Hg2+對(duì)花翅搖蚊Chironomus kiiensis幼蟲口器致畸作用及抗氧化酶活性的影響

陳菲，劉曼紅，蔡艷，馬玉堃

（東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

Hg2+對(duì)花翅搖蚊Chironomus kiiensis幼蟲口器致畸作用及抗氧化酶活性的影響

陳菲，劉曼紅，蔡艷，馬玉堃

（東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

在水溫（17.0±1.0）℃和16h光∶8h暗的光周期下，采用加標(biāo)于沉積物法研究Hg2+對(duì)花翅搖蚊Chironomus kiiensis幼蟲口器的致畸作用和抗氧化酶活性的慢性毒性影響。將4齡搖蚊幼蟲暴露于0.002mg· L-1、0.004 mg·L-1、0.008mg·L-1、0.016mg·L-1、0.032mg·L-1、0.064mg·L-1、0.128mg·L-1和0.256mg·L-18個(gè)Hg2+濃度梯度下，測(cè)定搖蚊幼蟲組織勻漿超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性。結(jié)果表明：Hg2+顯著影響花翅搖蚊幼蟲體組織SOD和CAT活性，且與Hg2+暴露濃度呈顯著濃度-效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）。Hg2+暴露30d后，搖蚊幼蟲的大顎長(zhǎng)度與Hg2+暴露濃度之間也呈極顯著正相關(guān)性（P＜0.01）。該結(jié)果說(shuō)明在低濃度Hg2+的脅迫下，搖蚊幼蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能發(fā)生了顯著改變，可用該幼蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能指標(biāo)作為監(jiān)測(cè)水體Hg2+污染及判定水環(huán)境質(zhì)量的生物學(xué)指標(biāo)。

Hg2+；花翅搖蚊幼蟲；抗氧化酶；致畸作用

大氣和土壤中的Hg2+可通過(guò)干濕沉降以及地表徑流等進(jìn)入水體中而普遍存在[1]，再通過(guò)生態(tài)系統(tǒng)食物鏈逐級(jí)傳遞，影響水的質(zhì)量、水生生物包括魚類的生存，威脅到人類的健康。因此，檢測(cè)水體中Hg2+的存在及其在環(huán)境中的影響尤為重要。

研究表明，可以用水生生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特征等生物學(xué)指標(biāo)的變化來(lái)評(píng)估水生生態(tài)環(huán)境的污染情況[2,3]。底棲動(dòng)物是水生生物的重要組成類群，在水生生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，它們的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理指標(biāo)能反應(yīng)水體環(huán)境健康狀況。張傳永等[4]研究發(fā)現(xiàn)，水生動(dòng)物通過(guò)呼吸、攝食、體表與水體的滲透交換富集水體重金屬。底棲動(dòng)物常受水體污染的影響[5]，形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特征產(chǎn)生相應(yīng)變化，因此，通常用水生生物監(jiān)測(cè)環(huán)境。搖蚊幼蟲是淡水生態(tài)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的底棲動(dòng)物，在激流和靜水的底棲生物群落環(huán)境中占主導(dǎo)地位[6]，是其他水生生物的主要食物來(lái)源[7]。搖蚊幼蟲體內(nèi)的重金屬可以通過(guò)食物鏈傳遞給下一營(yíng)養(yǎng)級(jí)，生物放大作用使水生生態(tài)系統(tǒng)中的高位營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物體內(nèi)重金屬含量增多，使生物體生理受阻、發(fā)育停滯，甚至死亡，最后造成整個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能受損和崩潰[8]。因此，搖蚊幼蟲在水生生態(tài)系統(tǒng)中居基礎(chǔ)地位，研究搖蚊幼蟲對(duì)水體Hg2+脅迫的響應(yīng)，有助于對(duì)水體Hg2+污染做出快速反應(yīng)，以免危害水生生物以及人類健康。

