血清C反應(yīng)蛋白熒光免疫層析檢測方法的建立

葛宇新，丁秋雨，鐘曉騮，栗慧超，劉倩，史新宇，趙晶晶，于源華，張昊

（1.長春理工大學(xué)校醫(yī)院，長春 130022；2.長春理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，長春130022；3.長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022）

血清C反應(yīng)蛋白熒光免疫層析檢測方法的建立

葛宇新1，丁秋雨2，鐘曉騮2，栗慧超3，劉倩3，史新宇3，趙晶晶3，于源華3，張昊3

（1.長春理工大學(xué)校醫(yī)院，長春 130022；2.長春理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，長春130022；3.長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022）

針對人體急性炎癥反應(yīng)的快速檢測，建立了基于量子點碲化鎘（CdTe）的熒光免疫層析分析方法及快速定量檢測卡，實現(xiàn)血清中炎癥標志物C反應(yīng)蛋白（CRP）的快速定量檢測。該檢測卡采用雙抗體夾心法，首先利用酶聯(lián)免疫方法篩選出CRP測定最佳包被抗體與標記抗體，然后通過N-羥基琥珀酰（NHS）和1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）共價偶聯(lián)法，將CdTe量子點與CRP鼠源單克隆抗體偶聯(lián)，制備抗體熒光標記物，同時優(yōu)化不同條件下單克隆抗體與CdTe量子點的偶聯(lián)效果，瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，進而構(gòu)建CRP熒光免疫層析檢測卡，通過建立量子點熒光強度與CRP標準品濃度之間的定量關(guān)系，從而實現(xiàn)人體血清中CRP的定量檢測。結(jié)果表明，CRP檢測卡定量檢測線性范圍為0.1～1000ng/ml，臨床樣本測試結(jié)果顯示與進口試劑具有良好的相關(guān)性。因此研究為急性炎癥反應(yīng)的快速診斷，及熒光免疫層析檢測卡的研發(fā)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

C反應(yīng)蛋白；量子點；熒光免疫層析；定量檢測

近年來，心肌損傷已經(jīng)成為嚴重威脅人類生命健康的疾病之一［1］。C反應(yīng)蛋白（CRP）相對分子質(zhì)量115kDa，由5個相同亞基以非共價鍵的形式相結(jié)合，形成對稱環(huán)狀五聚體結(jié)構(gòu)，在過酸或過堿環(huán)境中被分解為亞基單體，產(chǎn)生免疫反應(yīng)［2］。傳統(tǒng)觀點認為CRP是一種非特異性炎癥標志物，但近十年的研究揭示了CRP直接參與了炎癥、動脈粥樣硬化等心血管疾病，是心血管疾病最強有力的預(yù)示因子與危險因子［3］。CRP含量增高與心肌炎癥反應(yīng)及損傷有著密切聯(lián)系，可以作為心肌損傷的重要指標［4，5］。炎癥反應(yīng)或者細胞損傷時，CRP在血清中含量變化范圍較大，最高可達正常值的幾千倍；當(dāng)發(fā)生急性心肌梗死時，CRP在24至48小時內(nèi)迅速升高，3天后下降，1到2周后恢復(fù)正常，所以CRP是急性心肌梗死的重要標志物，其快速定量檢測對心肌梗死早期診斷具有重要意義［6-10］。

