熒光光譜法研究柯里拉京與人血清白蛋白之間的相互作用

申炳俊，苗苗，劉慧，李萍，周錦秀，曹宇寧，金麗虹，田堅(jiān)

（1.長春理工大學(xué)清潔能源技術(shù)研究所，長春 130022；2.長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022）

熒光光譜法研究柯里拉京與人血清白蛋白之間的相互作用

申炳俊1，苗苗2，劉慧2，李萍2，周錦秀2，曹宇寧2，金麗虹2，田堅(jiān)1

（1.長春理工大學(xué)清潔能源技術(shù)研究所，長春 130022；2.長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022）

在模擬人體血液pH條件（pH 7.4，離子強(qiáng)度0.1mol/L），通過熒光猝滅、位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)、同步熒光和三維熒光光譜等方法研究了柯里拉京（Cor）與人血清白蛋白（HSA）之間相互作用機(jī)制。結(jié)果表明：HSA的熒光能被Cor靜態(tài)猝滅，兩者間結(jié)合常數(shù)為2.79×103（298K）、2.22×104（304K）和8.41×104L/mol（310K）。根據(jù)Van’t Hoff方程結(jié)果顯示，Cor與HSA間的作用主要為疏水作用，其作用過程為自發(fā)、吸熱?；贔?rster能量轉(zhuǎn)移，得知Cor與HSA間結(jié)合距離為9.33 nm。位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)指出，Cor優(yōu)先結(jié)合HSA的位點(diǎn)III。三維熒光光譜和同步熒光光譜顯示，與Cor作用對(duì)HSA構(gòu)象影響不顯著。

柯里拉京；人血清白蛋白；熒光光譜；標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)

人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）是一種單體多結(jié)構(gòu)域生物大分子，在人體血漿中含量豐富。HSA的表面包含多個(gè)親脂性的結(jié)合位點(diǎn)，具有存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性代謝物及外源性疏水物質(zhì)作用，是生物活性物質(zhì)發(fā)揮生物效應(yīng)的重要載體和靶向分子。藥物進(jìn)入體內(nèi)一般無法直接作用于病灶部分，通常先與HSA可逆結(jié)合成復(fù)合物，然后再被運(yùn)輸?shù)綑C(jī)體的各個(gè)部位進(jìn)行釋放［1］。由于藥物與HSA的親和性大小直接影響血液中藥物濃度的高低、有效作用時(shí)間，進(jìn)而影響它們?cè)隗w內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄和毒性等過程。因此，研究HSA與中藥活性成分的相互作用，對(duì)于探討藥物小分子在人體內(nèi)的運(yùn)輸與代謝過程，對(duì)藥物分子化學(xué)結(jié)構(gòu)改造等方面有重要的理論和實(shí)際意義。為此，國內(nèi)外研究人員對(duì)中藥活性成分與HSA相互作用進(jìn)行了大量研究，所涉及中藥活性成分種類繁多，如黃酮類［2］、生物堿類［3］、多酚類［4］、酚酸類［5］及醌類［6］等。

柯里拉京（corilagin，Cor）化學(xué)名稱為1-酰-3，6-六羥基聯(lián)苯二甲?；咸烟?，是一種天然的多酚單寧酸類化合物。Cor主要存在于葉下珠、老鸛草等植物中。藥理學(xué)試驗(yàn)證明，Cor不僅具有抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗纖溶、降低血壓、抑制病毒、抗菌及抗炎等藥理活性，還對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用［7-9］，具有潛在的藥用價(jià)值。

目前，已有多種方法用于研究小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用，包括動(dòng)態(tài)法和靜態(tài)法，前者主要有平衡透析法［10］、親和毛細(xì)管電泳［11］和親和色譜法［12］，后者主要有光譜法［5，11］、核磁共振［13］等手段。其中，光譜法尤其是熒光光譜法在小分子與蛋白質(zhì)之間相互作用研究中應(yīng)用廣泛，該方法可以獲得結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等分子間分子作用信息，具有操作簡(jiǎn)單、分析速度快、靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。本文模擬了生理?xiàng)l件（pH 7.4，離子強(qiáng)度0.1mol/L），利用熒光猝滅法結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)對(duì)Cor與HSA間相互作用的機(jī)制進(jìn)行了研究，同時(shí)利用同步熒光和三維熒光技術(shù)探討了其構(gòu)效關(guān)系。所獲得結(jié)果為闡明藥物分子在體內(nèi)的運(yùn)輸及藥理作用提供可靠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和儀器