搖蚊幼蟲對(duì)水質(zhì)變化較敏感，污染使口器或觸角發(fā)生形態(tài)變化[9]，可在高污染環(huán)境下生存[10]。因此，搖蚊幼蟲是水生態(tài)毒理實(shí)驗(yàn)重要的研究對(duì)象，也是監(jiān)測(cè)河流和湖泊水質(zhì)的重要指示生物之一[9,11]。其中，花翅搖蚊Chironomus kiiensis幼蟲是研究應(yīng)對(duì)不同曝光時(shí)間層次的重金屬污染的好材料[12]，尤其是對(duì)水體Hg2+濃度的變化。

目前關(guān)于搖蚊幼蟲的慢性毒理實(shí)驗(yàn)鮮見(jiàn)研究。閆賓萍等[13]研究了Ni2+、Hg2+和五氯酚對(duì)羽搖蚊Chironomus plumosus幼蟲的急性毒性。李浩等[14]研究了Cu2+對(duì)羽搖蚊幼蟲口器致畸作用和抗氧化酶活性的急性毒理性。劉曼紅等[15]研究了Hg2+慢性脅迫對(duì)花翅搖蚊幼蟲組織三種酶活性的影響。本研究采用低劑量Hg2+（濃度小于0.729mg·L-1）慢性毒物暴露實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)一步探測(cè)亞致死劑量的Hg2+暴露對(duì)花翅搖蚊幼蟲口器致畸及體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響，為水環(huán)境Hg2+污染的早期診斷及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試花翅搖蚊幼蟲由東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院水生生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)長(zhǎng)期培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用水為人工介質(zhì)M4[8]，水溫為（17.0±1.0）℃。選取個(gè)體活潑、體長(zhǎng)一致的3～4齡幼蟲，在人工介質(zhì)M4中馴養(yǎng)24h后進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，以此確定慢性毒理實(shí)驗(yàn)中Hg2+的安全濃度。在慢性毒理實(shí)驗(yàn)中，供試花翅搖蚊幼蟲卵帶與上述幼蟲選自同一培養(yǎng)箱內(nèi)，選取完整的卵帶3條，投入附水沉積物[8]即模擬水生態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行毒理實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 安全濃度的確定

參照《化學(xué)品沉積物-水系統(tǒng)中搖蚊毒性實(shí)驗(yàn)加標(biāo)于沉積物法》[8]進(jìn)行暴露。用人工介質(zhì)M4配制實(shí)驗(yàn)溶液，在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)置1.0mg·L-1、1.4mg· L-1、1.8mg·L-1、2.2mg·L-1、2.6mg·L-1和3.0mg·L-16個(gè)Hg2+質(zhì)量濃度組。每組設(shè)三個(gè)平行，設(shè)空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)期間給搖蚊幼蟲投喂金魚幼魚飼料，水環(huán)境pH（6.0±0.5），水溫為（17.0±1.0）℃，t(光)∶t(暗)=16h∶8h。觀察各實(shí)驗(yàn)組搖蚊幼蟲存活情況，挑出死亡個(gè)體，統(tǒng)計(jì)死亡率。搖蚊幼蟲死亡標(biāo)準(zhǔn)為：用玻璃棒輕壓尾部3次后無(wú)“8”字扭動(dòng)運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象。用線性回歸法[17]計(jì)算暴露24h時(shí)Hg2+對(duì)花翅搖蚊幼蟲的半數(shù)有效濃度（EC50）。

根據(jù)安全濃度（ρS）計(jì)算公式ρS=ρ（24h,EC50）×0.1[18]和急性毒性實(shí)驗(yàn)的半數(shù)有效濃度（EC50），確定慢性毒性實(shí)驗(yàn)中Hg2+的安全濃度。參照花翅搖蚊幼蟲的ρ（24h,EC50）值，慢性實(shí)驗(yàn)中設(shè)0.002mg·L-1、0.004mg·L-1、0.008mg·L-1、0.016mg·L-1、0.032mg·L-1、0.064mg·L-1、0.128mg·L-1和0.256mg·L-18個(gè)Hg2+濃度梯度，每組設(shè)三個(gè)平行，設(shè)空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)期間不投餌，水環(huán)境中的沉積物為搖蚊幼蟲的食物來(lái)源。水pH（6.0±0.5），水溫（17.0±1.0）℃，t(光)∶t(暗)=16h∶8h，用空氣泵充氣以保證水環(huán)境內(nèi)氧氣充足。

