銀翹藍(lán)芩口服液中綠原酸含量測(cè)定方法的建立

許春燕，劉希望，楊亞軍，孔曉軍，李世宏，秦 哲，楊孝樸，李劍勇*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

?

銀翹藍(lán)芩口服液中綠原酸含量測(cè)定方法的建立

許春燕1,2，劉希望2，楊亞軍2，孔曉軍2，李世宏2，秦 哲2，楊孝樸1，李劍勇2*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

為建立銀翹藍(lán)芩口服液中綠原酸含量的高效液相色譜測(cè)定方法，選用Scienhome Kromasil ODS-1 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水(體積比為20∶80)，檢測(cè)波長(zhǎng)324 nm，柱溫30 ℃，流速為1 mL/min進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，綠原酸在該色譜條件下，系統(tǒng)適應(yīng)性良好，在質(zhì)量濃度為19.32～96.60 μg/mL時(shí)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=29 059X-117 695，R2=0.999；加樣平均回收率為94.57%，RSD為1.93%；對(duì)3批樣品的綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定，RSD為1.76%。表明建立的方法可用于銀翹藍(lán)芩口服液中綠原酸含量的測(cè)定。

銀翹藍(lán)芩口服液； 綠原酸； 高效液相色譜法

銀翹藍(lán)芩口服液由金銀花、連翹、板藍(lán)根、黃芩等中藥材組成，是從中獸醫(yī)整體觀出發(fā)辨證加減并通過(guò)臨床療效試驗(yàn)篩選后研制成的新型中獸藥產(chǎn)品。該口服液以傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論為基礎(chǔ)，運(yùn)用現(xiàn)代藥物制劑技術(shù)，經(jīng)過(guò)將金銀花、黃芩、連翹、板藍(lán)根等中藥材與水共煎煮醇沉等工藝，富集其有效成分制備而成。藥效學(xué)表明，銀翹藍(lán)芩口服液清熱解毒、解表平喘，具有抑菌、促進(jìn)免疫等藥學(xué)作用[1-2]。金銀花是忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾，或初開(kāi)的花。夏初花開(kāi)放前采收，干燥[3]。金銀花具有清熱解毒、抗病原微生物、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等作用，且對(duì)常見(jiàn)的呼吸道病毒有較強(qiáng)的抑制作用[4]，其有效成分為綠原酸，是植物體內(nèi)在有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)莽草酸途徑形成的一種苯丙素類物質(zhì)[5]，藥理活性顯著，故將綠原酸作為銀翹藍(lán)芩口服液質(zhì)量控制的指標(biāo)之一[6]。目前，關(guān)于綠原酸含量測(cè)定的方法多種多樣，如分光光度法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]、氣象色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)[9]、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)[10]等，但這些方法操作均較復(fù)雜。為此，依據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典(二部)》[11]和《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編(2006—2011)》[12]中的質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，研究綠原酸含量的測(cè)定方法，以建立簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確可靠的綠原酸含量測(cè)定方法，為該口服液的進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥品 綠原酸對(duì)照品(96.6%，批號(hào)110753-201413)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；銀翹藍(lán)芩口服液(批號(hào)：20141201、20141207、20150105)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制；不含金銀花對(duì)照口服液(批號(hào)：20141220)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制；甲醇、乙腈為色譜純，購(gòu)自Fisher Scientific公司。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀、Waters 2489紫外檢測(cè)器購(gòu)自Waters 公司，ME235S賽多利斯微量天平、Sartorius BS110S 電子天平購(gòu)自北京賽多利斯天平有限公司，溶劑過(guò)濾器購(gòu)自phennomen 公司，KQ-600DE 型數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Scienhome Kromasil ODS-1 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心)，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(體積比為20∶80)，檢測(cè)波長(zhǎng)為324 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 供試品溶液的配制 精密吸取1 mL銀翹藍(lán)芩口服液于50 mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；進(jìn)樣前用0.22 μm的尼龍濾膜過(guò)濾。

1.2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密稱取綠原酸對(duì)照品0.01 g于10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度線，搖勻，用0.22 μm的尼龍濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣量為10 μL，記錄色譜圖。分析綠原酸色譜峰的理論塔板數(shù)[11]。

1.2.4 雜質(zhì)干擾試驗(yàn) 按照1.2.2的方法分別配制銀翹藍(lán)芩口服液的樣品溶液和不含金銀花的對(duì)照口服液的樣品溶液，進(jìn)樣10 μL，分析不含金銀花對(duì)照口服液對(duì)綠原酸是否有干擾。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取綠原酸對(duì)照品0.01 g于10 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即為966 μg/mL的綠原酸儲(chǔ)備液。分別吸取不同體積的儲(chǔ)備液，用水稀釋為9.66、19.32、28.98、38.64、57.96、77.28、96.6 μg/mL。進(jìn)樣前用0.22 μm的尼龍濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣量為10 μL，不同質(zhì)量濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣3次，記錄色譜圖。以平均峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸得回歸方程[11-12]。