人血清白蛋白（HSA）購自美國Sigma公司，柯里拉京（Cor）購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，華法林（warfarin）購自南通飛宇生物科技有限，布洛芬（ibuprofen）、洋地黃毒苷（digitoxin）均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。Tris-HCl緩沖液（0.05mol/L，pH=7.4，含0.1mol/L NaCl）。準(zhǔn)確稱取適量Cor、華法林、布洛芬和洋地黃毒苷對(duì)照品溶于無水乙醇中，配制成1.00×10-4mol/L的儲(chǔ)備液。用Tris-HCl緩沖液將HSA配成濃度為1.00×10-4mol/L的儲(chǔ)備液。上述儲(chǔ)備液均置于4℃下避光保存。實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水，其他試劑均為分析純。

熒光光譜利用天津港東公司的F-280型熒光分光光度計(jì)測(cè)得，吸收光譜利用日本島津公司的UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)得。熒光值用“內(nèi)濾光效應(yīng)”公式［14］進(jìn)行校正：

式中，F(xiàn)cor和Fobs分別為Cor-HSA體系校正后和測(cè)到的熒光強(qiáng)度；Aex和Aem為Cor在激發(fā)和發(fā)射波長處吸光度值。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 熒光發(fā)射光譜測(cè)定

在一系列7mL比色管中，依次加入40μL HSA儲(chǔ)備液和適量Cor儲(chǔ)備液，用Tris-HCl緩沖液定容至4mL，獲得HSA∶Cor（濃度比）分別為1∶0，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6和1∶7的混合體系；于298、304或310K靜置30min。在激發(fā)波長為280nm，激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度分別為10nm和5nm條件下，掃描290～410nm范圍內(nèi)熒光發(fā)射光譜。

1.2.2 同步熒光光譜測(cè)定

溶液配制同上，在相同條件下分別掃描285～335nm（Δλ=15nm）及310～380nm（Δλ=60nm）范圍內(nèi)同步熒光光譜。

1.2.3 三維熒光光譜測(cè)定

配制HSA∶Cor（濃度比）為1∶0和1∶4的混合體系，在298K條件下靜置30min，方法同上。設(shè)定激發(fā)波長范圍為200～330nm，發(fā)射波長范圍為250～500nm，激發(fā)和發(fā)射間隔均為5nm，掃描三維熒光光譜。

1.2.4 位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)

固定HSA和位點(diǎn)探針（保泰松/布洛芬/洋地黃毒苷）的濃度均為1.0×10-6mol/L，充分混合后，在298K條件靜置30min；向位點(diǎn)探針-HSA體系中加入適量Cor儲(chǔ)備液，混合均勻，繼續(xù)在298K條件下作用30min，掃描熒光發(fā)射光譜，參數(shù)同前。

1.2.5 紫外吸收光譜

準(zhǔn)確量取適量Cor儲(chǔ)備液加入比色管中，用0.05mol/L Tris-HCl緩沖液定容，獲得1.0×10-6mol/L Cor溶液，掃描290～410nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cor對(duì)HSA的熒光猝滅作用及機(jī)理

通過相互作用（如形成復(fù)合物，碰撞猝滅，能量轉(zhuǎn)移，激發(fā)態(tài)反應(yīng)和分子重排等）使熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度下降的現(xiàn)象，都稱為熒光猝滅作用。文中激發(fā)波長為280nm時(shí)，HSA在343nm處具有內(nèi)源熒光（曲線1），而在此條件下Cor自身無熒光發(fā)射（曲線9）。圖1為不同濃度Cor對(duì)HSA的熒光猝滅光譜。可以看出，HSA的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度可以被Cor猝滅，且猝滅效應(yīng)隨Cor濃度的增大而增強(qiáng)（曲線1～8），其熒光峰形變化不大，但最大發(fā)射波長發(fā)生了微弱的紅移（1.5nm）。說明Cor與HSA間發(fā)生了一定程度的相互作用，兩者間可能形成復(fù)合物。