近年來，CRP檢測常見方法有比濁法、乳膠凝集法、酶聯(lián)免疫（ELISA）及膠體金等檢測方法［11］。比濁及ELISA法雖準確度高，但操作繁瑣，檢測所需時間較長。膠體金法雖檢測時間短，操作簡單，但靈敏度低，不能實現(xiàn)定量檢測。量子點（QDs）是一種半導(dǎo)體納米顆粒，與其它免疫熒光分析方法中通常采用的有機熒光染料相比，光化學(xué)特性具有非常明顯的優(yōu)勢［12，13］。當(dāng)QDs納米顆粒受到外來光源激發(fā)，發(fā)射熒光光譜窄、散射少、光漂白作用小、光化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、不易被生物代謝和化學(xué)因素降解［14，15］。量子點能夠通過偶聯(lián)劑與蛋白分子進行共價偶聯(lián)［16］。利用上述特點，本文以CdTe量子點為標記物，以CRP鼠源單克隆抗體（IgG1）為模式抗體，利用EDC與NHS作為活化劑活化量子點，促進其與抗體的共價偶聯(lián)。對EDC與NHS加入量、量子點含量、緩沖液pH值、共價偶聯(lián)時間與溫度等條件對偶聯(lián)結(jié)果的影響做了詳盡探討，并研制熒光免疫層析檢測卡，其操作簡單，10min即可獲得檢測結(jié)果，靈敏度較高，線性范圍較寬，可實現(xiàn)血清中CRP定性與定量檢測［17］。對臨床醫(yī)學(xué)快速檢測技術(shù)的發(fā)展具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

C反應(yīng)蛋白（CRP）抗原、CRP單克隆抗體MCo1及MCo2（杭州啟泰生物技術(shù)有限公司，中國）；CdTe量子點（海王英特龍生物技術(shù)有限公司，中國）；羊抗鼠IgG（上海生工生物工程有限公司，中國）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）（Sigma，美國）。

核酸電泳槽DYC-02、電泳儀DYY-6B（北京六一實驗儀器公司，中國）；小型高速離心機Centrifuge 5427 R（Eppendorf，德國）；三維平面點膜儀（上海金標生物科技有限公司，中國）；熒光免疫層析檢測儀（上海捷寧生物科技有限公司，中國）。

1.2 量子點與抗體偶聯(lián)最佳條件的研究

1.2.1 包被抗體與標記抗體的篩選

利用ELISA間接法測定CRP單克隆抗體MCo1及MCo2效價，選取效價高的作為包被抗體，效價低的作為標記抗體。具體方法如下：（1）將CRP抗原配制為2μg/ml，倍比稀釋4梯度濃度，每濃度兩個重復(fù)，每孔100μl，置于37℃恒溫箱孵育0.5h；（2）棄上清，每孔加入200μl洗滌液（磷酸鹽-吐溫20緩沖液，PBST），清洗3min，重復(fù)3次；CRP抗體按1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000比例稀釋，分別縱向加入酶標板，每孔100μl，37℃孵育0.5h；（3）棄上清，PBST洗滌，每孔加入100μl HRP-羊抗鼠多抗（1：3000稀釋），37℃孵育1h；（4）棄上清，PBST洗滌，加入TMB應(yīng)用液，每孔100μl，25℃避光反應(yīng)20min；再加入50μl終止液，使用酶標儀測定波長450nm處吸光度，計算獲得抗體效價。

1.2.2 CdTe量子點與CRP單抗共價偶聯(lián)及條件優(yōu)化

取1ml 0.1M MES緩沖液（pH 6.0），加入20μl量子點，超聲2min，加入EDC溶液（0.1mg/ml）2.5μl，加入NHS溶液（0.1mg/ml）2.5μl，37℃振蕩15min。加入CRP單克隆標記抗體（1mg/ml）20μl，25℃恒溫水浴鍋中振蕩反應(yīng)60min，加入2μl10% BSA封閉，12000rpm離心10min，沉淀加入重懸液（3%Triton-100，3%蔗糖，1%酪蛋白鈉，Tris-HCl緩沖液pH6.0）0.3ml，4℃避光，備用。

