糖尿病性神經(jīng)痛大鼠脊髓背角突觸數(shù)量的體視學研究

林菁艷，陳靜，黃三，林靜，馬丁，彭彬

(1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，川北醫(yī)學院麻醉學系；2.南充市中心醫(yī)院；3.川北醫(yī)學院細胞化學研究室，四川 南充 637000)

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糖尿病性神經(jīng)痛大鼠脊髓背角突觸數(shù)量的體視學研究

林菁艷1，陳靜2，黃三1，林靜1，馬丁1，彭彬3

(1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，川北醫(yī)學院麻醉學系；2.南充市中心醫(yī)院；3.川北醫(yī)學院細胞化學研究室，四川 南充 637000)

目的：探討糖尿病性神經(jīng)痛(painful diabetic neuropathy,PDN)大鼠脊髓背角突觸數(shù)量的變化。方法：10只健康成年雄性SD大鼠，隨機分為兩組(n=5)：PDN組和對照組(C組)。PDN組采用腹腔注射6%STZ 60 mg/kg建立糖尿病大鼠模型，C組腹腔注射等容生理鹽水。注射后72 h測定空腹血糖(FBG)，以FBG>11.1 mmol/L為糖尿病建模成功。注射STZ前1 d及血糖升高后第4、7、14、28 天分別測定大鼠的機械痛閾。第28天測痛后取L5段脊髓，進行突觸素免疫組織化學染色，采用光學體視框交替計數(shù)一側(cè)脊髓背角內(nèi)突觸的數(shù)量。結(jié)果：PDN組大鼠FBG均達糖尿病診斷標準，自FBG升高后 4 d開始痛閾降低，至28 d時未恢復。與C組比較，PDN組L5節(jié)段脊髓背角內(nèi)突觸數(shù)量增加(P<0.05)。結(jié)論：PDN大鼠脊髓背角突觸數(shù)量增加，突觸數(shù)量增加可誘導PDN的發(fā)生。

糖尿病性神經(jīng)痛；中樞敏化；突觸可塑性；骨髓背角

糖尿病性神經(jīng)痛(painful diabetic neuropathy,PDN)是神經(jīng)病理性疼痛的一種類型，是糖尿病常見的并發(fā)癥之一。其主要表現(xiàn)為感覺麻木，自發(fā)性疼痛，痛覺過敏和異常疼痛[1]等。文獻報道，其發(fā)病率為20%～47%[2-3]，長期慢性疼痛嚴重影響患者的生活。由于目前對其發(fā)病機制了解不多，故而臨床治療滿意度并不高。過去曾認為其發(fā)生機制主要為周圍神經(jīng)病變，外周神經(jīng)敏化。目前，越來越多的研究顯示，PDN的發(fā)生不僅存在周圍神經(jīng)系統(tǒng)病變，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性改變(中樞敏化)也是其可能機制[4-5]：PDN大鼠脊髓背角內(nèi)谷氨酸能神經(jīng)元興奮性突觸后電位增強[6]，N-甲基-D天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體和γ-氨基丁酸B(GABAB)受體失衡[6]，脊髓背角內(nèi)傷害感受性神經(jīng)元回路改變[7]及感覺神經(jīng)傳入纖維增多[8]。據(jù)此我們推測：上述脊髓背角內(nèi)的可塑性變化，可能造成PDN大鼠脊髓背角內(nèi)感覺神經(jīng)元之間建立新的突觸聯(lián)系，導致突觸數(shù)量增加，從而導致脊髓背角內(nèi)感覺神經(jīng)元興奮性增強，感受野擴大，其相應的外周感受野對同樣刺激的感受增強，閾值降低，進而引起自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和異常疼痛，導致PDN的發(fā)生發(fā)展和維持。目前尚未見PDN大鼠脊髓背角內(nèi)突觸數(shù)量的相關報道。因此，本研究擬采用體視學方法——光學體視框來觀測PDN大鼠脊髓背角內(nèi)突觸和神經(jīng)元數(shù)量的變化，為PDN發(fā)生的中樞敏化機制增添新的解剖學資料。