圖1 Cor-HSA體系的熒光發(fā)射光譜

在嚴(yán)格控制pH值和溫度的條件下，能引起HSA熒光猝滅的機(jī)制主要包括動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和非輻射共振能量轉(zhuǎn)移。其中，靜態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光分子在基態(tài)時(shí)形成了不發(fā)熒光的復(fù)合物而引起的猝滅，而動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑與激發(fā)態(tài)的熒光分子之間發(fā)生相互碰撞導(dǎo)致的熒光猝滅。無論靜態(tài)猝滅還是動(dòng)態(tài)猝滅都遵循Stern-Volmer方程［5］：

式中，F(xiàn)0和F分別為無、有Cor時(shí)HSA的熒光強(qiáng)度；Kq為速率常數(shù)；τ0為生物大分子的平均熒光壽命（約為10-8s）；Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)，［Q］為Cor的平衡濃度。Cor-HSA體系的Stern-Volmer曲線見圖2，可以看出，隨著Cor濃度的增加，F(xiàn)0/F逐漸增大，且二者間呈良好的線性關(guān)系。由擬合線性方程的斜率可以得到Cor對(duì)HSA的猝滅常數(shù)Ksv和Kq值，結(jié)果列于表1。通常，靜態(tài)猝滅速率常數(shù)隨著溫度升高而減小，動(dòng)態(tài)猝滅則與之相反［1，5］。由表1可知，Ksv隨著溫度的升高而減小，且Kq值均大于最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L/（mol·s）［15］，因此推斷Cor對(duì)HSA的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

圖2 不同溫度下Cor-HSA的Stern-Volmer圖

2.2 Cor與HSA的能量轉(zhuǎn)移及結(jié)合距離

F?rster能量轉(zhuǎn)移理論可以解釋藥物分子與HSA之間的非輻射能量轉(zhuǎn)移，同時(shí)可被用來確定氨基酸殘基和藥物分子的結(jié)合距離［16］。

供能體-受能體間能量轉(zhuǎn)移的效率E、供能體-受能體之間的距離r和能量轉(zhuǎn)移距離R0存在如下關(guān)系：

式中，R0是能量轉(zhuǎn)移的效率為50%時(shí)的臨界距離，K2是偶極的空間取向因子；N是介質(zhì)的折射率；φ是HSA在無Cor存在時(shí)的熒光量子產(chǎn)率；J是HSA的熒光發(fā)射光譜和Cor紫外吸收光譜的重疊程度；F(λ)是HSA在波長λ處的熒光強(qiáng)度，ε(λ)是Cor在波長λ處的摩爾吸光系數(shù)。

圖3 HSA的熒光發(fā)射光譜和Cor紫外吸收光譜的重疊圖

圖3為HSA的熒光發(fā)射譜和Cor的紫外吸收光譜的重疊圖。用矩形分割法求得圖3中光譜重疊部分的面積，即重疊積分J=5.37×10-1（2cm3·L）/mol。文中實(shí)驗(yàn)條件下，供體和受體各項(xiàng)隨機(jī)分布的取向因子平均值K2=2/3，折射指數(shù)N取水和有機(jī)物平均值1.336，對(duì)于HSA的體系量子產(chǎn)率φ取0.118。根據(jù)公式（4）獲得R0=6.99nm。由公式（3）依次求得E=0.15，r=9.33nm。由于r＞R0，且r＞7.0nm，說明HSA與Cor間沒有發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移。這進(jìn)一步表明Cor通過靜態(tài)猝滅方式導(dǎo)致HSA的熒光猝滅。

2.3 Cor與HSA的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

若熒光分子與猝滅劑間存在靜態(tài)猝滅，那么可用Scatchard方法計(jì)算兩者間結(jié)合常數(shù)（KA）及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）［17］：

以logF0-F/F對(duì)log［Q］作圖4，擬合獲得方程、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，結(jié)果見表1。由曲線良好的線性關(guān)系可以推測(cè)，HSA與Cor有一個(gè)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，這與計(jì)算所得到的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n≈1是一致的。Cor與HSA的結(jié)合常數(shù)KA的數(shù)量級(jí)在103和104，說明Cor與HSA間的結(jié)合能力較強(qiáng)。由此推斷Cor能夠較好地被HSA存儲(chǔ)和運(yùn)輸。

