超聲波輔助溶劑法提取紅景天中的多糖

鮑妮娜，于蓓蓓，孫銀平

1.宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州，234000；2.即墨市食品藥品監(jiān)督管理局，山東青島，266200；

超聲波輔助溶劑法提取紅景天中的多糖

鮑妮娜1，于蓓蓓2，孫銀平1

1.宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州，234000；2.即墨市食品藥品監(jiān)督管理局，山東青島，266200；

以紅景天為研究對象，考察了超聲波輔助溶劑法對多糖提取率的影響。對提取溫度、提取時間及料液比進行單因素考察，以正交試驗法優(yōu)化提取工藝條件。結(jié)果表明：影響紅景天多糖提取率的主次關(guān)系是溫度>時間>料液比，最佳工藝條件為提取溫度75℃、提取時間40 min、料液比1∶30，多糖提取率達到15.49%。相較于傳統(tǒng)的水提取法，超聲波輔助溶劑法在操作和多糖提取率上具有明顯的優(yōu)勢。同時利用鄰二氮菲—Fe2+氧化法測定羥自由基的清除率，以確定多糖活性。

紅景天多糖；超聲波輔助溶劑法；抗氧化活性

大量的研究資料表明，紅景天具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、補氣清肺以及興奮大腦和脊髓等作用[1]。我國從1980年代就開始紅景天的藥用開發(fā)研究，一些學者對其生理活性、藥用成分、栽培條件等方面進行了系統(tǒng)化的研究并獲得了一定的成果[2-3]。紅景天已被列入國家認可的藥物和食品范疇，其根莖提取物已成為中成藥、食品、飲料等開發(fā)產(chǎn)品的原料。

傳統(tǒng)上，國內(nèi)外采用熱水提取法提取紅景天多糖[4-5]。該法設(shè)備要求低，操作簡單，但需要較長的時間且多糖損耗較多。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)常用微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、酶解提取法等方法提取[6-8]。

本文采用超聲波輔助溶劑法提取紅景天中的多糖，并與傳統(tǒng)水提取法進行比較，即對所提取的多糖進行含量測定[9-11]，并以羥自由基的清除率來確定多糖的活性[12]。

1 試驗材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料與試劑：紅景天根莖(購于宿州市人民大藥店)，葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醇、石油醚、醋酸、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、磷酸鹽、Vc、過氧化氫等試劑均為分析純。

儀器：超聲波細胞粉碎機(昆山市超聲儀器有限公司)，紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)，高速冷凍離心機D-37520(Osterode Kendro Laboratory Products)，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 方 法1.2.1 多糖含量測定

多糖含量采用苯酚—硫酸法測定。

1.2.1.1 標準曲線繪制

精確稱取50 mg干燥(106℃)至恒重的葡萄糖標準品，用蒸餾水溶解定容至500 mL，分別取8支試管按表1順序加入所需試劑，混勻，常溫顯色后靜置10 min并在冷水中冷卻25 min，在波長490 nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，以O(shè)D490為縱坐標，得出標準曲線，標準曲線方程為：

y=67.414x+0.0032 (R2=0.9987)

表1 葡萄糖標準曲線試劑添加順序表

1.2.1.2 樣品測定

取一定量待測粗多糖樣品，加適量水溶解后置于容量瓶中定容，按標準曲線制作的試驗步驟測定吸光值，再由上述標準曲線方程計算多糖含量。

多糖提取率(%)= 提取物中多糖的質(zhì)量/原料的質(zhì)量×100%

1.2.2 水提取法

將3 g紅景天粉末于70℃水中提取2 h，料液比為1∶30。再將提取液濃縮，醇析后離心，沉淀經(jīng)無水乙醇、石油醚洗滌、干燥后即獲得粗多糖，稱重。

1.2.3 超聲波輔助溶劑法提取

稱取5份紅景天粉末，每份3 g，考察超聲波提取時間、提取溫度以及料液比對紅景天多糖提取率的影響。

試驗參數(shù)設(shè)置為：

(1)超聲波提取時間：10 min、20 min、30 min、40 min、50 min。

(2)提取溫度：60℃、65℃、70℃、75℃、80℃。

(3)料液比：1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30。

1.2.4 正交試驗設(shè)計

采用超聲波輔助溶劑提取法，稱取9份紅景天粉末，每份3 g，按照正交設(shè)計方案提取，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，超聲波處理時間、溫度和料液比每個因素選擇3個水平，按照L9(33)設(shè)計安排試驗(表2)。

表2 正交試驗因素水平表

1.2.5 鄰二氮菲—Fe2+氧化法測定多糖活性

1.2.5.1 配制溶液

配制不同濃度的Vc溶液和紅景天粗多糖溶液，濃度分別為0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL。

