基于免疫分析的杏仁蛋白飲料中杏仁蛋白質(zhì)定量方法研究

張世偉，賴心田*，王士峰，黃靜敏，馮榮虎，譚貴良，劉 垚，楊國武(.深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，深圳 580； .廣東省中山市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所，廣東 中山 58403)

基于免疫分析的杏仁蛋白飲料中杏仁蛋白質(zhì)定量方法研究

張世偉1，賴心田1*，王士峰1，黃靜敏1，馮榮虎1，譚貴良2，劉 垚2，楊國武1
(1.深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，深圳 518102； 2.廣東省中山市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所，廣東 中山 528403)

為建立基于競爭酶聯(lián)免疫分析(ELISA)的杏仁蛋白飲料中杏仁蛋白質(zhì)定量方法，使用2-D電泳結(jié)合MALDI-TOF/ MS鑒定了杏仁的高豐度蛋白，分離純化了杏仁40 ku prunin蛋白α鏈，并以此作為抗原制備了抗杏仁蛋白單克隆抗體，使用該抗體建立了檢測杏仁蛋白質(zhì)的競爭酶聯(lián)免疫分析方法。該方法以杏仁可溶全蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，IC50為19.6 μg/mL，線性范圍為5.0～100 μg/mL(R2=0.990)。該方法特異性良好，和其他可食種子蛋白質(zhì)無交叉反應(yīng)。檢測植物蛋白飲料樣品的檢出限為0.6 mg/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<10%。使用巴氏殺菌、超高溫瞬時滅菌和高壓滅菌的蛋白質(zhì)平均回收率分別為96%、92%和81%。

杏仁； 蛋白飲料； ELISA； 定量

杏仁是薔薇科(Rosaceae)杏的種子，分為甜杏仁和苦杏仁。苦杏仁又名北杏仁，含苦杏仁苷較高。由于苦杏仁苷經(jīng)水解后產(chǎn)生的氫氰酸有劇毒，一般只用于入藥[1]；甜杏仁又名南杏仁，含有苦杏仁苷相對較少，蛋白質(zhì)含量豐富(約20%)[2]。甜杏仁蛋白質(zhì)中含有人體必需的8種氨基酸, 與總氨基酸的比值(EAA/TAA) 約為30%[3]，其配比模式基本接近人體理想必需氨基酸模式，這使甜杏仁成為植物蛋白飲料的理想原料。

杏仁蛋白飲料作為消費量較大的植物蛋白飲料之一，因其味道香甜，深受消費者喜愛。杏仁蛋白飲料現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2438—2006規(guī)定其蛋白質(zhì)含量應(yīng)≥5 g/kg。但是一些廠商基于口感或是成本的考慮，使用廉價的蛋白質(zhì)替代杏仁蛋白質(zhì)，如加入牛乳、大豆粉或花生乳。雖然該行為并不危害食品安全并且部分企業(yè)會在配料表上明示，但具體加入多少也因缺乏檢測方法完全依賴于企業(yè)的自我宣稱。因此,需要建立杏仁蛋白飲料中的杏仁蛋白質(zhì)定量方法，為行業(yè)的健康發(fā)展提供可行的監(jiān)控手段。

基于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，組織中存在一些蛋白質(zhì)，其含量與總蛋白質(zhì)含量有比較穩(wěn)定的比例關(guān)系，可作為蛋白質(zhì)定量標(biāo)志物[4-5]。因此，通過對這些蛋白質(zhì)定量標(biāo)志物的測定即可推算出物種的總蛋白質(zhì)含量，實現(xiàn)物種蛋白質(zhì)含量的特異性定量。本研究通過雙向電泳技術(shù)確定了杏仁中的蛋白質(zhì)定量標(biāo)志物——Pru-1蛋白，并建立了基于該定量標(biāo)志物的杏仁飲料中杏仁蛋白質(zhì)的定量方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和樣品 二甲基亞砜(DMSO)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、福氏完全佐劑及福氏不完全佐劑、二硫蘇糖醇(DTT)購自Sigma公司。IPG 膠條、IPG Buffer、尿素(蛋白質(zhì)組學(xué)級)、硫脲(蛋白質(zhì)組學(xué)級)、碘乙酰胺(蛋白質(zhì)組學(xué)級)購自美國GE 公司；二硫蘇糖醇(DTT，蛋白質(zhì)組學(xué)級)、CHAPS(蛋白質(zhì)組學(xué)級)、考馬斯亮蘭R250(超純級)均為Amresco 分裝。其余試劑為國產(chǎn)分析純。ELISA反應(yīng)檢測用試液配制見冷泉港實驗室手冊[6]。

