肥豬散發(fā)酵制劑的制備方法及質(zhì)量評(píng)價(jià)

郭芳茹，張遂平，楊慧敏，苑青艷

(河南亞衛(wèi)動(dòng)物藥業(yè)有限公司，鄭州 450008)

肥豬散發(fā)酵制劑的制備方法及質(zhì)量評(píng)價(jià)

郭芳茹，張遂平，楊慧敏，苑青艷

(河南亞衛(wèi)動(dòng)物藥業(yè)有限公司，鄭州 450008)

為了對(duì)肥豬散進(jìn)行發(fā)酵和質(zhì)量評(píng)價(jià)，采用固態(tài)發(fā)酵法，以各活性成分的含量為指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行處方篩選及優(yōu)化工藝，從性狀、粒度、活菌數(shù)、游離大豆異黃酮的含量及穩(wěn)定性等方面評(píng)價(jià)其質(zhì)量。結(jié)果表明：最適宜的發(fā)酵菌株為納豆芽孢桿菌，發(fā)酵溫度為38 ℃，發(fā)酵時(shí)間為4 d，接菌量為12%，含水量為140%，干燥溫度為47 ℃。肥豬散發(fā)酵制劑性質(zhì)穩(wěn)定，游離大豆異黃酮的含量為99.36 μg/g。采用固態(tài)發(fā)酵法制備的發(fā)酵肥豬散活性物質(zhì)含量高，穩(wěn)定性好。

肥豬散；固態(tài)發(fā)酵；工藝優(yōu)化；質(zhì)量評(píng)價(jià)；活菌數(shù)

肥豬散由綿馬貫眾、制何首烏、麥芽和炒黃豆組成，具有開胃、驅(qū)蟲、補(bǔ)養(yǎng)和催肥的作用，能夠提高畜禽的消化吸收機(jī)能和飼料利用率[2]。肥豬散傳統(tǒng)使用方法是將中藥粉碎后直接拌料飼喂，操作簡單，但由于藥物粒度較大，其中又存在很多難以溶出的活性成分，造成藥物的利用率低，藥效不能得到充分發(fā)揮。

中藥發(fā)酵技術(shù)是在一定的溫度和濕度條件下，利用酶和微生物的分解催化作用，將藥物發(fā)泡、生衣的方法。該方法結(jié)合了傳統(tǒng)發(fā)酵炮制工藝和現(xiàn)代生物技術(shù)、微生態(tài)學(xué)的優(yōu)勢(shì)，可以提高中藥有效成分的提取率、增強(qiáng)藥效、產(chǎn)生新的活性物質(zhì)、減輕藥物的毒副作用，為中藥的應(yīng)用開辟新的途徑。文獻(xiàn)報(bào)道[1]，黃芪發(fā)酵后所含的黃芪多糖是普通煎、煮、熬水提方法的0.365～5.040倍，我國衛(wèi)生部藥品檢驗(yàn)所動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，發(fā)酵中草藥只需1/28的量，即可與一般煎、煮、熬水提物一份的量發(fā)揮同等的藥效。

試驗(yàn)將中藥發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用到肥豬散中，利用現(xiàn)代生物技術(shù)和傳統(tǒng)中藥炮制方法結(jié)合，采用微生物發(fā)酵的方式對(duì)中藥散劑進(jìn)行科學(xué)處理，降低藥物的毒副作用，以期彌補(bǔ)中藥散劑起效慢和生物利用度低的缺陷。

1 材料

1.1 儀器 依利特P230高效液相色譜儀，HS3120型超聲波清洗機(jī)，YXQL31400型立式電熱壓力蒸汽消毒器，HHB11420型電熱恒溫培養(yǎng)箱，SWCJ1F型凈化工作臺(tái)，XS-18型顯微鏡，南京勝光醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.2 試劑與藥品 黃豆(市售)，麥芽(鄭州龍海啤酒物資有限公司)，綿馬貫眾(湖南省龍山縣春燕中藥材種植專業(yè)合作社)，何首烏(安徽曙光藥業(yè)銷售有限公司)，大豆苷元對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)111602-200901)，染料木素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)111802-201001)，MRS培養(yǎng)基(上海源葉生物科技有限公司)、麥芽汁培養(yǎng)基(自制)、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠)、PDA培養(yǎng)基(自制)，瓊脂粉(北京索萊寶科技有限公司)，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 菌株 保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus，廣東省微生物研究所，編號(hào)：GIM1.204)、啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae，中科院微生物菌種保藏中心，編號(hào)：ATCC9763)、納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto，河南農(nóng)大微生物實(shí)驗(yàn)室提供，編號(hào)：ATCC6633)、米曲霉(Aspergillusoryzae，上海通派生物科技有限公司，編號(hào)：CGMCC3.336)。

2 方法與結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn) 設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，考察發(fā)酵菌種類、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接菌量和干燥溫度對(duì)游離大豆異黃酮含量的影響，試驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果見表10所示。

