG、TC、LDL、HDL。

1.5 各組大鼠肝組織脂肪變性情況及肝細(xì)胞內(nèi)脂滴觀察 第12周末處死各組大鼠,提取肝上葉組織用4%甲醛固定，常規(guī)制作切片，行HE染色，光鏡下觀察肝組織損傷情況；行油紅O染色觀察肝細(xì)胞內(nèi)脂滴。

1.6 各組大鼠肝組織肝細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)測算 取上述切片，常規(guī)脫蠟，蛋白酶K 修復(fù)，滴加TUNEL 混合液標(biāo)記DNA片段，行DAB 顯色、復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，普通顯微鏡下觀察。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞。每張蓋玻片隨機(jī)選取5 個400 倍不連續(xù)視野，每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，計(jì)算各視野凋亡細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)的百分比，取其平均數(shù)為AI。

1.7 各組大鼠肝組織Fas、FasL蛋白檢測 ①免疫組化法:取上述肝組織切片行修復(fù)抗原、滅活內(nèi)源性酶，滴加一抗1∶1 000(山羊抗鼠Fas、FasL多克隆抗體)，滴加通用型二抗1∶2 500，行DAB 顯色和復(fù)染，常規(guī)封片。在每張蓋玻片隨機(jī)選取5 個400 倍不連續(xù)視野，觀察 Fas、FasL蛋白表達(dá)。Fas、FasL蛋白表達(dá)于肝細(xì)胞胞質(zhì)中會呈現(xiàn)棕褐色顆粒。肝細(xì)胞胞質(zhì)呈棕褐色為陽性染色。用Image-Pro Plus6.0系統(tǒng)分析圖像，F(xiàn)as、FasL蛋白表達(dá)量用平均積分光密度值(AIOD)表示。②Western blotting法: 取各組大鼠肝組織，參照TRIzol試劑盒說明提取胞質(zhì)蛋白, 加熱變性后行SDS-PAGE電泳，印記至PVDF 膜，一抗1∶2 000雜交4 ℃過夜, 二抗1∶10 000避光室溫雜交1 h, 化學(xué)發(fā)光劑曝光顯影, Gel DocEQ儀器掃描, Quantity One軟件分析結(jié)果。以β-actin為內(nèi)參照，結(jié)果用目標(biāo)蛋白表達(dá)量用其蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示。

1.8 各組大鼠肝組織Fas、FasL mRNA檢測 采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時定量PCR法。取各組大鼠肝組織，采用一步法提取100 g肝組織中的總RNA并純化，分析其完整性，測定RNA的濃度及純度，按First Stmnd cDNA synthesis Kit說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后行qRT-PCR。以β-actin為內(nèi)參照。Fas上游引物為5′- CTGGAATCCCAAGTCCTGAA-3′, 下游引物為5′- TAAAGCTTGACACGCACCAG-3′;FasL上游引物為5′- TAAAGCTTGACACGCACCAG-3′, 下游引物為5′- CAATGGGACACTGGCTTTTT-3′;β-actin上游引物為5′-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT-3′，下游引物為5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGAA-3′。用2-ΔΔCt表示各組大鼠肝組織Fas、FasL mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

NC組大鼠精神充沛、反應(yīng)敏捷、活動正常，其余組大鼠精神萎靡、反應(yīng)愚鈍、活動減少。與MC組相比，BPL、BPM、BPH組大鼠精神可，反應(yīng)稍好，活動稍多。

2.1 各組大鼠血清肝功能和血脂指標(biāo)比較 各組大鼠血清肝功能和血脂見表1。由表1可見，與NC組相比，MC、BPL、BPM、BPH組大鼠血清ALT、AST、TG、TC、LDL高(P均<0.05)，HDL低(P均<0.05)。與MC組相比，BPL、BPM、BPH組大鼠血清ALT、AST、TG、TC、LDL低(P均<0.05)，HDL高(P均<0.05)。BPL組和BPM組上述指標(biāo)相比，P均>0.05。與BPL組和BPM組相比，BPH組大鼠血清ALT、AST、TG、TC、LDL低(P均<0.05)，HDL高(P均<0.05)。