偶聯(lián)條件的優(yōu)化步驟分別為（1）EDC/NHS添加量：按照上述共價偶聯(lián)步驟，在偶聯(lián)體系中分別加入體積為160μl、80μl、40μl、20μl、10μl、5μl、2.5μl的EDC/NHS溶液（0.1mg/ml），EDC/NHS體積比為1∶1；（2）CdTe量子點含量：在加入CdTe量子點溶液時，加入體積分別為60μl、40μl、20μl、10μl、5μl；（3）MES緩沖液pH值：0.1M MES緩沖液用0.1M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值分別為3、4、5、6、7共五個梯度；（4）偶聯(lián)時間：加入CPR標記抗體后，25℃恒溫水浴鍋中振蕩偶聯(lián)時間分別為30min，60min，90min，120min，150min；（5）偶聯(lián)溫度：加入CPR標記抗體后，在恒溫水浴鍋中振蕩偶聯(lián)溫度分別為20℃，25℃，30℃，35℃。偶聯(lián)完成后每組均采用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，獲得最佳CdTe標記效果。

1.3 熒光免疫層析檢測卡制備

利用三維平面點膜儀進行層析卡試劑包被，質(zhì)控線為羊抗鼠多抗，包被濃度2.0mg/ml，檢測線為CRP單克隆抗體MC01，包被濃度為0.8mg/ml，包被完成后放入37℃烘箱干燥2h備用。層析卡選取Satorius CN140硝酸纖維素膜（NC膜）；杰一H5072吸水紙；GLB02玻纖作為樣品墊，其處理液含有1%Triton-100，3%蔗糖，1%PEG-20000和0.1% NaCl；Ahlstrom 6613聚酯纖維素膜作為釋放墊，其處理液含有0.1%Tween-20，1%海藻糖，0.1% PEG-20000和1%BSA。將吸水紙，NC膜，樣品墊及釋放墊依次貼于PVC板上，裁剪寬度4mm，放入密封袋中防潮備用。

1.3.1 檢測時間的確定

組裝試劑卡，每個試劑卡中加入標準品（100ng/ ml），利用熒光定量檢測儀每隔1.5min進行一次檢測，記錄T/C比值，T為檢測線，C為質(zhì)控線。由于標記抗體與包被抗體的量為定值，在層析完成后T線與C線熒光強度也為定值，所以當(dāng)T/C值趨于固定值時所記錄的時間即為檢測時間。

1.3.2 標準曲線的建立

采用磷酸鹽緩沖液（PBS）將CRP標準品分別稀釋為0.16μg/ml、0.8μg/ml、4μg/ml、20μg/ml、100μg/ml、0.5mg/ml，每組濃度5個重復(fù)，采用制備的熒光免疫檢測卡檢測CPR標準品，熒光免疫層析檢測儀檢測熒光強度，建立不同濃度CRP標準品與熒光強度的線性關(guān)系，確定CRP定量檢測靈敏度。

表1 CRP單克隆抗體MC01與MC02效價檢測結(jié)果

2 結(jié)果與討論

2.1 包被抗體與標記抗體的確定

兩種型號CRP單克隆抗體效價檢測結(jié)果如表1所示，抗體在同等稀釋比例條件下，其與抗原的結(jié)合能力即抗體效價均為MC02＞MC01，因此將MC02作為包被抗體，能夠捕獲更多抗原，從而提高免疫檢測靈敏度，將MC01作為標記抗體，用于檢測信號的獲取。

2.2 量子點與單抗共價偶聯(lián)

2.2.1 CdTe量子點表征

采用透射電子顯微鏡對CdTe量子點粒徑、形狀及分散度進行表征，結(jié)果如圖1所示，計算100個量子平均粒徑為12 nm，形狀均勻，顆粒分散度好，無聚沉現(xiàn)象。

圖1 CdTe量子點透射電子顯微鏡表征

2.2.2 最佳偶聯(lián)條件的優(yōu)化

CdTe量子點表面為羧基修飾，帶負電荷，在瓊脂糖凝膠電泳電場中向正極方向移動；當(dāng)量子點和蛋白分子通過共價偶聯(lián)后，形成聚合物，其電泳遷移率下降；如果形成聚合物較大或偶聯(lián)過量發(fā)生團聚時，將無法通過凝膠。因此如圖2所示，采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定不同條件下CdTe量子點與CRP標記抗體的偶聯(lián)效果，獲得最佳偶聯(lián)條件。