1 方法

1.1 動物選擇及分組

健康成年SD雄性大鼠10只，體重220～250 g，由川北醫(yī)學院實驗動物中心[許可證號：SCXK(川)2008-18]提供。隨機分為兩組(n=5)：PDN組和生理鹽水對照組 (C組)。所有動物單籠喂養(yǎng)，自由進食飲水，晝夜交替。適應3 d后進行實驗。對動物的所有處理均符合本院倫理委員會關于實驗動物倫理學要求。

1.2 糖尿病大鼠模型的制備

所有動物適應性喂養(yǎng)3 d后禁食12 h，分別經(jīng)腹腔注射6% STZ (sigma公司，美國)60 mg/kg和等容積的生理鹽水。72 h后取尾靜脈血，以強生倍優(yōu)型血糖儀及配套試紙測定大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，以FBG>11.1 mmol/L為糖尿病造模成功標志[9-11]。

1.3 機械痛閾測定

分別于注射STZ前1 d、FBG升高后第1、7、14、28 天時采用動態(tài)平板Von Frey測痛儀(Ugo Basil，37450，意大利)采用改良“up and down”法測定大鼠雙側(cè)后足的50%縮腿閾值[12-14](PWT)：將大鼠放在一鐵絲網(wǎng)架上，用透明塑料觀察框罩住。待大鼠適應環(huán)境15 min，并處于清醒、安靜狀態(tài)(無走動，無洗臉、瘙癢等動作)，以測痛儀依次交替刺激大鼠一側(cè)后肢第4、5趾底，從低到高選擇刺激力度，刺激力度從10 g開始，若無反應，則以2 g的間距逐漸增加刺激力度。為避免對大鼠造成損傷，最大刺激力度為30 g，每個力度刺激6～8 s，重復4次，相鄰刺激位置間隔一定距離，以避免出現(xiàn)耐受現(xiàn)象。4次刺激一旦有1次出現(xiàn)陽性反應，則繼續(xù)該刺激2次，6次刺激中有3次陽性反應的刺激力度則為該側(cè)后足的50%縮腿閾值。

1.4 切片制備

FBG升高后第28天時，測試痛閾后經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，開胸，經(jīng)左心室插管至升主動脈，剪開右心耳，以生理鹽水灌注沖洗血液。待右心耳流出液體變清亮后，以4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌流內(nèi)固定。待大鼠頸部及肝臟僵硬時，灌注結(jié)束。分離脊髓，取L5節(jié)段石蠟包埋。沿垂直于脊髓長軸的方向，從中連續(xù)切取30張14 μm厚的切片，按照等距隨機原則，每隔6張抽取一張切片，抽取的第一張切片在前6張切片中隨機選取，共抽取5張切片。按這種方法抽選出2套切片，分別進行甲苯胺藍尼氏染色(顯示神經(jīng)元為主)和突觸素的免疫組織化學染色(顯示突觸前終末為主，其數(shù)量即突觸數(shù)量)[14-15]。

1.5 突觸素免疫組織化學染色

切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液抗原修復、3%H2O2去離子水消除內(nèi)源性過氧化物酶活性和山羊血清封閉非特異性抗原后，滴加小鼠抗大鼠突囊泡蛋白單克隆抗體(稀釋度1∶500，Millipore公司，美國) 4 ℃孵育24 h。依次加入生物素二抗、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(北京中杉金橋生物技術有限公司)，每一操作步驟期間用0.01 mol/L的PBS液沖洗3 min×3次。DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分色，常規(guī)脫水，透明，封片。另取相鄰切片，采用正常山羊血清代替一抗作為陰性對照。