表1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

游離大豆異黃酮的測(cè)定采用高效液相色譜法[3]，色譜柱Diamonsil-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸(36∶64)，流速為1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長260 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取染料木素和大豆苷元對(duì)照品各25 mg，分別用無水乙醇定容至25 mL作為儲(chǔ)備液，精密吸取兩種儲(chǔ)備液各1 mL置于同一100 mL容量瓶中，無水乙醇定容至刻度作為對(duì)照品溶液，其中含兩種對(duì)照品的濃度均為10 μg/mL。

供試品溶液的制備：取肥豬散發(fā)酵制劑1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入70%乙醇25 mL，超聲處理30 min，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻過濾，取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾即得供試品溶液。

2.2 多因素試驗(yàn)優(yōu)化處方和工藝 采用三因素三水平正交試驗(yàn)的方法對(duì)發(fā)酵時(shí)間、接種量、發(fā)酵溫度進(jìn)行優(yōu)化，按照正交試驗(yàn)表制備出發(fā)酵肥豬散樣品。

肥豬散發(fā)酵制劑的制備工藝為：取綿馬貫眾30 g，何首烏30 g，麥芽500 g，炒黃豆500 g，混合后粉碎過5號(hào)篩，得到淺黃色粉末。稱取10 g平鋪于90 mm平皿中，厚度約為3 mm，蓋好后正置，121℃高壓滅菌30 min，即得發(fā)酵培養(yǎng)基；配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，分裝滅菌后，挑取斜面菌種接種于液體培養(yǎng)基，于120 r/min，37℃條件下振蕩培養(yǎng)18 h[4]，加入適量的無菌水稀釋得到發(fā)酵用菌懸液，將菌懸液與發(fā)酵培養(yǎng)基均勻混合，置于適宜的溫度下發(fā)酵一定時(shí)間后取出，烘干，粉碎過篩得到顏色較深、氣味濃郁的肥豬散發(fā)酵制劑成品。

利用樣品中活菌數(shù)、游離大豆異黃酮、結(jié)合蒽醌[5]、麥芽堿[6]以及綿馬素[7]的含量5個(gè)綜合指標(biāo)篩選出最佳的處方和工藝，設(shè)置分值分別為30、30、15、15、10。正交試驗(yàn)及各指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果和結(jié)果分析見表2所示。

由正交試驗(yàn)分析結(jié)果得出，接種量對(duì)工藝的影響較大，其次是培養(yǎng)時(shí)間，溫度的影響較小，通過綜合評(píng)分和直觀分析，得出A3B3C2為最佳制備工藝。即：發(fā)酵菌種為納豆芽孢桿菌，加水量為140%，接菌量12%，發(fā)酵溫度38℃，發(fā)酵時(shí)間為4 d，干燥溫度為47℃。制備出的肥豬散發(fā)酵制劑性狀為深棕褐色粉末，有濃郁的醬香味。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 基本性質(zhì)及含量測(cè)定 按照最佳制備工藝制備出三批樣品，參照參考文獻(xiàn)[2]，測(cè)定以下檢測(cè)指標(biāo)。結(jié)果見表3所示。

2.3.1 性狀 取適量肥豬散發(fā)酵制劑，置光滑紙上，平鋪約5 cm2，將其表面壓平，在明亮處觀察，為色澤均勻的深棕褐色粉末。

2.3.2 粒度 采用篩分法，測(cè)定方法為：稱取100 g樣品，置5號(hào)藥典篩內(nèi)，通過5號(hào)篩的樣品平均為96.3%。

2.3.3 水分 水分平均含量為3.8%。

2.3.4 游離大豆異黃酮的含量 采用高效液相色譜法，三批發(fā)酵肥豬散中游離大豆異黃酮的平均含量為99.36 μg/g，RSD為2.1。2.3.5 活菌數(shù) 按平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)制劑中活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，以每個(gè)平板上生長30～300個(gè)菌落為宜，試驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值，計(jì)算肥豬散發(fā)酵制劑中含有的活菌數(shù)為3.34×1010CFU/g。

表3 肥豬散發(fā)酵制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果

2.4 加速試驗(yàn)

將三批肥豬散發(fā)酵制劑粉末置于培養(yǎng)皿中，攤成厚度小于5 mm的薄層，置于藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)箱中，在溫度為40 ℃±2 ℃，RH為75%±5%的條件下放置6個(gè)月，試驗(yàn)期間第1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月末分別取樣一次，對(duì)肥豬散發(fā)酵制劑的外觀、游離大豆異黃酮的含量和活菌數(shù)進(jìn)行考察，與0天結(jié)果比較。三批肥豬散發(fā)酵制劑的外觀性狀均為棕褐色粉末，其它數(shù)據(jù)見表4。