如圖2（A）所示，優(yōu)化偶聯(lián)時EDC/NHS比例，孔道1為CdTe量子點，孔道2-8為CdTe量子點與MC01標記抗體偶聯(lián)過程中，分別加入160～5μl 0.1M EDC溶液的復(fù)合物熒光檢測。結(jié)果表明，隨著EDC/NHS含量增加，CdSe量子點與CRP抗體偶聯(lián)復(fù)合物粒徑增大，但粒徑太大會導(dǎo)致無法從凝膠孔道中跑出；如果EDC/NHS含量過低又會導(dǎo)致活化效率降低，因此如孔道7所示為最佳活化劑含量，即在CdTe量子點與MC01標記抗體偶聯(lián)過程中加入5μl EDC/NHS。

如圖2（B）所示，優(yōu)化偶聯(lián)時CdTe量子點含量，孔道1為CdTe量子點，孔道2-6為CdTe量子點與MC01標記抗體偶聯(lián)時，分別加入量子點體積為5～60μl。結(jié)果表明，4號孔道CdTe量子點體積為20μl時，與MC01抗體偶聯(lián)效果最佳。

如圖2（C）所示，優(yōu)化偶聯(lián)時MES緩沖液pH值，孔道1是CdTe量子點，孔道2-6為CdTe量子點與MC01標記抗體偶聯(lián)時，MES緩沖液pH值分別為3-7。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)溶液pH值由3上升到5過程中，CdSe量子點與CRP抗體偶聯(lián)產(chǎn)物粒徑過大，說明在此pH值條件下偶聯(lián)復(fù)合物發(fā)生聚集，堵塞在孔道中；當(dāng)反應(yīng)溶液pH值為7時，量子點與抗體偶聯(lián)效率下降，條帶分為兩層。因此，如圖中孔道5所示，當(dāng)反應(yīng)溶液pH=6時，偶聯(lián)效果最佳。

如圖2（D）所示，優(yōu)化偶聯(lián)反應(yīng)時間，孔道1是CdTe量子點，孔道2-6為CdTe量子點與MC01標記抗體偶聯(lián)時，反應(yīng)時間分別為150～30min。結(jié)果表明，偶聯(lián)時間過長，易發(fā)生偶聯(lián)復(fù)合物團聚，條帶滯留（2-4孔道）；時間過短，偶聯(lián)率低，粒徑小，條帶遷移過快（6孔道）。因此，如5號孔道所示，當(dāng)偶聯(lián)反應(yīng)為60min時為偶聯(lián)效果最佳。

如圖2（E）所示，優(yōu)化偶聯(lián)反應(yīng)溫度，孔道1是CdTe量子點，孔道3-6為CdTe量子點與MC01標記抗體偶聯(lián)時，反應(yīng)溫度分別為35-20℃。結(jié)果表明，最佳偶聯(lián)溫度為25℃（5孔道）。

圖2 CdTe量子點與MC02標記抗體偶聯(lián)條件優(yōu)化

2.3 檢測時間的確定

制備的試劑卡加入100μl濃度為800ng/ml CRP標準品，每隔1.5min進行一次熒光檢測，其T/C比值結(jié)果如圖3所示，當(dāng)反應(yīng)時間大于9min后，T/C比值趨于穩(wěn)定，因此，最佳檢測時間為9min。