杏仁樣品采購于深圳農(nóng)批市場和超市，甜杏仁樣品產(chǎn)自河北省，苦杏仁樣品產(chǎn)自甘肅省。杏仁蛋白飲料隨機(jī)采購于深圳市場和網(wǎng)絡(luò)。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 酶標(biāo)儀為iMARK (BIORAD公司)，超聲破碎儀為Uibracell VCX750 (So-nics and Materials公司)，蛋白質(zhì)測定儀為Kjeltec 8400(Foss公司)，垂直電泳儀為Mini-PROTEAN Tetra Cell (BIORAD公司)，電聚焦儀為 EttanIPGphor 3(GE 公司)以及高速離心機(jī)、精密電子天平等常規(guī)儀器。

1.2 試驗方法

1.2.1 2-D電泳 將杏仁用液氮研磨粉碎，使用正己烷脫脂，用7 mol/L尿素按1∶10(m/V)超聲提取，提取液透析過夜脫鹽，凍干得杏仁蛋白粉。將蛋白粉通過裂解液裂解，使用7 cm 非線性pH值3～10固相IPG 膠條，上樣量100 μg。蛋白質(zhì)樣品采取被動水化方式進(jìn)膠，20 ℃放置12 h。等電聚焦程序如下：分步升壓：100 V、2 h，300 V、1 h，500 V、0.5 h；線性升壓：500～4 000 V、4 h；分步升壓：4 000 V、4 h。等電聚焦電泳結(jié)束后IPG膠條進(jìn)行平衡處理。平衡結(jié)束后膠條轉(zhuǎn)SDS電泳。使用4%濃縮膠和10%分離膠。電泳條件為30 V恒壓預(yù)電泳30 min，隨即升壓至60 V 恒壓電泳2～3 h 。電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍(lán)染色法染色。凝膠用Umax Powerlook 2100 XL 掃描后保存。目標(biāo)蛋白質(zhì)點挖膠送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行MALDI-TOFTOF/MS鑒定。

1.2.2 抗體的制備 目標(biāo)杏仁抗原40 ku prunin亞基采用本課題組報道的切膠回收方法進(jìn)行分離純化[5]。將抗原皮下免疫Balb/c小鼠，每只劑量0.1 mL。單克隆抗體制備參考冷泉港實驗室手冊的方法進(jìn)行[6]。

1.2.3 ELISA標(biāo)準(zhǔn)品的制備 杏仁于40 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥48 h后，使用錘式旋風(fēng)磨進(jìn)行細(xì)粉碎，使90%以上通過0.3 mm空間篩網(wǎng)。稱取杏仁粉10 g，于40 ℃恒溫條件下，使用1 000 mL蒸餾水，分5次超聲提取杏仁蛋白質(zhì),每次提取時間為1 h。5次提取的提取液合并后使用GB 5009.5—2010 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中規(guī)定的凱氏定氮法測定可溶蛋白含量[7]。使用含0.07 mol/L尿素、0.001% DTT的PBS配制成400、200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.4 競爭ELISA操作 每孔加包被液100 μL 4 ℃孵育過夜。第2天倒掉包被液,用洗滌液洗1遍，每孔再加200 μL封閉液，37 ℃孵育3 h，倒掉封閉液。每孔加50 μL酶標(biāo)單克隆抗體和50 μL樣品(或為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液)，陰性對照孔用PBS代替。37 ℃反應(yīng)0.5 h，然后用PBST洗3次。每孔加100 μL酶標(biāo)羊抗小鼠二抗。37 ℃反應(yīng)0.5 h，然后用PBST洗3次。加底物液100 μL，37 ℃反應(yīng)10 min，用H2SO4終止反應(yīng),酶標(biāo)儀讀數(shù)。以杏仁蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，B/B0為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(B為樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，B0為空白溶液的吸光度值)。使用Origin 7.5 四參數(shù)擬合計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50。同時，采用棋盤法試驗優(yōu)化包被抗原和酶標(biāo)抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