1.6 尼氏染色

切片常規(guī)脫蠟至水后，置入57 ℃的0.01%甲苯胺藍溶液中染色5 min，自來水終止，經(jīng)95%乙醇分色后，常規(guī)脫水，透明，封片。

1.7 體視學估計

對各組內(nèi)切片脊髓背角的左右側(cè)交替進行觀測，以消除動物自身因素可能造成的誤差。采用現(xiàn)代體視學設備NewCAST系統(tǒng)(Visiopharm公司，丹麥)及BX51型光學顯微鏡(Olympus公司，日本)，在電腦上進行觀測。先在低倍物鏡下勾勒出所選定側(cè)脊髓背角區(qū)域[12-13]并測定其面積(A)。UPlanSApo油鏡(×100, 數(shù)值孔徑1.40)下進行計數(shù)。組織圖像的最終放大倍數(shù)為2 240。

1.7.1 突觸的計數(shù) 參照文獻[14-16]介紹的方法進行計數(shù)：首先在勾選區(qū)域的最左上角隨機確定第一個測試視野，然后按照0.2 μm的間距利用電動載物臺在勾選區(qū)域內(nèi)由系統(tǒng)自動等距抽選視野。油鏡下，每個視野疊加2個面積為57.02 μm2的長方形測試框。

從切片上表面向下0.5 μm的光學切片平面開始，手動調(diào)節(jié)向下連續(xù)聚焦觀察3 μm厚的切片組織，根據(jù)光學體視框計數(shù)法則[9-11,14]計數(shù)體視框(每個體視框的體積為57.02 μm2×3 μm=171.06 μm3)內(nèi)的突觸素顆粒的數(shù)量。

所計數(shù)的突觸素顆粒的總數(shù)除以用于計數(shù)的體視框總體積即得單位體積脊髓背角內(nèi)的突觸的數(shù)量(Nv，即數(shù)密度)。將所得突觸數(shù)量乘以1 mm長脊髓節(jié)段內(nèi)脊髓背角的體積(A×1 mm)，即得每1 mm長脊髓內(nèi)所測突觸的數(shù)量(不考慮切片壓縮)。

1.7.2 神經(jīng)元計數(shù) 系統(tǒng)自動的等距隨機抽選一定的脊髓背角區(qū)域，在每個視野上隨機疊加一個面積為2 074.22 μm2的長方形光學體視框。脊髓背角區(qū)域內(nèi)的測試總面積設定為脊髓背角橫切面積的5%。從切片上表面向下0.5 μm的光學切片平面開始，向下連續(xù)聚焦觀察7 μm厚的切片組織，根據(jù)光學體視框計數(shù)法則計數(shù)體視框(體視框的體積為2 074.22 μm2×7 μm=14 519.54 μm3)內(nèi)的神經(jīng)元核仁數(shù)。所計數(shù)的核仁總數(shù)除以用于計數(shù)的體視框總體積即得單位體積脊髓背角內(nèi)的核仁數(shù)量。脊髓背角內(nèi)每個神經(jīng)元的細胞核內(nèi)通常都有且只有1個核仁，很少有2～3個核仁，因此我們估計的核仁數(shù)等于神經(jīng)元數(shù)。將所得神經(jīng)元數(shù)量乘以1 mm長脊髓節(jié)段內(nèi)脊髓背角的體積，即得每1 mm長脊髓內(nèi)所測神經(jīng)元的數(shù)量(不考慮切片壓縮)。

1.7.3 突觸/神經(jīng)元比值 以單位長度脊髓背角內(nèi)的突觸數(shù)量除以神經(jīng)元數(shù)量，即得突觸/神經(jīng)元比值。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠血糖及機械痛閾

PDN組大鼠在注射STZ72h后FBG均>11.1mmol/L，且不隨時間推移而下降，同時還伴隨皮毛光澤度下降、色黃，精神萎靡等癥狀。

與造模前及C組相比，PDN組大鼠在FBG升高后4d開始出現(xiàn)痛閾降低，至術后28d時未恢復(P<0.05，表1)。

表1 空腹血糖升高前后各時間點大鼠50%縮爪閾值的變化(n=5)

