辣椒中辣椒素類物質(zhì)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法研究

鄒 燕，馮德建，史謝飛，李懷平，譚和平

（中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院 茶葉標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610021）

辣椒中辣椒素類物質(zhì)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法研究

鄒 燕，馮德建，史謝飛，李懷平，譚和平

（中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院 茶葉標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610021）

建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定辣椒中辣椒素、二氫辣椒素和降二氫辣椒素3種辣椒素類物質(zhì)的方法。樣品用無水乙醇超聲提取，經(jīng)SB-C18色譜柱分離，以0.1%甲酸水溶液-甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：降二氫辣椒素和辣椒素質(zhì)量濃度在1.0~10000.0ng/mL范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，二氫辣椒素質(zhì)量濃度在0.5~10000.0ng/mL范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。方法的加標(biāo)回收率為96.8%～104.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，檢出限為0.075～0.15mg/kg，定量限為0.25～0.5mg/kg，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、線性范圍寬、所用試劑毒性小等優(yōu)勢(shì)，可很好地滿足辣椒中辣椒素、二氫辣椒素和降二氫辣椒素3種辣椒素類物質(zhì)的測(cè)定。

辣椒；辣椒素；二氫辣椒素；降二氫辣椒素；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用

0 引 言

辣椒是茄科植物辣椒（Capsicum annuum L.）或其栽培變種的干燥成熟果實(shí)，其味辛、性熱、歸心、脾經(jīng)，具有溫中散寒，開胃消食之功效，用于寒滯腹痛，嘔吐，瀉痢，凍瘡[1]，亦是日常生活中重要的蔬菜和調(diào)味品。辣椒素類物質(zhì)是辣椒的主要活性成分，也是辣椒中辣味的來源，具有鎮(zhèn)痛、抗癌、調(diào)節(jié)心血管壓力、保護(hù)胃黏膜、減肥、刺激毛發(fā)生長(zhǎng)等功能[2-3]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)、醫(yī)藥制藥、生物農(nóng)藥等領(lǐng)域。此類物質(zhì)主要包括辣椒素（Capsaicin）、二氫辣椒素（Dihydrocapsaicin）和降二氫辣椒素（Nordihydrocapsaicin）、高二氫辣椒素（Homodihydrocapsaicin）等化合物，但前三者含量之和占辣椒素類物質(zhì)總量的90%以上，其含量的高低直接影響著辣椒及其制品的辣度和療效；因此，準(zhǔn)確測(cè)定這3種辣椒素類物質(zhì)的含量是評(píng)價(jià)辣椒及其制品質(zhì)量的重要依據(jù)，也是保障辣椒新品種選育和推動(dòng)辣椒深加工研究的重要技術(shù)支撐。

目前，對(duì)于辣椒素類物質(zhì)含量的檢測(cè)方法有比色法、薄層色譜法、紫外分光光度法、高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜法[4-8]，其中以高效液相色譜法的應(yīng)用最為廣泛。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21266——2007《辣椒及辣椒制品中辣椒素類物質(zhì)測(cè)定及辣度表示方法》和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1381——2007《辣椒素的測(cè)定 高效液相色譜法》亦是采用此方法，但該方法對(duì)測(cè)定目標(biāo)物只能依靠保留時(shí)間定性，易受樣品中其他共存成分干擾而造成假陽性或假陰性結(jié)果，缺乏準(zhǔn)確的定性功能，且這兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)均采用甲醇-四氫呋喃的混合溶液作為提取溶劑，毒性較大。近年來，隨著質(zhì)譜的快速發(fā)展，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）兼顧高效液相的高效分離功能，且MS/MS的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描能夠進(jìn)一步排除基質(zhì)干擾，為目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確定性與定量分析提供了可靠依據(jù)。為此，本文建立了辣椒中辣椒素類物質(zhì)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法，優(yōu)化其樣品前處理及色譜條件，考察了方法的精密度與線性范圍等，以期為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)辣椒及其制品質(zhì)量、保障辣椒新品種選育和推動(dòng)辣椒深加工研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1260/G 6420型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（配ESI源）；Eppendorf 5810R型高速冷凍離心機(jī)；Sartorius BP 211D型電子天平；Millipore Milli-Q型超純水器；XW-80A型漩渦混合器；KH-5000DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；液氮冷凍粉碎機(jī)（FDV，祐麒機(jī)械有限公司）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 材料與試劑