1.2.5 ELISA檢測抗體特異性 采用1.2.4所述的提取方法提取其他植物或食品中常見的可溶蛋白，采用競爭ELISA檢測抗體與其之間的交叉反應(yīng)。

1.2.6 檢測樣品的前處理 杏仁飲料按1︰1加入含0.2%DTT的12 mol/L尿素。超聲提取10 min后離心。上清液使用0.01 mol/L pH值7.4的PBS適當(dāng)稀釋至ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍(為避免變性劑和還原劑對ELISA的影響，至少需稀釋100倍)。

1.2.7 杏仁蛋白飲料的模擬加工 杏仁的模擬熱加工工藝參考張彩等[8]的報道。杏仁采用蒸餾水勻漿1 h，加入8%蔗糖、0.08%單甘油脂肪酸酯、0.12%蔗糖脂肪酸酯、0.04%黃原膠、0.05%海藻酸鈉。繼續(xù)勻漿1 h后，3 000 r/min離心10 min，保留上清，分別采用巴氏殺菌(65 ℃、30 min)、超高溫滅菌(137 ℃、4 s)、高壓滅菌(121 ℃、15 min)進(jìn)行熱加工，采用1.2.6 所述的前處理方法和1.2.4建立的ELISA方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏仁的蛋白組比較

確定物種蛋白的定量標(biāo)志物是物種蛋白定量的關(guān)鍵。該定量標(biāo)志物必須為穩(wěn)定存在于該物種中的宏量蛋白。Femenia曾對苦杏仁和甜杏仁的脂肪酸、糖類和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測，指出兩者脂肪酸和糖類的含量相差較大，而蛋白質(zhì)的含量無顯著差異[9]。因此，本研究采用2-D電泳對這2種杏仁蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，圖1-A為甜杏仁蛋白質(zhì)2-D電泳圖譜，圖1-B為苦杏仁蛋白質(zhì)2-D電泳圖譜。圖1所示，甜杏仁和苦杏仁的蛋白質(zhì)共同分布在5個區(qū)域(圖中標(biāo)注為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)，2-D電泳圖譜無明顯差異。本研究對上述5個區(qū)域的蛋白質(zhì)點進(jìn)行MALDI-TOF/ MS鑒定。將蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的匹配結(jié)果結(jié)合分子量分析發(fā)現(xiàn)，這5個蛋白區(qū)域分別為Pru-1的α鏈、Pru-2的α鏈、Pru-1的β鏈、Pru-2的β鏈，完整的Pru-1(α鏈與β鏈未斷裂)，說明杏仁的宏量蛋白為同屬于Prunin蛋白家族的Pru-1和Pru-2。從含量上分析，這2個蛋白質(zhì)占杏仁總蛋白質(zhì)的80%以上，Pru-1與Pru-2的比例大約為3︰2?；诹可系目紤]，本研究選用更為宏量的Pru-1作為目標(biāo)抗原，并通過切膠回收，分離純化了其40 ku的α鏈。

2.2 ELISA方法的評估結(jié)果

抗體的特異性是ELISA方法的重要指標(biāo)之一。有報道指出，抗Prunin蛋白多抗會與玉米的50 ku γ-玉米膠蛋白(zein)和羽扇豆(Lupinusalbus)的7α-球蛋白(α-conglutin)發(fā)生交叉反應(yīng)[10-11]，而這2種植物均可作為植物蛋白飲料的配料。因此為確保特異性，本研究制備了抗杏仁Pru-1的單克隆抗體。將此抗體和杏仁蛋白質(zhì)進(jìn)行2-D Western-blot。如圖2所示，該抗體只識別Pru-1的α鏈。利用該抗體建立了檢測杏仁蛋白質(zhì)的ELISA方法。圖3所示，該ELISA方法的IC50為19.6 μg/mL，線性范圍為5.0～100 μg/mL(R2=0.990)。表1表明該方法特異性良好，抗體與包括羽扇豆和玉米在內(nèi)的其他種子蛋白和乳蛋白均無交叉反應(yīng)。