組別升高前1d升高后4d升高后7d升高后14d升高后28dPDN組18.8±0.613.8±0.4*#10.6±0.7*#11.8±1.4*#11.0±0.6*#C組19.2±0.817.6±1.717.6±0.718.0±0.517.8±0.5

*P<0.05,與血糖升高前相比;#P<0.05,與C組相比。

2.2 L5節(jié)段脊髓背角內(nèi)體視學測量

與C組相比，PDN組大鼠在FBG升高后28 d時單位長度脊髓背角內(nèi)突觸數(shù)量及突觸/神經(jīng)元比值明顯升高(P<0.05)，而神經(jīng)元數(shù)量及兩組大鼠脊髓背角面積無顯著性差異(P>0.05)(表2，圖1)。

表2 血糖升高后第28 d時各組大鼠的L5段脊髓背角內(nèi)體視學結(jié)果(n=5)

PDN組C組脊髓背角面積(mm2)0.56±0.060.51±0.08突觸數(shù)量(106/mm長脊髓)16.05±2.72*11.82±2.69神經(jīng)元數(shù)量(103/mm長脊髓)71.98±12.4968.07±9.54突觸/神經(jīng)元比值224.08±22.30*172.20±18.20

*P<0.05，與C組相比。

3 討論

STZ通過直接破壞大鼠胰島β細胞而誘發(fā)糖尿病，廣泛用于糖尿病動物模型的制備[20-21]。本研究根據(jù)文獻及預實驗結(jié)果選取STZ 60 mg/kg用于建立糖尿病大鼠模型。PDN組大鼠在注射STZ后72h的FBG均達到糖尿病診斷標準。在FBG升高后第4d出現(xiàn)機械痛閾明顯降低，至28 d時未恢復。說明PDN建模成功并持續(xù)發(fā)展。

體視學(stereology)是始于20世紀60年代的一門學科，是利用所測結(jié)構(gòu)的圖像的幾何特征來定量研究所測結(jié)構(gòu)本身的幾何特征(包括體積、表面積、長度、數(shù)目等)的方法學[19]。體視學方法中的系統(tǒng)抽樣和體視框的運用，提供了較高水平的解剖分辨力，在粒子定量研究方面較傳統(tǒng)的基于對灰度值、光密度的比較等方法有著更為客觀和準確的優(yōu)勢[22]。

采用體視學的新工具——光學體視框，我們前期實驗[14-15]已經(jīng)證明，坐骨神經(jīng)損傷后的神經(jīng)病理性痛大鼠其脊髓背角的可塑性改變主要發(fā)生在L5節(jié)段，因此本研究中主要觀測了L5節(jié)段突觸和神經(jīng)元數(shù)量的變化。

研究表明：PDN的發(fā)生機制不僅僅是周圍神經(jīng)病變，中樞敏化也在其發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。脊髓背角是疼痛信息傳遞和整合的初級中樞。PDN的外周神經(jīng)病變導致傷害性傳入沖動增加，可導致初級感覺神經(jīng)元過度興奮，進而引發(fā)脊髓背角傷害感受性神經(jīng)元興奮性增高，突觸聯(lián)系發(fā)生功能性或質(zhì)的變化，進而發(fā)生中樞敏化，導致痛覺過敏或自發(fā)痛。PDN大鼠脊髓背角內(nèi)神經(jīng)回路發(fā)生重組，感覺神經(jīng)纖維傳入增多[8]，因此可能建立新的突觸聯(lián)系，導致PDN大鼠脊髓背角內(nèi)突觸數(shù)量增多。本研究采用現(xiàn)代體視學方法，證明了PDN大鼠L5節(jié)段單位體積脊髓背角內(nèi)突觸數(shù)量明顯增多而神經(jīng)元數(shù)量無顯著性改變。同時，考慮到脊髓在組織學處理過程中可能產(chǎn)生的變化，我們還計算了突觸/神經(jīng)元比值。這一比值不受參照空間(脊髓背角)體積改變的影響，其結(jié)果與突觸數(shù)量的變化具有一致性，說明單個神經(jīng)元所擁有的突觸數(shù)量增加。