2.2 各組大鼠肝組織脂肪變性情況及肝細(xì)胞內(nèi)脂滴比較 HE染色顯示NC組大鼠肝小葉和細(xì)胞無異常。MC組大鼠肝實(shí)質(zhì)脂肪廣泛變性，其小葉結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞彌漫性脂肪樣變，胞質(zhì)有不同形狀的脂滴空泡，核變性或偏于一側(cè)，門管區(qū)及腺泡內(nèi)可見細(xì)胞碎屑樣壞死和炎性浸潤。BPL組和BPM組脂肪變性程度較MC組略有差異,BPH組肝組織脂肪變性較輕，小葉形態(tài)和肝索布局欠完整，肝細(xì)胞輕度脂肪變，細(xì)胞內(nèi)的炎性浸潤和壞死明顯減少。油紅O染色顯示NC組肝細(xì)胞正常;MC組肝細(xì)胞邊沿稍融合，核多呈印戒狀損傷且形狀不規(guī)則，胞質(zhì)聚集橘紅色脂滴。BPL、BPM、BPH組較MC組肝細(xì)胞形態(tài)有所改善，脂滴沉積相對減少，其中BPH組改善最為明顯。

表1 各組大鼠肝功能指標(biāo)和血脂水平比較±s)

注：與NC組相比，△P<0.05;與MC組相比，▲P<0.05；與BPL、BPM組相比，#P<0.05。

2.3 各組大鼠肝組織AI比較 NC、MC、BPL、BPM、BPH組肝組織AI分別為4.82%±1.13%、30.10%±2.67%、25.38%±1.79%、22.32%±3.14%、14.93%±2.45%。與NC組相比，MC、BPL、BPM、BPH組肝組織AI高(P均<0.05)；與MC組相比，BPL、BPM、BPH組肝組織AI低(P均<0.05)；與BPH組相比，BPM、BPL組肝組織AI低(P均<0.05)；BPM、BPL組肝組織AI相比,P>0.05。

2.4 各組大鼠肝組織Fas、FasL蛋白比較 各組大鼠肝組織Fas、FasL蛋白AIOD和相對表達(dá)量見表2。與NC組相比，MC、BPL、BPM、BPH組肝組織Fas、FasL蛋白AIOD和相對表達(dá)量高(P均<0.05)；與MC組相比，BPL、BPM、BPH組肝組織Fas、FasL蛋白AIOD和相對表達(dá)量低(P均<0.05)；與BPH組相比，BPM、BPL組肝組織Fas、FasL蛋白AIOD和相對表達(dá)量低(P均<0.05)；BPM、BPL組肝組織Fas、FasL蛋白AIOD和相對表達(dá)量相比,P均>0.05。

表2 各組大鼠肝組織Fas、FasL蛋白AIOD和相對表達(dá)量比較

注：與NC組相比，△P<0.05;與MC組相比，▲P<0.05；與BPL、BPM組相比，#P<0.05。

2.6 各組大鼠肝組織Fas、FasL mRNA比較 各組大鼠肝組織Fas、FasL mRNA見表3。與NC組相比，MC、BPL、BPM、BPH組肝組織Fas、FasL mRNA較高(P均<0.05)；與MC組相比，BPL、BPM、BPH組肝組織Fas、FasL mRNA較低(P均<0.05)；與BPH組相比，BPM、BPL組肝組織Fas、FasL mRNA較低(P均<0.05)；BPM、BPL組肝組織Fas、FasL mRNA相比，P均>0.05。

表3 各組大鼠肝組織Fas、FasL mRNA比較

注：與NC組相比，△P<0.05;與MC組相比，▲P<0.05；與BPL、BPM組相比，#P<0.05。

3 討論

NAFLD與肥胖、糖尿病、脂肪代謝紊亂、內(nèi)毒素顯著相關(guān)，疾病發(fā)展由NAFL、NASH向其相關(guān)硬化和癌癥演變[7，8]。凋亡在NAFLD中是觸發(fā)NAFL向可能發(fā)展為肝纖維化和肝癌的 NASH進(jìn)展的關(guān)鍵[9，10]。在NAFLD病程中，肝臟中大量的游離脂肪酸(FFAs)堆積將誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡[11]。研究表明，其凋亡的歷程能趨化中性粒細(xì)胞并釋放TNF-α等炎癥因子，通過NF-κB和JNK等信號通路觸發(fā)炎癥，加重炎癥反應(yīng)[12]。凋亡小體通過激活肝星狀細(xì)胞HSC或者Kuffer細(xì)胞，促肝纖維化形成,導(dǎo)致NAFLD病程進(jìn)展[12、13]。

