ELISA法檢測種蛋卵黃中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒抗體的研究

黃小潔，姚文生，楊承槐，孫瑩，安肖，任小俠，李慧姣，李俊平

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

ELISA法檢測種蛋卵黃中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒抗體的研究

黃小潔，姚文生，楊承槐，孫瑩，安肖，任小俠，李慧姣*，李俊平*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為研究種蛋卵黃中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)抗體的檢測方法，運用IDEXX公司的REV抗體ELISA檢測試劑盒，比較了不同提取方法、不同稀釋倍數(shù)、不同洗液對卵黃中REV抗體檢測結(jié)果的影響。結(jié)果顯示：當用直接提取的卵黃液做300倍稀釋檢測，用含0.05%吐溫-20的蒸餾水洗滌時，卵黃抗體的S/P比值與相應(yīng)雞群的血清抗體的S/P比值吻合度最高。應(yīng)用本方法分別對50枚SPF種蛋和50枚普通雞蛋進行檢測，SPF種蛋均為REV抗體陰性；普通雞蛋有4枚為REV抗體陽性，陽性率為8%。實驗表明，種蛋卵黃ELISA 抗體檢測法可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)血清抗體檢測，為SPF雞群的REV感染監(jiān)測奠定了基礎(chǔ)。

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒；ELISA；卵黃抗體

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(RE)是指由反轉(zhuǎn)錄病毒科網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)引起的禽類以急性網(wǎng)狀細胞腫瘤、生長抑制綜合癥、淋巴組織和其他組織的慢性腫瘤形成為特征的一群病理綜合癥[1]。REV不僅能夠通過接觸水平傳播，還能通過雞胚垂直傳播，使用非SPF禽胚制備活疫苗存在污染REV的潛在危險。目前，SPF雞胚生產(chǎn)企業(yè)主要通過檢測雞群血清抗體來確定雞群的感染狀態(tài)。然而，血清采集費時費力，還易引起雞的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致雞只生產(chǎn)性能下降，甚至誘發(fā)疾病[2]，并且對于疫苗生產(chǎn)企業(yè)而言，送檢血清的可靠性和真實性也難以保障[3]。這些問題的存在促使整個行業(yè)不得不考慮能否以種蛋卵黃抗體檢測來替代血清抗體檢測。

卵黃抗體是指雞、鴨、鵝等蛋禽卵黃中存在的抗體，也稱卵黃免疫球蛋白[4]，本研究利用REV具有可垂直傳播的特性，以及ELISA檢測方法簡便、準確、快捷的優(yōu)勢，研究運用ELISA方法檢測卵黃中的REV抗體。美國IDEXX公司生產(chǎn)的REV抗體ELISA檢測試劑盒是目前許多疫苗生產(chǎn)企業(yè)和研究單位進行REV抗體檢測的首選試劑盒，但該ELISA抗體檢測試劑盒是用于血清抗體的檢測，能否用于卵黃抗體檢測有待進一步驗證。為此，本試驗用該試劑盒對卵黃中REV抗體的ELISA檢測方法進行研究，以期代替?zhèn)鹘y(tǒng)的血清抗體檢測的方法用于SPF雞群的REV感染監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 普通產(chǎn)蛋雞，購自北京某雞場。

1.1.2 試劑盒 REV抗體ELISA試劑盒，批號GK160，購自IDEXX公司。

1.1.3 其他材料及試劑 SPF雞蛋購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司，普通雞蛋購自北京某超市；氯仿、吐溫20購自國藥集團。

1.2 方法

1.2.1 樣品收集血清 REV抗體陽性蛋雞4只，抗體陰性蛋雞1只，分別單獨隔離飼養(yǎng)，每天收集種蛋并作好標記，每周采集全血分離血清，連續(xù)收集4周。

1.2.2 卵黃抗體提取方法

1.2.2.1 直接提取法[5]吸取50 μL卵黃,加入450 μL稀釋液，吹打混勻，作為被檢樣品冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 氯仿萃取法[6]吸取300 μL卵黃，加入600 μL氯仿和900 μL生理鹽水，充分震蕩混勻后，37 ℃恒溫水浴30 min，期間攪拌2～3次，4000 r/min離心20 min，提取上層水相作為被檢樣品冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 卵黃洗滌液的選擇 將同一只雞的血清和雞蛋一一對應(yīng)，血清和卵黃均做500倍稀釋，每個樣品做1個重復(fù)，結(jié)果取平均值。如果2個孔的讀值差異太大，則重復(fù)檢測。血清檢測按REV ELISA抗體檢測劑盒說明書進行；卵黃分別用蒸餾水、含0.05%吐溫20的蒸餾水兩種洗液洗滌，其余步驟按REV ELISA抗體檢測劑盒說明書操作。