突觸數(shù)量的增加可能導致神經(jīng)元的一系列功能變化：谷氨酸能神經(jīng)元興奮性突觸后電位增強[6]，突觸內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的合成與釋放增加，感覺神經(jīng)元沖動的發(fā)放和傳導頻率增加、速度增快，從而導致糖尿病性神經(jīng)痛患者自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和異常疼痛的發(fā)生。而增加的突觸中興奮性或抑制性突觸的比例，以及其他脊髓階段內(nèi)甚至更高一級中樞——大腦中相關區(qū)域是否有相應的突觸可塑性改變尚有待進一步研究。

綜上所述，PDN大鼠脊髓背角內(nèi)突觸數(shù)量增多，可能導致感覺神經(jīng)元興奮性增加，其相應的外周感受野對同樣刺激的感受增強，閾值降低，感受野擴大，進而引起自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和異常疼痛，導致PDN的發(fā)生發(fā)展和維持。本研究為闡明PDN發(fā)生的中樞機制增添了新的解剖學證據(jù)，提示脊髓背角突觸數(shù)量的增加可能是導致糖尿病性神經(jīng)痛患者中樞敏化和自發(fā)痛、痛覺過敏及異常疼痛的解剖學基礎。也為糖尿病性神經(jīng)痛的治療提供了新的思路：抑制脊髓背角內(nèi)感覺傳入纖維的增加和突觸數(shù)量的增多。

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(學術編輯：文曉紅)

Stereological study on the synaptic number in the rat spinal dorsal horn with painful diabetic neuropathy

LIN Jing-Yan1,CHEN Jing2,HUANG San1,LIN Jing1,MA Ding1,PENG Bin3

(1．DepartmentofAnesthesiology,NorthSichuanMedicalCollege,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege；2.NanchongCentralHospital；3.CytochemicalResearchLaboratory,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To investigate the plasticity change of the synaptic number in the rat spinal dorsal horn with painful diabetic neuropathy.Methods：10 healthy adult male SD rats were randomly divided into 2 groups (n=5): the PDN group and the control group.Rats in the two groups were intraperitoneally injected with 6%STZ 60mg/kg or normal saline respectively.72 hours after injection,fasting blood glucose (FBG) were measured,FBG>11.1 mmol/L were considered a successful diabetes mellitus model.1day before injection and4,7,14,28 days after increasing of FBG,the mechanical pain threshold were measured.28 days after increasing of FBG,the L5 segment of spinal cord were separated and stained with synaptophysin immunohistochemisty.The numerical density of synapses in the spinal dorsal horn was estimated respectively.Results：In the PDN group,FBG rose after injection of STZ,and the pain threshold decreased 4 days after increasing of FBG.Compared to control group,numerical density of synapses increased significantly in the spinal dorsal horn in the PDN group (P<0.05).Conclusion：The rat model of PDN is associated with increase of the synaptic numbers in the spinal dorsal horn of L5 segment.

Painful diabetic neuropathy;Central sensitization;Synaptic plasticity;Spinal dorsal horn

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.06.008

四川省科技廳項目(2013JY0161)；四川省教育廳重點項目(16ZA0238，15ZA0214)

2016-08-28

林菁艷(1979-)，女，博士，副教授。

彭彬，E-mail: 340255492@qq.com

時間：2017-1-3 22∶01

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170103.2201.016.html

1005-3697(2016)06-0809-04

R741

A