在細(xì)胞凋亡中，F(xiàn)as/ FasL 系統(tǒng)主導(dǎo)凋亡性死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。FasL誘導(dǎo)Fas 結(jié)合后形成三聚體，使死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白(FADD)在細(xì)胞內(nèi)受體區(qū)域募集，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(DISC)，觸發(fā)半胱天冬家族酶鏈反應(yīng)，最終破壞細(xì)胞微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。

目前調(diào)整飲食和生活方式的是治療NAFLD的主要手段[7]。藍(lán)莓原漿具有強(qiáng)大的抗氧化效果，可清除生物體內(nèi)的超氧陰離子自由基和減少炎癥損傷。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[15]，藍(lán)莓原漿調(diào)控HO-1、Nrf2蛋白的表達(dá)可增強(qiáng)肝細(xì)胞的抗氧化性，抑制細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，治療NAFLD。藍(lán)莓原漿還可以上調(diào)Bcl-2/bax的表達(dá)，阻遏NAFLD啟動程序性死亡[16]。益生菌具有修復(fù)腸道保護(hù)性屏障,降低腸源性內(nèi)毒素水平和提升免疫系統(tǒng)活性等生理功能。NAFLD疾病嚴(yán)重程度同腸道菌群失調(diào)以及代謝變化密切相關(guān)[18]。Esposito等[18]研究表明益生菌通過減少高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝脂質(zhì)過氧化，降低TNF-α和NF-κB表達(dá)和的增強(qiáng)抗炎作用，緩解NAFLD小鼠的癥狀。

本研究結(jié)果顯示，與NC組相比，MC組大鼠精神情況欠佳；血清LDL、ALT、AST、TG、TC高，HDL低；肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，有炎性浸潤、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性及壞死；肝組織有紅色脂滴聚集；肝組織AI高；肝組織Fas、FasL表達(dá)高。說明高脂飲食致使大鼠代謝紊亂，肝臟脂質(zhì)堆積，肝細(xì)胞炎性聚集及壞死，上調(diào)Fas、FasL表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)大量細(xì)胞凋亡，可促發(fā)大鼠NAFLD病情進(jìn)展。與MC組相比，BPL、BPM、BPH組大鼠血清LDL、ALT、AST、TG、TC低，HDL高，肝組織，小葉結(jié)構(gòu)較完整，肝索清晰，肝組織中脂肪變性、壞死和炎性浸潤減少。提示藍(lán)莓原漿聯(lián)合益生菌能糾正NAFLD大鼠體內(nèi)糖脂代謝紊亂，減少肝臟脂肪沉淀，對抗氧化和炎癥損傷,對肝有一定的保護(hù)作用。但BPL和BPM組大鼠血清學(xué)指標(biāo)、肝組織病理學(xué)改變無明顯差異性改變，表明藍(lán)莓原漿聯(lián)合益生菌對NAFL的治療效果無明顯量效關(guān)系。與BPL組和BPM組相比，BPH組大鼠肝組織AI及Fas、FasL表達(dá)下降最為明顯，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明高劑量的藍(lán)莓原漿聯(lián)合益生菌的干預(yù)作用效果顯著。與BPL組相比，BPM組大鼠肝組織AI及Fas、FasL表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明藍(lán)莓原漿聯(lián)合益生菌中低劑量干預(yù)效果相當(dāng)。

綜上所述，藍(lán)莓原漿聯(lián)合益生菌治療高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠NAFL，能改善肝功能，減輕肝組織病理損傷，其機(jī)制可能與藍(lán)莓原漿聯(lián)合益生菌抑制肝細(xì)胞Fas、FasL表達(dá)繼而抑制凋亡有關(guān)。

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81560100)；貴州省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目(20103017)；黔東南苗族侗族自治州林業(yè)局科研基金資助項(xiàng)目(LYJZFCG-2012-7)。

程明亮(E-mail： chengml@21cn.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.009

R575.5

A

1002-266X(2016)47-0032-04

2016-07-24)