圖1 甜杏仁和苦杏仁蛋白質(zhì)的2-D電泳圖譜

圖2 杏仁蛋白質(zhì)的2-D Western blot圖譜

圖3 杏仁蛋白質(zhì)的ELISA競爭曲線

反應(yīng)物IC50/(μg/mL)交叉反應(yīng)率/%反應(yīng)物IC50/(μg/mL)交叉反應(yīng)率/%大豆可溶蛋白>2000<1．0腰果可溶蛋白>2000<1．0豌豆可溶蛋白>2000<1．0榛子可溶蛋白>2000<1．0紅豆可溶蛋白>2000<1．0核桃可溶蛋白>2000<1．0綠豆可溶蛋白>2000<1．0花生可溶蛋白>2000<1．0羽扇豆可溶蛋白>2000<1．0玉米可溶蛋白>2000<1．0蕓豆可溶蛋白>2000<1．0α-乳白蛋白>2000<1．0椰子可溶蛋白>2000<1．0β-乳球蛋白>2000<1．0蓮子可溶蛋白>2000<1．0酪蛋白>2000<1．0

2.3 熱加工對杏仁蛋白質(zhì)定量的影響

本研究模擬杏仁蛋白飲料的加工工藝考察了3種殺菌方式對蛋白質(zhì)含量測定的影響?；谒⒌腅LISA方法，將加熱前杏仁蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為10 mg/mL的杏仁蛋白乳飲料，分別采用巴氏殺菌、超高溫瞬時滅菌、高壓滅菌后，杏仁蛋白質(zhì)的檢測值分別為9.6、9.2、8.1 mg/mL，回收率分別為96%、92%、81%。以上結(jié)果說明，本研究可較為準(zhǔn)確地測定超高溫瞬時滅菌的杏仁露中杏仁蛋白質(zhì)含量，但是高溫長時間的熱加工仍會對本方法產(chǎn)生一定影響。由于劇烈熱加工同樣不利于杏仁蛋白飲料的穩(wěn)定，越來越多的企業(yè)使用超高溫瞬時滅菌法替代傳統(tǒng)的高壓滅菌工藝。

2.4 實際樣品檢測結(jié)果

本研究從深圳和網(wǎng)絡(luò)隨機(jī)購買杏仁蛋白飲料5份，采用所建立的ELISA方法和國標(biāo)GB 5009.5—2010規(guī)定的凱氏定氮法進(jìn)行檢測[7]。以10個不含杏仁成分的植物蛋白飲料的測定結(jié)果平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為方法檢出限，檢出限為0.6 mg/mL。所有非杏仁蛋白飲料的杏仁蛋白質(zhì)定量結(jié)果均為未檢出，未見假陽性，所有明示為杏仁蛋白飲料的樣品均檢出杏仁(表2)，平行樣品間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<10%。1、2、3、5號杏仁露的杏仁蛋白質(zhì)測定結(jié)果和凱氏定氮法的結(jié)果較為接近，但4號樣品差距較大。雖然其配料表標(biāo)注含有牛奶和花生，但是作為杏仁蛋白飲料，以大量的牛奶和花生蛋白質(zhì)提高蛋白質(zhì)含量，有誤導(dǎo)消費者的嫌疑。

表2 市售杏仁露樣品中杏仁蛋白質(zhì)含量檢測結(jié)果(n=6) mg/mL

3 結(jié)論與討論

熱加工蛋白質(zhì)的定量一直以來就是免疫學(xué)定量的難題。由于蛋白質(zhì)在熱加工中會發(fā)生變性、水解、聚集等作用，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的沉淀和抗原決定簇的破壞，嚴(yán)重影響到定量的準(zhǔn)確性。馮郁藺等[12]通過差示量熱掃描法測得的杏仁蛋白質(zhì)變性溫度為94 ℃。張美枝等[13]報道，杏仁蛋白質(zhì)在40 ℃時達(dá)到溶解度峰值，之后隨溫度升高溶解度顯著下降，蛋白質(zhì)易聚集沉淀。為避免杏仁熱加工的蛋白質(zhì)沉淀，杏仁蛋白飲料加工時一般需加入多種乳化劑維持產(chǎn)品的均相狀態(tài)。然而，部分變性蛋白質(zhì)只是以膠束狀態(tài)存在，并不能被抗體識別。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，使用含0.1%DTT的7 mol/L尿素能顯著提高變性蛋白質(zhì)的溶解度[14]，并且能將不同變性程度的蛋白質(zhì)還原為較為統(tǒng)一的狀態(tài)，以同樣經(jīng)過變性處理的標(biāo)準(zhǔn)品，可以獲得更準(zhǔn)確的定量結(jié)果。另外，ELISA的反應(yīng)模式也和定量的準(zhǔn)確性密切相關(guān)。在熱加工蛋白質(zhì)定量上，采用競爭ELISA法比傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)檢測模式——雙抗夾心ELISA更為準(zhǔn)確。在ELISA方法中，雙抗夾心法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)檢測免疫反應(yīng)模式，該方法以一個包被在酶標(biāo)板的抗體捕獲抗原，另一帶標(biāo)記的抗體再結(jié)合抗原的第2個決定簇，具有特異性高、反應(yīng)靈敏等優(yōu)勢。然而熱處理會使部分蛋白質(zhì)水解，從而導(dǎo)致抗原的2個決定簇解離，喪失結(jié)合雙抗體的能力。競爭法中1個抗原分子只結(jié)合1個抗體，即使被水解，只要抗原決定簇不受破壞仍然可被抗體識別，可以較好地應(yīng)用于熱處理蛋白質(zhì)的檢測。雖然競爭法不如雙抗夾心法靈敏，但是植物蛋白飲料中杏仁Prunin是宏量蛋白，一般為1～10 mg/mL，因此在方法的選用上對靈敏度的要求不苛刻，主要考慮結(jié)果的準(zhǔn)確性。