1.2.4 卵黃稀釋度的確定 按照已確定的卵黃抗體提取方法和洗滌液，將卵黃做300、400、500、600、700倍稀釋，進行ELISA抗體檢測，檢測結(jié)果與血清檢測結(jié)果進行比較，吻合度最高的稀釋度即為最佳卵黃稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 卵黃提取方法比較 本次實驗抗體陽性組共采集血清樣品16份，雞蛋樣品41份；抗體陰性組血清樣品4份，雞蛋樣品11份。按照直接提取法和氯仿萃取法提取卵黃抗體，其他操作按試劑盒說明，血清按試劑盒說明檢測。將OD值換算成S/P比值，同一次采樣的血清抗體和卵黃抗體S/P比值分別取平均值比較。結(jié)果表明，不同提取方法陰性對照組血清和卵黃S/P比值均低于0.5，檢測結(jié)果為陰性。陽性對照組的S/P值用spass軟件分析，兩種提取方法卵黃抗體S/P比值與血清抗體S/P比值的相關(guān)系數(shù)分別為0.764，0.946，且直接提取法卵黃抗體S/P比值更接近血清抗體水平(表1、圖1)。

表1 血清抗體及不同提取方法卵黃抗體S/P比值

2.2 ELISA洗滌液的確定 直接稀釋的卵黃進行ELISA抗體檢測，分別用蒸餾水及含0.05%吐溫-20的蒸餾水兩種洗滌液洗滌，其他操作按試劑盒說明進行。結(jié)果蒸餾水及含0.05%吐溫-20的蒸餾水兩種洗滌液卵黃抗體與血清抗體S/P值相關(guān)系數(shù)分別為0.936，0.997，且用含0.05%吐溫-20的蒸餾水洗滌，卵黃抗體S/P比值更接近血清抗體(表2和圖2)。

圖1 陽性組不同提取方法卵黃抗體與血清抗體S/P比值比較

圖2 陽性組不同洗滌液洗滌卵黃抗體與血清抗體S/P比值比較

樣品處理方法組別不同采樣點樣本數(shù)量(n)及S/P平均值第1次第2次第3次第4次nS/PnS/PnS/PnS/P血清/陽性組45.0344.3944.1843.08陰性組10.3210.2510.2610.23卵黃蒸餾水洗滌陽性組174.2964.27123.7662.12陰性組30.1920.1130.2130.10加0.05%吐溫20蒸餾水洗滌陽性組174.4564.49123.8762.63陰性組30.2020.2030.1730.19

2.3 卵黃樣品稀釋度的確定 按已確定的提取方法和洗滌液對300、400、500、600、700倍稀釋的卵黃進行測定，各稀釋度卵黃與血清抗體相關(guān)系數(shù)依次為0.961、0.851、0.724、0.595、0.476。結(jié)果表明，卵黃抗體進行300倍稀釋時S/P比值最接近血清抗體水平，并且隨著稀釋倍數(shù)的增加，與血清抗體的S/P比值偏差增大(表3、圖3)。

表3 血清抗體與不同稀釋度卵黃抗體S/P比值

圖3 陽性組不同稀釋度卵黃抗體與血清抗體S/P比值比較

2.4 SPF雞蛋和普通雞蛋樣品檢測結(jié)果 對50枚SPF種蛋和50枚普通雞蛋進行檢測，并經(jīng)兩次重復(fù)實驗驗證，SPF雞蛋均為REV抗體陰性，普通雞蛋有4枚檢測結(jié)果為REV抗體陽性，陽性率8%。

3 小結(jié)與討論

GB/T 17999-2008規(guī)定SPF雞群REV的監(jiān)測采用瓊脂擴散方法(AGP)或ELISA方法[7]。AGP 既能夠用于REV抗原檢測，又能用于REV抗體檢測，方法簡便、快捷，但敏感性較低，且需要大量的純化抗原或特異性血清[8]，因此在SPF雞群的REV感染監(jiān)測中大多使用ELISA方法檢測血清抗體。但血清檢測存在諸多技術(shù)問題，加之政策上SPF雞(蛋)管理的認證、檢測、使用等各個環(huán)節(jié)又是脫節(jié)的，疫苗生產(chǎn)行業(yè)對SPF雞(蛋)使用量大但缺少有效的監(jiān)控手段，疫苗生產(chǎn)企業(yè)與國內(nèi)SPF雞生產(chǎn)企業(yè)之間缺乏信賴，又無法獲得可靠血清用于檢測SPF雞質(zhì)量，如果能通過檢測SPF種蛋卵黃抗體來替代血清抗體，這些問題將迎刃而解。