表1 不同溫度下Cor與HSA的猝滅常數(shù)Ksv、結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

圖4 不同溫度下Cor-HSA的雙對(duì)數(shù)方程曲線圖

2.4 Cor與HSA的熱力學(xué)參數(shù)和結(jié)合力的確定

小分子與生物大分子（如蛋白質(zhì)、核酸）之間結(jié)合的相互作用力主要包括靜電引力、氫鍵、范德華力和疏水作用力，兩者結(jié)合的作用力類型可以通過反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)焓變（ΔH）、熵變（ΔS）和自由能變化（ΔG）來判斷。熱力學(xué)參數(shù)可以根據(jù)Van’t Hoff定律計(jì)算［18］：

式中，KA是相應(yīng)溫度下的有效結(jié)合常數(shù)，R為氣體常數(shù)（8.314（mol K）/J），T為絕對(duì)溫度。當(dāng)實(shí)驗(yàn)中溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的ΔH可近似為常數(shù)。以不同溫度下的lnKA對(duì)1/T作圖5，由線性方程的線斜率和截距可以求得Cor與HSA結(jié)合的ΔH和ΔS，進(jìn)而可以得到不同溫度下的ΔG，計(jì)算結(jié)果見表2。ΔG＜0，說明Cor和HSA之間的反應(yīng)過程是一個(gè)自由能降低的自發(fā)、吸熱過程。而ΔH和ΔS均為正值，根據(jù)Ross和Subramanian［19］理論推斷疏水作用力是Cor與HSA結(jié)合過程的主要驅(qū)動(dòng)力。

表2 不同溫度下Cor-HSA體系的熱力學(xué)參數(shù)

圖5 不同溫度Cor-HSA的Van't Hoff曲線圖

2.5 Cor在HSA上結(jié)合部位的確定

晶體結(jié)構(gòu)分析表明大多數(shù)小分子物質(zhì)在HSA中主要結(jié)合部位是兩個(gè)疏水性口袋Site I和Site II。研究發(fā)現(xiàn)，華法林結(jié)合于Site I，布洛芬結(jié)合于Site II，而洋地黃毒苷結(jié)合在血清白蛋白的第三個(gè)結(jié)合部位，即Site III［5］。以華法林、布洛芬和洋地黃毒苷分別作為HSA的Site I、Site II和Site III位點(diǎn)探針，通過位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)得到Cor在HSA上結(jié)合部位的信息。表3中列出了位點(diǎn)探針存在時(shí)Cor-HSA體系的表觀結(jié)合常數(shù)K′A及結(jié)合常數(shù)的變化率φ (φ=(K′A-KA)/KA）。可以看出，與不存在標(biāo)記探針的Cor-HSA體系相比，洋地黃毒苷的存在對(duì)于表觀結(jié)合常數(shù)的影響最大。表明Cor在HSA的三個(gè)位點(diǎn)均有結(jié)合，且優(yōu)先結(jié)合在HSA的洋地黃毒苷（Site III）處。

表3 位點(diǎn)標(biāo)記試劑存在時(shí)Cor與HSA的結(jié)合常數(shù)K′A和結(jié)合常數(shù)的變化率φ（T=298K）

2.6 Cor對(duì)HSA構(gòu)象的影響

2.6.1 同步熒光光譜

同步熒光光譜可用于研究蛋白氨基酸殘基周圍極性及蛋白質(zhì)構(gòu)象改變的信息。當(dāng)Δλ=15nm時(shí)，可以得到酪氨酸殘基周圍微環(huán)境改變的信息；當(dāng)Δλ=60nm時(shí)，所得到的同步熒光顯示的是色氨酸殘基周圍微環(huán)境改變的信息［1，5］。固定HSA的濃度，逐漸增加Cor的濃度，掃描Δλ=15nm和60nm時(shí)的同步熒光光譜，如圖6所示。

圖6 Cor與HSA相互作用的同步熒光光譜

可見，Cor的加入使HSA的酪氨酸和色氨酸熒光強(qiáng)度均有減弱，其中酪氨酸殘基的發(fā)射波長無變化，而色氨酸殘基的發(fā)射波長略紅移0.8nm，說明Cor與HSA的結(jié)合作用使色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性有所降低。因此，Cor的加入對(duì)HSA構(gòu)象有一定的影響，但不顯著。此外，7.0×10-6mol/L Cor對(duì)HSA中酪氨酸熒光強(qiáng)度猝滅的程度（30.6%）大于色氨酸（24.9%），說明Cor在HSA上的結(jié)合部位更接近于酪氨酸殘基。