采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定的處方和工藝條件制備出3批肥豬散發(fā)酵制劑樣品，并對(duì)游離大豆異黃酮的含量、活菌數(shù)及制劑穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，含量結(jié)果分別為97.15%、101.25%、99.67%，在加速條件下放置6個(gè)月，含量無明顯變化，說明該工藝穩(wěn)定可靠，適用于制備肥豬散發(fā)酵制劑。

表4 肥豬散發(fā)酵制劑加速試驗(yàn)穩(wěn)定性

3 討論與小結(jié)

影響散劑發(fā)酵結(jié)果的因素很多，本試驗(yàn)先采用單因素試驗(yàn)的方法對(duì)制備發(fā)酵菌種、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量等因素進(jìn)行了考察，再采用正交試驗(yàn)的方法對(duì)處方和工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出制備肥豬散發(fā)酵制劑理想的工藝條件。

肥豬散中含有4種中藥，每種中藥的活性成分在發(fā)酵時(shí)都會(huì)發(fā)生變化，因此，本試驗(yàn)先以含量最高的游離大豆異黃酮為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定發(fā)酵工藝的主要影響因素及其大致范圍，再綜合考慮各活性成分的含量變化，確定制備的最佳處方和工藝。陳富文等[8]采用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)方中藥的發(fā)酵工藝，以高效液相色譜圖中總峰面積的提高率為指標(biāo)確定最佳發(fā)酵工藝，為復(fù)方中藥發(fā)酵工藝開發(fā)提供了基礎(chǔ)和參考，但本試驗(yàn)中的結(jié)合蒽醌類物質(zhì)是以其含量的下降為判斷指標(biāo)，因此不適合采用總峰面積法。

本試驗(yàn)制備的肥豬散發(fā)酵制劑活菌數(shù)含量高，游離大豆異黃酮的含量比發(fā)酵前提高1倍，何首烏中致下泄作用的蒽醌類物質(zhì)的含量顯著降低，說明微生物發(fā)酵過程能夠提高藥物活性物質(zhì)的含量，降低毒性[9]，這與張炳文[10]和杜晨暉等[11]研究的結(jié)果是一致的。 有關(guān)資料顯示麥芽經(jīng)發(fā)酵炮制后，可產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，能夠抑制動(dòng)物的支原體感染[12]，這種新活性物質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)有待于進(jìn)一步研究。

肥豬散發(fā)酵制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果符合藥典對(duì)中藥散劑的要求，在加速條件下放置6個(gè)月，外觀無明顯變化，含量無明顯下降現(xiàn)象，活菌數(shù)先下降后保持穩(wěn)定，說明該發(fā)酵制品穩(wěn)定性較好，可以在室溫下存放。

發(fā)酵中藥中還含有大量的活性益生菌，其本身就具有調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡，助消化和促生長的作用，因此發(fā)酵中藥在我國畜牧生產(chǎn)上發(fā)揮“量少、高效、安全”的優(yōu)勢(shì)，對(duì)我國發(fā)展無公害畜牧業(yè)，生產(chǎn)綠色畜產(chǎn)品，增強(qiáng)我國畜產(chǎn)品在國際上的競(jìng)爭力具有重要作用[13]。最近幾年，發(fā)酵技術(shù)在飼料上應(yīng)用很多，但在獸用中藥散劑中應(yīng)用并不常見[14]。隨著現(xiàn)代制藥技術(shù)的發(fā)展，發(fā)酵技術(shù)將會(huì)成為中藥現(xiàn)代化的重要手段。

[1] 張高娜，張建梅，谷巍. 微生物發(fā)酵中草藥在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 廣東飼料，2012，21(10)：28-31.

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[14]張秀云. 微生物發(fā)酵在中藥研究中的應(yīng)用[J]. 北方藥學(xué)，2012，9(4)：110.

(編輯：陳希)

Preparation and Quality Evaluation of Fermented Feizhusan

GUO Fang-ru，ZHANG Sui-ping，YANG Hui-min，YUAN Qing-yan

(HenanYaweiVeterinaryPharmaceutcalCo.,LTD,Zhengzhou450008；China)

To prepare fermented Feizhusan and to evaluate the quality of the product. Fermented Feizhusan was prepared by solid fermentation, suitable prescription was screened out by single factor tests and orthogonal test was performed to optimize the technological conditions. The quality of fermented Feizhusan was evaluated in properties, granularity, viable count, content of active ingredients and stability. Results revealed that the optimal fermentation strain wasbacillusnattoand temperature was 38 ℃, time was 4 d, quantity of bacteria was 12%, water content was 140% and drying temperature was 47 ℃. The basic properties was stability, the content of soybean isoflavones aglycon was 99.36 μg/g. Solid fermentation can be used to prepare fermented Feizhusan which contains high quantities of active ingredients and stable character.

Feizhusan；solid fermentation；technology optimization；quality evaluation；viable count

郭芳茹，碩士。從事獸藥新產(chǎn)品和新劑型研發(fā)。E-mail : 460294979@qq.com

2015-09-08

A

1002-1280 (2016) 01-0066-04

S852.65