1.2.2 抗氧化酶活性的測(cè)定

花翅搖蚊幼蟲在不同濃度Hg2+中暴露30d后，每組隨機(jī)選取10只活潑、體長(zhǎng)一致的4齡幼蟲，用預(yù)冷的蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干體表水分。采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定花翅搖蚊幼蟲組織均漿液的SOD和CAT活性。

1.2.3 Hg2+對(duì)搖蚊幼蟲口器結(jié)構(gòu)的影響

在搖蚊幼蟲發(fā)育為4齡幼蟲后，選取大小相近的活潑個(gè)體，用沸水燙死，剝離幼蟲頭部進(jìn)行鏡檢，利用Motic Images Plus 2.0拍攝，測(cè)量其大顎長(zhǎng)度。

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組間各指標(biāo)作單因素方差分析（ANOVA），采用t檢驗(yàn)法分析各濃度組與對(duì)照組間的差異顯著性。所有數(shù)據(jù)處理和作圖均采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Hg2+脅迫對(duì)花翅搖蚊幼蟲體組織中SOD活性的影響

由圖1可知，花翅搖蚊卵帶在Hg2+中暴露30d后，隨著Hg2+濃度的升高，SOD活性先快速降低，顯著低于對(duì)照組；但從0.002mg·L-1組開(kāi)始，各濃度組SOD活性開(kāi)始緩慢上升，0.016mg·L-1組顯著高于對(duì)照組，受誘導(dǎo)顯著（P＜0.05）；0.064mg·L-1Hg2+暴露組SOD活性達(dá)峰值，受誘導(dǎo)極顯著（P＜0.01）。隨Hg2+濃度的繼續(xù)升高（0.128mg·L-1），SOD活性開(kāi)始下降，不同處理組之間差異顯著（P＜0.05）。

圖1 Hg2+對(duì)花翅搖蚊幼蟲體組織中SOD活性的影響Fig.1 Effect of Hg2+on SOD activity in tissues of larval chironomus Chironomus kiiensis

2.2 不同濃度Hg2+脅迫對(duì)花翅搖蚊幼蟲體組織中CAT活性的影響

花翅搖蚊卵帶經(jīng)Hg2+暴露30d后，隨著Hg2+濃度的升高，CAT活性快速升高，顯著高于對(duì)照組，受誘導(dǎo)顯著（P＜0.05），在0.004mg·L-1Hg2+組達(dá)到峰值，隨后活性開(kāi)始緩慢下降，CAT活性從0.008mg·L-1Hg2+組開(kāi)始顯著低于對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05）。隨后，CAT活性隨著 Hg2+濃度增加逐漸降低，0.256mg·L-1Hg2+組下降到最低（圖2）。

2.3 Hg2+脅迫對(duì)花翅搖蚊幼蟲口器畸變的影響

經(jīng)不同濃度Hg2+暴露后，花翅搖蚊幼蟲頦部未發(fā)生畸變，但是大顎的齒部長(zhǎng)度隨著Hg2+濃度的升高而變長(zhǎng)（圖3）。在顯微鏡下，測(cè)定各處理組搖蚊幼蟲大顎長(zhǎng)度，利用SPSS16.0將大顎長(zhǎng)度（y）與各處理組Hg2+濃度進(jìn)行線性回歸分析，其回歸方程為：y（μm）=0.985+2.443x（mg·L-1）（R2=0.754）。結(jié)果表明，大顎長(zhǎng)度（y）與Hg2+暴露濃度（x）之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。

圖2 Hg2+對(duì)花翅搖蚊幼蟲體組織中CAT活性的影響Fig.2 Effect of Hg2+on CAT activity in tissues of larval chironomus Chironomus kiiensis

圖3 正常（A）和汞作用下（B）花翅搖蚊幼蟲大顎（200×）Fig.3 The mandibles of normal（A）and exposed to Hg2+（B）larval chironomus Chironomus kiiensis（200×）