1.2.6 精密度試驗(yàn) 取同一批次銀翹藍(lán)芩口服液，按供試品溶液的配制，制得6個(gè)平行樣品，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，求得日內(nèi)精密度。取同一批次銀翹藍(lán)芩口服液樣品，按上述處理方法及色譜條件，分別于第0、1、2、3天處理進(jìn)樣，記錄峰面積，求得日間精密度[11-12]。

1.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密吸取銀翹藍(lán)芩口服液1 mL于50 mL容量瓶中，分別精密加入966 μg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.5、2.0、2.5 mL，搖勻，加水定容至刻度，即為加樣回收率的低、中、高質(zhì)量濃度樣品，質(zhì)量濃度分別為28.98、38.64、48.30 μg/mL。按供試品溶液制備方法，制備樣品，按上述色譜條件，每份樣品溶液吸取10 μL，進(jìn)樣、測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率[13]。

1.2.8 樣品含量測(cè)定 將銀翹藍(lán)芩口服液按照1.2.2的配制方法配制供試樣品溶液，進(jìn)樣量為10 μL。記錄色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品溶液質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性和雜質(zhì)干擾試驗(yàn)

從圖1可知，將綠原酸對(duì)照品、銀翹藍(lán)芩口服液、對(duì)照口服液分別進(jìn)樣10 μL，綠原酸的保留時(shí)間在15 min左右，綠原酸的理論塔板數(shù)12 396，滿足《中華人民共和國(guó)獸藥典(二部)》[14]中理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算不低于1 000的要求，不含金銀花的對(duì)照口服液對(duì)綠原酸的HPLC測(cè)定無(wú)干擾。

A：綠原酸對(duì)照品； B：銀翹藍(lán)芩口服液； C：對(duì)照口服液

2.2 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1為測(cè)定綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度和平均峰面積，以平均峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=29 059X-117 695，R2=0.999 (圖2)?？梢?jiàn)，綠原酸在質(zhì)量濃度為19.32～96.60 μg/mL時(shí)，線性關(guān)系良好。

表1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度和峰面積

圖2 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

從表2、表3可以看出，綠原酸的日內(nèi)精密度、日間精密度的RSD值分別為0.52%、0.44%，均小于5%，符合方法驗(yàn)證對(duì)精密度的要求。

表2 綠原酸的日內(nèi)精密度

表3 綠原酸的日間精密度

2.4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，在銀翹藍(lán)芩口服液的低、中、高加樣回收率中，綠原酸的回收率在92.47%～95.72%，總平均回收率為94.57%，RSD為1.93%，符合回收率在90%～110%的要求[15]。說(shuō)明綠原酸含量測(cè)定方法準(zhǔn)確度高。

表4 銀翹藍(lán)芩口服液的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品中綠原酸含量測(cè)定

對(duì)3批銀翹藍(lán)芩口服液進(jìn)行綠原酸含量測(cè)定(表5)，綠原酸的含量在1.68～1.74 mg/mL，RSD為1.76%。

表5 樣品中綠原酸含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)的色譜條件參照《中華人民共和國(guó)獸藥典(二部)》中雙黃連口服液制劑中規(guī)定的色譜條件，并依據(jù)銀翹藍(lán)芩口服液本身的特點(diǎn)和試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，《中華人民共和國(guó)獸藥典(二部)》規(guī)定測(cè)定綠原酸的流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶1)，在該試驗(yàn)的色譜條件下，綠原酸峰前有雜質(zhì)，且基線不穩(wěn)。當(dāng)用0.1%磷酸水代替冰醋酸水即甲醇-0.1%磷酸水(體積比為20∶80)時(shí)，色譜圖較好，理論塔板數(shù)高。

本研究的測(cè)定方法中，綠原酸的理論塔板數(shù)遠(yuǎn)大于《中華人民共和國(guó)獸藥典(二部)》的規(guī)定，說(shuō)明綠原酸的峰型好；不含金銀花的對(duì)照口服液無(wú)干擾；綠原酸質(zhì)量濃度在19.32～96.60 μg/mL時(shí)，線性關(guān)系良好；日內(nèi)精密度和日間精密度的RSD均小于5%，說(shuō)明測(cè)定結(jié)果在日內(nèi)和日間偏差較小，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好；加樣回收率試驗(yàn)的RSD值為1.93%，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果與真實(shí)值偏差小，準(zhǔn)確度高；3批口服液綠原酸含量測(cè)定結(jié)果的RSD值為1.76%，說(shuō)明該測(cè)定方法的重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確。本試驗(yàn)中用于溶解樣品的溶液為水，試驗(yàn)所需的試劑為試驗(yàn)室常用的色譜級(jí)試劑，操作簡(jiǎn)便，價(jià)格便宜，符合方法學(xué)驗(yàn)證的要求。