2.4 CRP定量檢測標準曲線及靈敏度

制備的CRP檢測卡采用雙單克隆抗體夾心免疫層析檢測法，當(dāng)待檢測樣本CRP含量剛好達到檢測卡靈敏度時，質(zhì)控線（C線）與檢測線（T線）同時顯色。通過對倍比稀釋的CRP標準品溶液進行檢測，濃度在0.1～1000ng/ml范圍內(nèi)，T線呈淺紅色到紅色的梯度變化，結(jié)果如圖3所示，孔道1-8其CRP抗原濃度依次為0ng/ml，0.1ng/ml，10ng/ml，100ng/ ml，200ng/ml，400ng/ml，800ng/ml，1000ng/ml，當(dāng)?shù)陀?.1ng/ml時T線不顯色，但是通過熒光定量檢測儀可以捕獲熒光信號，當(dāng)加樣量低于0.05ng/ml時熒光定量檢測儀捕獲不到信號，所以試劑卡的靈敏度為0.05ng/ml。

圖3 檢測時間優(yōu)化結(jié)果

圖4 CRP標準溶液熒光檢測卡測試結(jié)果

采用熒光檢測儀對檢測卡的熒光信號進行測定，以熒光強度為Y軸，以CPR標準品濃度為X軸，繪制定量檢測標準曲線，結(jié)果如圖4所示，CRP標準品濃度與熒光強度呈正線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2大于0.99。

圖5 CRP定量檢測標準曲線

3 結(jié)論與展望

本論文以熒光量子點CdTe為標記物，通過EDC與NHS實現(xiàn)量子點與CPR單克隆抗體的共價偶聯(lián)，從而建立了雙單克隆抗體夾心熒光免疫層析CPR定量檢測方法，制備了CRP熒光免疫層析檢測卡，結(jié)合熒光檢測儀，實現(xiàn)了CPR的定量檢測。該方法制備的熒光試紙條檢測CRP線性范圍為0.1～1000ng/ml，最低檢測限0.05ng/ml。與傳統(tǒng)ELISA方法相比，熒光免疫層析試紙條定量檢測方法無需繁瑣的多次加樣、反復(fù)洗板步驟，且10min內(nèi)即可完成單個樣品的檢測，因此該定量檢測方法在臨床上對AMI的快速準確檢測具有重要的意義。

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［17］鐘曉騮.心肌損傷免疫熒光檢測方法及試劑卡［D］.長春：長春理工大學(xué)，2016

Quantitation Determination of CRP in Serum with Fluorescence Immune Chromatography

For rapid detection of human acute inflammatory response，a fluorescence immuno-chromatographic analysis method of double monoclonal antibody sandwich ELISA was developed，which based on quantum dots of cadmium telluride（CdTe），for the rapid and quantitative detection of inflammatory marker C-reactive protein（CRP）in serum.In this work，at first，capture antibody and labeled antibody for CPR detection were screened by ELISA.Second，CdTe quantum dots and CRP murine monoclonal antibodies were covalent binding by N-hydroxysuccinimide（NHS）and 1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride（EDC），as well as the best condition of covalent binding was optimized and identified by agarose gel electrophoresis.After that，fluorescent immuno-chromatographic test strip for CPR rapid detection was prepared.In addition，the quantitative relationship between the quantum dot fluorescence intensity and the concentration of CRP standard was established，the results showed that the linear range of quantitative determination of CRP test strip was from 0.1 to 1000ng/ml，the experimental test strip and commercial reagents were used in clinical serum samples detection，the results showed a good correlationship.In a word，this work can provide valubale basis for the rapid diagnosis of acute inflammatory reactions and the development of fluorescence immunoassay chromatography test strip.

CRP；quantum dot；fluorescence immunoassay chromatography；quantitation determination

R375

A

1672-9870（2016）06-0129-05

2016-07-19

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20140309013YY）

葛宇新（1971-），女，本科，主管護士，E-mail：837349751@qq.com

張昊（1985-），女，博士，講師，E-mail：853287300@qq.com

GE Yuxin1，DING Qiuyu2，ZHONG Xiaoliu2，LI Huichao3，LIU Qian3，SHI Xinyu3，ZHAO Jingjing3，YU Yuanhua3，ZHANG Hao3

（1.Hospital of Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022；2.School of Chemistry and Environmental Engineering，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022；3.School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）