1.2.5.2 損傷吸光值

在試管中加入0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液1 mL和0.75 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，再加入1.5 mL濃度為50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，立即混勻，并分別加入蒸餾水將每管總體積補齊至10 mL，充分搖勻，再加入0.01%的過氧化氫溶液1 mL，37 ℃保溫1 h，在536 nm下測定吸光值A(chǔ)損失。

1.2.5.3 空白吸光值

按照1.2.5.2的步驟依次加入試劑，但不加入過氧化氫溶液，充分搖勻后37℃保溫1 h，在536 nm下測定吸光值A(chǔ)空白。

1.2.5.4 樣品吸光值

按照1.2.5.2的步驟依次加入試劑，將蒸餾水換成樣品溶液，之后的步驟也同1.2.5.2，測定的吸光值為A樣品。

羥自由基清除率(%)=(A樣品—A損失)/(A空白—A損失)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 水提取法正交試驗

如表3所示，比較各列極差R值，用傳統(tǒng)水提法提取多糖的各影響因素中，提取時間對紅景天多糖提取率影響最大，其次是溫度，最后是料液比。比較K值，可以得出最佳因素水平為A3、B3、C2，即提取溫度為80℃、時間為2.5 h、料液比為1∶30，在該條件下粗多糖得率最大，為5.76%。

表3 水提取法正交試驗結(jié)果

2.2 超聲波輔助溶劑法試驗

圖1 時間對紅景天粗多糖提取率的影響

2.2.1 提取時間對紅景天粗多糖提取率的影響

如圖1所示，紅景天粗多糖提取率隨提取時間的增加先增大后減小，當提取時間為30 min時，多糖得率最高，為14.35%。30 min之后隨提取時間的加長，紅景天粗多糖提取率趨于下降，這可能是由于超聲波的機械剪切極易破壞多糖結(jié)構(gòu)造成的，因而綜合考慮最佳提取時間為30 min。

2.2.2 提取溫度對紅景天粗多糖提取率的影響

如圖2所示，紅景天粗多糖提取率隨提取溫度的增加先增大后減小，當提取溫度為70℃時，多糖得率最高，為14.89%。當溫度超過70℃后紅景天粗多糖提取率呈現(xiàn)下降趨勢，這是因為溫度過高時，細胞漲大，細胞壁很容易被破壞，多糖快速溶出，多糖易發(fā)生水解，且高溫導致部分多糖結(jié)構(gòu)被破壞。因此，選定最佳提取溫度為70℃。

圖2 溫度對紅景天粗多糖提取率的影響

2.2.3 料液比對紅景天粗多糖提取率的影響

如圖3所示，料液比對紅景天粗多糖提取率有一定的影響，當料液比為1∶30時，多糖得率最高，為15.31%，隨后降低。這是因為加水過多降低了提取液的固形物含量，同時也使得其他可溶性成分也隨之增大，不利于分離，從而導致多糖提取率減小，因此料液比選為1∶30。

圖3 料液比對紅景天粗多糖提取率的影響

2.3 正交試驗結(jié)果分析

如表4所示，比較各列極差R值，用超聲波輔助溶劑法提取紅景天粗多糖的各影響因素中，處理溫度對紅景天粗多糖提取率影響最大，其次是時間，最后是料液比。比較K值，可以得出最佳因素水平為A3、B2、C3，即處理時間為40 min、料液比為1∶30、溫度為75℃，在該條件下粗多糖得率最大為15.49%。

2.4 多糖抗氧化活性測定

如圖4所示，Vc對羥自由基的清除率很高，當其濃度為0.06 mg/mL時清除率達到100%，粗多糖濃度達到0.1 mg/mL時清除率也達到100%，這說明紅景天粗多糖具有相對較好的抗氧化能力。

圖4 Vc和粗多糖濃度對羥自由基清除率的影響

表4 超聲波輔助溶劑法正交試驗結(jié)果

3 結(jié) 論

本文以紅景天為研究對象，考察了超聲波輔助溶劑法對紅景天粗多糖提取率的影響。對提取溫度、提取時間和料液比進行單因素考察，以正交試驗法對工藝條件進行了優(yōu)化。試驗結(jié)果表明：影響紅景天多糖提取率的主次關(guān)系是提取溫度>提取時間>料液比，最佳工藝條件為提取溫度75℃、提取時間40 min、料液比1∶30，多糖提取率最高為15.49%。相較于水提取法，超聲波輔助溶劑提取法，具有提取率高、較易掌控操作等優(yōu)點。用鄰二氮菲—Fe2+氧化法測定羥自由基的清除率，以確定多糖活性，結(jié)果表明紅景天多糖具有較好的抗氧化活性。

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(責任編輯：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2016.12.024

2016-08-25

宿州學院教授(博士)科研啟動基金資助項目(2015JB09)；宿州學院藥物生物技術(shù)研究所開放課題(2015YKF04)。

鮑妮娜(1984-)，女，山東煙臺人，博士，講師，主要研究方向：天然產(chǎn)物提取與開發(fā)。

Q94

A

1673-2006(2016)12-0083-04