本試驗結(jié)果表明，直接提取卵黃抗體的方法優(yōu)于氯仿萃取方法，原因可能是在萃取的過程中會損失部分抗體，導(dǎo)致抗體檢測S/P值降低。直接吸取卵黃檢測抗體時，卵黃粘稠性大，使用凍融的方法能夠降低卵黃的粘稠度。洗滌液中添加吐溫能使洗滌更徹底，減少非特異性吸附，降低了背景值。不同卵黃稀釋倍數(shù)的檢測結(jié)果顯示，稀釋300倍時卵黃抗體與血清抗體的S/P比值最接近，卵黃稀釋度過高，容易出現(xiàn)假陰性；而如果稀釋度太低，容易出現(xiàn)非特異性吸附，產(chǎn)生假陽性。運用本研究確定的方法檢測的50枚SPF雞蛋均為REV抗體陰性，而普通雞蛋則檢測出了抗體，證實我國商品雞群中有感染REV的情況。

本實驗確定了卵黃抗體樣品的處理方法、洗滌液的選擇及最佳卵黃稀釋倍數(shù)，通過現(xiàn)有REV抗體ELISA檢測試劑盒，對種蛋卵黃REV抗體進行檢測的方法可代替血清抗體檢測，從而為監(jiān)測SPF雞群感染REV狀況奠定了基礎(chǔ)。

[1] Saif Y M.禽病學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012.

[2] 楊百亮，郭羽.瓊擴試驗檢測雞傳染性法氏囊病卵黃抗體的研究[J].天津農(nóng)學院學報，2004，11(4)：27-29.

[3] 趙鵬，李德慶，董宣. SPF雞感染禽白血病病毒A/B 亞群后血清抗體與卵黃抗體的變化及其相關(guān)性斷[J].畜牧獸醫(yī)學報, 2014，45(4)：614-620.

[4] 陳斌，楊志華.雞卵黃免疫球蛋白(IgY)的作用機理及應(yīng)用前景[J].浙江畜牧獸醫(yī)，2005,(1)：9-10.

[5] 焦玉蘭，朱秀同，趙玉龍，等. ELISA 法檢測卵黃和血清中禽呼腸孤病毒抗體相關(guān)性試驗[J].中國獸藥雜志，2013,49 (2):37-39.

[6] 鄭立勇，喬彥良，馬鳳龍，等.卵黃抗體不同提取方法的比較[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009,(1)：106-107.

[7] 全國動物防疫標準化技術(shù)委員會.GB/T 17999-2008 SPF雞微生物學監(jiān)測 [S].北京：中國標準出版社.

[8] 莊金秋，梅建國，沈志強.禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒檢測方法研究進展[J].家禽科學, 2013, 10：45-50.

(編輯：李文平)

Study on the ELISA Detection for Avian Reticuloendotheliosis Virus Antibody in Egg Yolk

HUANG Xiao-jie, YAO Wen-sheng, YANG Cheng-huai, SUN Ying,AN Xiao, REN Xiao-xia, LI Hui-jiao*, LI Jun-ping*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

In order to detect avian reticuloendotheliosis virus antibody in egg yolk,the IDEXX ELISA kit for REV antibody detection was used, and the effects of different extraction methods, different dilution ratios and different distill water of egg yolk on detection results were compared. The result showed that the S/P ratio of egg yolk antibody was closer to that of serum ELISA antibody of the same chicken group when the egg yolk antibody was directly extracted from eggs and was diluted into 1∶300, and distill water containing 0.05% Tween-20 was used. Using this ELISA method, 50 SPF eggs and 50 ordinary eggs were tested.The result showed that all of SPF eggs were REV antibody negative;four ordinary eggs were REV antibody positive with the positive rate of 8%.This study showed that egg yolk antibody ELISA detection method could replace the traditional serum antibody detection, and would lay the foundation for Rev infection monitoring of SPF chickens.

REV； ELISA；egg yolk antibody

黃小潔，助理研究員，從事實驗動物管理工作。

李慧姣，E-mail:lihuijiao@ivdc.org.cn；李俊平，E-mail:lijunping@ivdc.org.cn

2015-09-17

A

1002-1280 (2016) 02-0007-05

S852.65