2.6.2 三維熒光光譜

三維熒光光譜表現(xiàn)的是熒光強(qiáng)度隨激發(fā)（λex）和發(fā)射（λem）波長同時(shí)變化的信息，是另外一種證實(shí)HSA構(gòu)象和微環(huán)境是否改變的方法［1，20］。圖7顯示了HSA和Cor-HSA復(fù)合物的三維熒光光譜。可見，HSA具有2個(gè)典型的熒光峰1和峰2。其中，峰1（λex/λem=280/345nm，F(xiàn)=1355.3）主要反映了蛋白質(zhì)中色氨酸殘基和酪氨酸殘基的光譜特性，而峰2（λex/λem=230/345nm，F(xiàn)=174.3）是由蛋白質(zhì)多肽鏈C=O骨架結(jié)構(gòu)n→π*電子躍遷引起的，反映了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況。與Cor作用后，HSA的熒光峰1（λex/λem=280/346nm，F(xiàn)=1045.3）和峰2（λex/λem=230/346nm，F(xiàn)=130.9）的熒光發(fā)射峰均略紅移1nm，且熒光強(qiáng)度都呈現(xiàn)明顯下降，其中峰1降低22.8%，峰2降低24.9%。說明Cor的加入對(duì)HSA生色團(tuán)（主要是色氨酸和酪氨酸）微環(huán)境及其二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的影響，這與同步熒光光譜的結(jié)論是一致的。

圖7 Cor與HSA相互作用的三維熒光光譜

3 結(jié)論

在模擬人體血液pH值條件下，采用熒光猝滅法、位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)、同步熒光和三維熒光光譜對(duì)Cor與HSA的相互作用進(jìn)行了研究，獲得了Cor-HSA體系的猝滅機(jī)制、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合距離、結(jié)合位置、作用力類型和構(gòu)象變化等相關(guān)信息。結(jié)果表明，Cor可引起HSA內(nèi)源熒光產(chǎn)生靜態(tài)猝滅，兩者間形成1∶1復(fù)合物，其結(jié)合作用較強(qiáng)。Cor主要與HSA的位點(diǎn)III結(jié)合，其結(jié)合距離為9.33nm，疏水作用對(duì)兩者間的相互作用起著重要作用。另外，Cor的加入對(duì)HSA構(gòu)象影響不顯著。因此，HSA可以作為Cor的有效載體，HSA在貯存和轉(zhuǎn)運(yùn)Cor的過程中只微弱改變色氨酸所處的微環(huán)境，Cor對(duì)HSA沒有毒害作用。

［1］吳雨，韓忠保，馬嘉澤，等.同步熒光光譜法結(jié)合分子對(duì)接研究金雀花堿與牛血清白蛋白間相互作用［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2016，36（3）：765-769.

［2］Tang J H，Lian N，He X H，et al.Investigation of the interaction between sophoricoside and human serum albumin by optical spectroscopy and molecular modeling methods［J］.J Mol Struct，2008，889（1）：408-414.

［3］何文英，姚小軍，陳光英.胡椒堿分子鍵合人血清白蛋白位點(diǎn)的表征［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2010，26（3）：268-274.

［4］吳秋華，周欣，臧曉歡，等.白藜蘆醇與人血清白蛋白相互作用的光譜研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2009，29（1）：226-230.

［5］申炳俊，金麗虹，張佳佳，等.對(duì)-香豆酸與人血清白蛋白相互作用的熒光和表面增強(qiáng)拉曼光譜研究［J］.發(fā)光學(xué)報(bào)，2016，37（10）：1159-1165.

［6］Li Y，Yao X，Jin J，et al.Interaction of rhein with human serum albumin investigation by optical spectroscopic technique and modeling studies［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1774（1）：51-58.

［7］Adesina S K，Idwu O，Ogundaini A O，et al.Antimicroboal constituents of the leaves of acalypha wilke aadalypha hiapida［J］.Phytother Res，2000，14（5）：371-374.