3 討論

3.1 Hg2+對(duì)花翅搖蚊幼蟲體組織抗氧化酶活性的影響

Hg2+是外源毒物，會(huì)使DNA、酶、功能蛋白分子等結(jié)構(gòu)破壞和活性失活等[4]，如誘導(dǎo)超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等的活性變化，間接反映了環(huán)境中氧化應(yīng)激的存在，可以作為環(huán)境污染脅迫的指標(biāo)[14]。Michailova等[19]研究表明，生化標(biāo)志物是搖蚊幼蟲敏感的毒性標(biāo)志物，提供環(huán)境中污染物的早期預(yù)警指標(biāo)。其次，重金屬可以產(chǎn)生活性氧，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，刺激抗氧化酶參與細(xì)胞的防御機(jī)制[16]，而Hg是機(jī)體的非必需元素，不參與抗氧化應(yīng)激，會(huì)引起SOD和CAT等酶的活性規(guī)律性變化。SOD和CAT可以有效地清除生物體內(nèi)過(guò)多的超氧陰離子自由基，降低氧自由基對(duì)有機(jī)體的傷害[20]，減少其對(duì)細(xì)胞的過(guò)氧化傷害[21]。由此可見(jiàn)，SOD和CAT共同在生物體內(nèi)建立了一個(gè)功能一致且相互配合的抗氧化網(wǎng)絡(luò)，保護(hù)機(jī)體。

在低濃度Hg2+實(shí)驗(yàn)組中，Hg2+誘導(dǎo)機(jī)體SOD和CAT的表達(dá)和活性上升，機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的活性顯著增加，以降低活性氧自由基的損傷；隨著Hg2+濃度的升高，大量的Hg2+進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，機(jī)體內(nèi)自由基處于一種較高的狀態(tài)，機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活性也一直高于對(duì)照組。隨著濃度的繼續(xù)升高，機(jī)體受到重度逆境脅迫，Hg2+抑制機(jī)體的抗氧化酶活性，抗氧化酶活性逐漸降低。張清順等[21]對(duì)梨形環(huán)棱螺Bellamya purificata的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。

劉曼紅等[15]研究發(fā)現(xiàn)，SOD和CAT活性隨Hg2+濃度增加而逐漸升高，其濃度范圍較寬泛（0mg·L-1、0.003mg·L-1、0.009mg·L-1、0.027mg·L-1、0.081mg·L-1、0.243mg·L-1和0.729mg·L-1），不能表現(xiàn)出低劑量下?lián)u蚊幼蟲抗氧化酶活性的波動(dòng)，在試驗(yàn)過(guò)程中投喂金魚幼魚顆粒飼料，而搖蚊幼蟲以沉積物為食，沉積物內(nèi)有大量的Hg2+，如果投喂飼料，可能會(huì)降低搖蚊幼蟲對(duì)沉積物的攝入，使搖蚊體內(nèi)的Hg2+含量低于直接以沉積物為食的搖蚊體內(nèi)Hg2+的含量，影響到Hg2+暴露對(duì)搖蚊幼蟲的毒性效應(yīng)。其次，其實(shí)驗(yàn)溫度（26.0～28.0℃）比本實(shí)驗(yàn)溫度（17.0±1.0）℃高。在16.0～28.0℃范圍內(nèi)，溫度越高，越適合搖蚊幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育。而本實(shí)驗(yàn)中，濃度范圍較窄（最高濃度為0.256mg·L-1），抗氧化酶活性波動(dòng)更加明顯。

本文研究了Hg2+對(duì)搖蚊幼蟲生物抗氧化酶活性的影響，并未涉及神經(jīng)遞質(zhì)，研究?jī)?nèi)容還不夠全面，在以后的研究中應(yīng)補(bǔ)充這一部分。

3.2 Hg2+脅迫對(duì)花翅搖蚊幼蟲口器結(jié)構(gòu)的影響

在毒物的不斷刺激下生物會(huì)加強(qiáng)對(duì)能量的利用，產(chǎn)生不同的反應(yīng)，使細(xì)胞的形態(tài)和功能發(fā)生改變。不同發(fā)育階段的機(jī)體，對(duì)毒物的反應(yīng)不同[12]。一些有毒物質(zhì)能影響水生生物捕食所需的時(shí)間，影響試圖捕捉食物所需的次數(shù)，或者影響其是否能吞咽食物[12]。生物體畸形可以作為有毒物質(zhì)影響生物行為的一種表現(xiàn)。畸形的簡(jiǎn)單性和快速性也使得畸形程度的評(píng)估已成為沉積物質(zhì)量的生物標(biāo)志物，因此研究重金屬對(duì)搖蚊幼蟲的致畸作用具有重要意義。