材料與試劑：甲醇和甲酸（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），色譜純；無水乙醇（成都科龍化工試劑廠），分析純；辣椒素、二氫辣椒素和降二氫辣椒素（中草藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心），對(duì)照品。

樣品：市售干辣椒，編號(hào)A。

辣椒素類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取適量的辣椒素、二氫辣椒素、降二氫辣椒素對(duì)照品于10mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，于4℃下保存，有效期為2個(gè)月。使用時(shí)根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

新鮮辣椒于60℃下烘干24 h后用液氮粉碎機(jī)粉碎，混勻，干辣椒直接用液氮粉碎機(jī)粉碎，混勻。準(zhǔn)確稱取0.10g（精確到0.0001g）辣椒粉末于50mL離心管中，加入15 mL無水乙醇，超聲提取30min，6000r/min下離心10min，上層清液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，再重復(fù)操作兩次，合并3次提取液，無水乙醇定容，混勻，取1 mL提取液經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.4 液相色譜與質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱（2.1mm×100mm，2.7μm）；流動(dòng)相：A為0.1%的甲酸水溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序見表1；流量：0.2 mL/min；色譜柱溫度：40℃；進(jìn)樣量：1μL。

表1 梯度洗脫表

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI源，正離子模式；掃描方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；干燥氣（N2）溫度：350℃；霧化氣（N2）壓力：25psi（1psi=6.894kPa）；干燥氣流量：10.0L/min；噴霧電壓：4 000 V；3種辣椒素的質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

表2 3種辣椒素的MRM質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與驗(yàn)證

2.1 方法專屬性驗(yàn)證

準(zhǔn)確稱取辣椒樣品A 1份，按照本文方法進(jìn)行前處理，制得樣品溶液。分別取乙醇（空白溶液）、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、樣品溶液、樣品溶液加標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，考察本方法的專屬性，譜圖如圖1所示。結(jié)果表明，3種辣椒素類物質(zhì)峰形尖銳、對(duì)稱，保留時(shí)間穩(wěn)定，空白溶液和樣品溶液對(duì)3種辣椒素類物質(zhì)的分離和測(cè)定無干擾，表明本方法具有良好的專屬性，適合辣椒中辣椒素、二氫辣椒素和降二氫辣椒素3種辣椒素類物質(zhì)的測(cè)定。

圖1 乙醇、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、樣品溶液和樣品溶液加標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的MRM圖

2.2 方法靈敏度驗(yàn)證

分別取適量的辣椒素類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用無水乙醇稀釋成不同濃度的辣椒素類物質(zhì)單一標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照本文方法進(jìn)行測(cè)定，以信噪比法考察本方法的靈敏度。以3倍信噪比（3S/N）確定本文方法中降二氫辣椒素和辣椒素的檢出限為0.15mg/kg，二氫辣椒素的檢出限為0.075mg/kg；以10倍信噪比（10S/N）確定本文方法中降二氫辣椒素和辣椒素的定量限為0.5mg/kg，二氫辣椒素的定量限為0.25mg/kg，表明本方法具有良好的靈敏度。

2.3 方法線性與范圍驗(yàn)證

取適量的辣椒素類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用無水乙醇逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為10000.0，5000.0，2500.0，1000.0，500.0，250.0，100.0，50.0，25.0，10.0，5.0，2.5，1.0，0.5 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照本文方法進(jìn)行測(cè)定，以峰面積y與對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度x（ng/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，考察方法的線性與范圍。結(jié)果表明，降二氫辣椒素和辣椒素質(zhì)量濃度在1.0～10000.0ng/mL范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其中辣椒素的線性方程為y=99.026 442x-14.955 745，相關(guān)系數(shù)為0.999 9；降二氫辣椒素的線性方程為y=183.237915x-79.126037，相關(guān)系數(shù)為0.9998；二氫辣椒素質(zhì)量濃度在0.5～10000.0ng/mL范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為y=201.102776x-14.346401，相關(guān)系數(shù)為0.9999；表明本文方法具有良好的線性與范圍。