［8］Olson J K，Miller S D.Microglia initiate central nervoussysteminnateandadaptiveimmuneresponses through multiple TLRs［J］.Journal of Immunology，2004，173（6）：3916-3924.

［9］陳一燕，陳崇宏.柯里拉京藥理活性研究進(jìn)展［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010，27（5）：390-394.

［10］Villamor J P，Zaton A M L.Data plotting of warfarin binding to human serum albumin［J］.Journal of Biochemical and Biophysical Methods，2001，48（1）：33-41.

［11］張黎偉，張新祥.親和毛細(xì)管電泳法和熒光法研究氟喹諾酮類藥物與牛血清白蛋白的相互作用［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（4）：694-699.

［12］蔡曉明，張巖，予龍，等.高效親和色譜法測(cè)定2種中藥成分與人血清白蛋白的結(jié)合率［J］.色譜，2011，29（4）：358-361.

［13］Zhou Y L，Y LI Z.Studies of the interaction betweenpoly（diallyldimethylammoniumchloride）and DNA by spectroscopic methods［J］.Colloids and Surfaces A，2004，233（1-3）：129-135.

［14］Wang Q，He J W，Duan Y K，et al.Spectroscopy and docking simulations of the interaction between lochnericine and bovine serum albumin［J］.Luminescence，2015，30（2）：240-246.

［15］Lakowicz J R，Weber G.Quenching of fluorescence by oxygen：a probe for structural fluctuations in macromolecules［J］.Biochemistry，1973，12（21）：4161-4170.

［16］Yue Y Y，Chen X G，Qin J，et al.A study of the binding of CI Direct Yellow 9 to human serum albuminusingopticalspectroscopyandmolecular modeling［J］.DyesandPigments，2008，79（2）：176-182.

［17］張勇，張貴珠，王月梅，等.光譜法研究絲裂霉素、血清白蛋白以及金屬離子間的相互作用［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2000，16（6）：445-449.

［18］Huang S，Qiu H N，Lu S Y，et al.Study on the molecularinteractionofgraphenequantumdots with human serum albumin：Combined spectroscopicandelectrochemicalapproaches［J］.Journalof Hazardous Materials，2014，285C（S2-3）：18-26.

［19］Ross P D，Subramanian S.Thermodynamic of proein association reactions：forces contributing to stability［J］.Biochemistry，1981，20（11）：3096-3102.

［20］黃英，王娟，郭改英，等.光譜法研究硫鳥嘌呤與七元瓜環(huán)及牛血清白蛋白的超分子相互作用［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2013，34（2）：375-380.

Study on Interaction of Corilagin and HSA by Fluorescence Spectroscopies

SHEN Bingjun1，MIAO Miao2，LIU Hui2，LI Ping2，ZHOU Jinxiu2，CAO Yuning2，JIN Lihong2，TIAN Jian1
（1.Laboratory of Clean Energy Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022；2.School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

Under the simulative physiological conditions（pH=7.4，ionic strength 0.1mol/L）the interaction between Corilagin（Cor）and human serum albumin（HSA）was investigated by fluorescence spectroscopy，competition experiment，synchronous fluorescence and 3D fluorescence.Results showed that the main quenching mechanism between Cor and HSA was a static quenching process.All the magnitude binding constants（KA）were 2.79×103（298K），2.22×104（304K）and 8.41×104L/mol（310K）.According to Van't Hoff equation，the interaction between Cor and HSA was mainly hydrophobic interaction.The binding distances between Cor and HSA was 9.33nm based on F?rster energy transformation.It was pointed out by marker competition experiments that the primary binding site for Cor was located at site III in the HSA.3D dimensional，synchronous and fluorescence spectrum showed that the conformation of HSA did not change apparently with the addition of Cor.

corilagin；human serum albumin；fluorescence spectrum；competition experiment

O657.3

A

1672-9870（2016）06-0075-06

2016-09-26

國家自然科學(xué)基金（21153003）；吉林省教育廳（201574）；長春理工大學(xué)博士后基金（2014年）

申炳?。?977-），男，博士研究生，助理研究員，E-mail：bjshen@cust.edu.cn

田堅(jiān)（1956-），男，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：tianjian@cust.edu.cn