本研究建立的銀翹藍(lán)芩口服液中綠原酸含量的測(cè)定方法符合檢測(cè)要求，該方法簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好，且結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于銀翹藍(lán)芩口服液中綠原酸含量的測(cè)定，為銀翹藍(lán)芩口服液的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)，并為其進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

[1] 陳佳娟,李劍勇,楊亞軍,等.基于體外抑菌作用篩選的中藥注射劑“炎毒熱清”[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,49(3):635-637.

[2] 陳佳娟.中獸藥“炎毒熱清”注射液的篩選與毒理藥效學(xué)研究[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[3] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典(二部)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)版社,2010:294.

[4] 王林青,崔保安,張紅英.金銀花藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2007,34(11):91-95.

[5] 劉軍海,裘愛(ài)泳.綠原酸的提取分離及含量測(cè)定[J].中國(guó)油脂,2005,30(3):54-56.

[6] 尉芹,馬希漢.綠原酸及其提取分離方法評(píng)述[J].中成藥,2001,23(2):135-138.

[7] 邢俊波,李會(huì)軍,李萍,等.中藥金銀花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究——總黃酮的含量測(cè)定[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2002,19(3):169-170.

[8] Chen J,Li S L,Li P,etal.Qualitative and quantitative analysis of active flavonoids inFlosLoniceraeby capillary zone electrophoresis coupled with solid-phase extraction[J].J Sep Sci,2005,28(4):365-372.

[9] 吉力,潘炯光.忍冬花揮發(fā)油的GC-MS分析[J].中國(guó)中藥雜志,1990(11):40-42.

[10] Ren M T,Chen J,Song Y,etal.Identification and quantification of 32 bioactive compounds in Lonicera species by high performance liquid chromatography coupled with time of flight mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal,2008,48(5):1351

[11] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典(二部)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)版社,2010：173-175.

[12] 農(nóng)業(yè)部獸藥評(píng)審中心.獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編(2006—2011)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2012:32-37.

[13] 程培培,楊亞軍,劉希望,等.新型復(fù)方氟苯尼考注射液中氟尼辛葡甲胺含量測(cè)定方法研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,43(3):142-146.

[14] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典(二部)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)版社,2010:295.

[15] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè):GB/T 27404—2008 [S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008:31.

Establishment of Determination Method of Chlorogenic Acid Content in Yinqiaolanqin Oral Liquid by High Performance Liquid Chromatography

XU Chunyan1,2,LIU Xiwang2,YANG Yajun2,KONG Xiaojun2, LI Shihong2,QIN Zhe2,YANG Xiaopu1,LI Jianyong2*

(1.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China; 2.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS/Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development, Ministry of Agriculture/Key Laboratory of New Animal Drug Project of Gansu Province,Lanzhou 730050,China)

In order to establish the determination method of chlorogenic acid content in Yinqiaolanqin oral liquid by high performance liquid chromatography(HPLC),Scienhome Kromasil ODS-1 C18 column (250 mm×4.6 mm，5 μm) was used.The HPLC system used a mobile phase composed of Methanol-0.1% phosphoric acid water (20∶80，V/V)at a flow rate of 1 mL/min,the ultraviolet detector was set at 324 nm with column temperature of 30 ℃.The HPLC system suitability of chlorogenic acid was good.A good linear calibration of chlorogenic acid was observed within the concentration rang of 19.32—96.60 μg/mL(R2=0.999),and the average recovery rate was 94.57% with relative standard deviation(RSD) of 1.93%,the regression equation wasY=29 059X-117 695.TheRSDof chlorogenic acid content in three lots of Yinqiaolanqin oral liquid was 1.76% indicating the method could be employed to determine the content of chlorogenic acid in Yinqiaolanqin oral liquid.

Yinqiaolanqin oral liquid; chlorogenic acid; high performance liquid chromatography(HPLC)

2016-05-26

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303040-12)；蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012-2-73)

許春燕(1988-)，女，河南駐馬店人，在讀碩士研究生，研究方向：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)。E-mail：zmdchunyan@163.com

*通訊作者：李劍勇(1971-)，男，甘肅秦安人，研究員，博士，主要從事新獸藥開(kāi)發(fā)研究。E-mail：lijy1971@163.com

S859.1

A

1004-3268(2016)11-0126-04