2.4 方法準(zhǔn)確度驗(yàn)證

準(zhǔn)確稱取辣椒樣品A 12份，等分成4組，其中3組分別添加適量不同濃度的辣椒素類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本文方法進(jìn)行測(cè)定，考察方法的準(zhǔn)確度，測(cè)定結(jié)果見表3。由表可知，本文方法測(cè)定辣椒中3種辣椒素類物質(zhì)的平均回收率在96.8%～104.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<5%，具有良好的準(zhǔn)確度。

表3 方法準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果（n=3）

2.5 方法精密度驗(yàn)證

準(zhǔn)確稱取辣椒樣品A 6份，按照本文方法進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)3天重復(fù)測(cè)定，考察方法的日內(nèi)精密度和日間精密度，測(cè)定結(jié)果見表4。由表可知，本文方法測(cè)定辣椒中3種辣椒素類物質(zhì)的日內(nèi)和日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<5%，具有良好的精密度。

表4 方法精密度測(cè)定結(jié)果

2.6 方法穩(wěn)定性驗(yàn)證

準(zhǔn)確稱取辣椒樣品A 1份，按照本文方法進(jìn)行前處理，待測(cè)液分別于室溫下放置1，2，4，8，12，24，48，72 h后進(jìn)行測(cè)定，考察方法的日內(nèi)穩(wěn)定性和日間穩(wěn)定性，測(cè)定結(jié)果見表5。由表可知，本文方法測(cè)定辣椒中3種辣椒素類物質(zhì)的日內(nèi)和日間穩(wěn)定性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<5%，具有良好的穩(wěn)定性。

表5 方法穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)束語

本文考察了辣椒樣品中辣椒素類物質(zhì)的測(cè)定方法，優(yōu)化了色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)，方法的加標(biāo)回收率為96.8%～104.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<5%，檢出限為0.075～0.15mg/kg，定量限為0.25～0.5mg/kg，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、線性范圍寬、所用試劑毒性小等優(yōu)勢(shì)，可很好地滿足辣椒中辣椒素、二氫辣椒素和降二氫辣椒素3種辣椒素類物質(zhì)的測(cè)定，可為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)辣椒及其制品質(zhì)量、保障辣椒新品種選育和推動(dòng)辣椒深加工研究提供技術(shù)支撐。

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（編輯：莫婕）

Study on the determination of capsaicinoids in capsicum by LC-MS/MS

ZOU Yan，F(xiàn)ENG Dejian，SHI Xiefei，LI Huaiping，TAN Heping
（Standard and Testing Technology of Tea Key Laboratory of Sichuan Province，National Institute of Measurement and Testing Technology，Chengdu 610021，China）

A method wasproposed forthedetermination ofcapsaicinoidsincludecapsaicin，dihydrocapsaicin and nordihydrocapsaicin in capsicum by LC-MS/MS.Capsaicinoids in capsicum were ultrasonically extracted with ethyl alcohol for three times，with 0.1%formic acid aqueous solution and methanol as mobile phase（gradient elution）.The capsaicinoids was analyzed by LCMS/MS in multiple reaction monitoring（MRM）mode and the extract was quantified by the external standard method.The results showed that a good linearity was obtained for nordihydrocapsaicin and capsaicinoids concentration in the range of 1.0-10000ng/mL，and dihydrocapsaicin on centration in the range of 0.5-10 000 ng/mL the average recoveries of perchlorate ranged from 96.8%to 104.0% with RSDs of less than 5%.The detection limit of capsaicinoids were 0.075-0.15 mg/kg，and the quantitation limit of capsaicinoids were 0.25-0.5mg/kg.The method is suitable for the determination and quality control of capsaicinoids in capsicum featuring simple operation，low toxicity，high sensitivity，good repeatability;wide linear range and other obvious advantages.

capsicum；capsaicin；dihydrocapsaicin；nordihydrocapsaicin；LC-MS/MS

A

：1674-5124（2016）12-0060-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.12.013

2016-08-22；

：2016-09-30

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFF0202305）；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2009NZ0015，2013NZ0040，2015GZ0084）

鄒 燕（1983-），女，四川中江縣人，助理研究員，從事食品安全檢測(cè)技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)研究。

譚和平（1957-），男，重慶市人，研究員，享受國(guó)務(wù)院政府津貼專家，從事生物化學(xué)茶產(chǎn)業(yè)鏈研究。