水生生物可重將金屬吸附在器官表面，影響器官的正常生理功能，誘發(fā)細(xì)胞畸型[4]。Hg2+對(duì)搖蚊幼蟲的致畸作用主要是口器畸型，影響搖蚊幼蟲的攝食和生長(zhǎng)發(fā)育。許多研究已證實(shí)，重金屬如Hg2+[13]和Cu2+[14]對(duì)搖蚊幼蟲口器的致畸作用。據(jù)閆賓萍和宋志慧[13]報(bào)道，0.01mg·L-1Hg2+急性毒性作用下羽搖蚊幼蟲口器變脆，下唇板上的牙齒不對(duì)稱，中間牙齒磨損，絕大多數(shù)大顎牙齒數(shù)減少。本實(shí)驗(yàn)中，未發(fā)現(xiàn)Hg2+對(duì)花翅搖蚊幼蟲下唇板的致畸作用，說(shuō)明急性和慢性毒性試驗(yàn)中Hg2+對(duì)搖蚊幼蟲的致畸部位不同。目前，重金屬致口器畸型的作用機(jī)理尚未明確，但許多研究證實(shí)，重金屬濃度及暴露時(shí)間與致畸率之間存在線性關(guān)系，因而搖蚊幼蟲的致畸率及致畸部位成為水環(huán)境評(píng)價(jià)的重要參數(shù)之一。本實(shí)驗(yàn)中未觀察到搖蚊幼蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)更加細(xì)微的畸型，還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：搖蚊幼蟲對(duì)水體Hg2+污染能做出顯著的形態(tài)和生理響應(yīng)，可以將搖蚊幼蟲形態(tài)特征和生理特征作為檢測(cè)水體Hg2+污染的重要生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)。這為研究水體Hg2+對(duì)水生生物影響以及完善生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)提供了參考。

致謝：感謝東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院孫雅薇在試驗(yàn)過(guò)程中給予的幫助，感謝林學(xué)院閆國(guó)永在文章修改中給予的幫助。

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Effect of Hg2+Exposure on Teratogenesis Mouthparts and Antioxidant Enzyme Activity in Larval Chironomus Chironomus kiiensis

CHEN Fei,LIU Man-hong,CAI Yan,MA Yu-kun
（College of Wildlife Resources,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China）

Chronic toxicity of mercury to larvae of chironomus Chironomus kiiensis was studied by using standard-sediment method in a laboratory.The activities of superoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT）related to antioxidant enzymes and teratogenic mouthparts were monitored in the homogenate of tissues in the 4 instar larvae of the chironomus exposed to Hg2+concentrations of 0.002 mg· L-1,0.004 mg·L-1,0.008 mg·L-1,0.016 mg·L-1,0.032 mg·L-1,0.064 mg·L-1,0.128 mg·L-1and 0.256 mg·L-1.The results showed that Hg2+led to obvious effects on the activities of SOD and CAT,with significant concentration-response relationship（P＜0.05）．The chironomus larvae exposed to Hg2+for 30 d showed a significant positive correlation between the mandibular length in mouthparts and the exposure concentration of Hg2+（P＜0.01）.The findings indicate that the morphological structure and physiological function of chironomus larvae can be used as an important biological indicator for monitoring of water pollution of Hg2+since the low concentration of Hg2+stress has led to significantly change in morphology and physiology of chironomus larvae.

Hg2+;Chironomus kiiensis;antioxidant enzyme;terotagenesis

X835

A

1005-3832（2016）05-0055-05

2016-06-07

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（2572014EA07-03）.

陳菲（1992-），女，碩士研究生，水生生物學(xué)專業(yè).

馬玉堃（1962-），男，博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事水環(huán)境生物學(xué)研究.E-mail:mayukun66@126.com