食品中選用的配料及用量和其價值具有顯著關(guān)系。一些不法商販往往采用低價值的蛋白質(zhì)摻入高價值的蛋白質(zhì)制品，如在燕窩和雪蛤中使用明膠增加質(zhì)量。這不僅損害了消費者的利益，還可能因為加工過程中為掩蓋添加而非法使用添加劑，威脅到食品安全。由于對特定蛋白質(zhì)定量上的困難，這種無秩序的添加行為一直是監(jiān)管上的盲區(qū)。杏仁蛋白飲料的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2438—2006《植物蛋白飲料 杏仁露》中規(guī)定，棕櫚烯酸占總脂肪酸的百分比≥0.7%，花生酸和亞麻酸之和占總脂肪酸的百分比≤0.25%，其本意即為控制在杏仁蛋白飲料中過度使用其他植物蛋白質(zhì)原料(如花生和大豆)。但是部分廠商可能以脫脂的花生蛋白粉或大豆蛋白粉規(guī)避現(xiàn)有產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的監(jiān)測。因此，杏仁蛋白質(zhì)定量方法是一種更為根本的監(jiān)控產(chǎn)品中杏仁蛋白質(zhì)含量的技術(shù)手段。本研究以杏仁蛋白質(zhì)為研究對象，采用高特異性杏仁Pru-1蛋白單克隆抗體結(jié)合變性劑進(jìn)行前處理，能較準(zhǔn)確地檢測杏仁蛋白飲料中的杏仁蛋白質(zhì)，同時也為核桃乳、即食雪蛤罐頭等蛋白飲品中蛋白質(zhì)的特異性定量探索了可行的技術(shù)路線。

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Quantitation of Apricot Kernel Protein in Apricot Kernel Protein Beverage Based on Immunoassay

ZHANG Shiwei1,LAI Xintian1*,WANG Shifeng1,HUANG Jingmin1,FENG Ronghu1,TAN Guiliang2,LIU Yao2,YANG Guowu1
(1.Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection,Shenzhen 518102,China; 2.Zhongshan Supervision Testing Institute of Quality & Metrology,Zhongshan 528403,China)

The aim of the research was to develop the quantitation method of apricot kernel protein in apricot kernel protein beverage based on competitive enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).We applied two-dimensional electrophoresis and MALDI-TOF/MS to identify the high-abundant protein in apricot kernel. Pru-1 subunit α-chain with a mass of 40 ku was purified and used as antigen to prepare a specific monoclonal antibody. Using the monoclonal antibody and apricot kernel soluble protein as standard,an optimized ELISA method was established linear detection range of 5.0 to 100 μg/mL(R2=0.990). The assay did not register cross-reactivity with other edible plant seeds. The limit of detection(LOD) was 0.6 mg/mL for apricot kernel protein beverage,with relative standard deviation less than 10%.The average recovery rates were 96%,92% and 81% under the sterilization condition of pasteurization,ultra high temperature treated and autoclaved sterilization,respectively.

apricot kernel; protein beverage; enzyme linked immunosorbent assay; quantitation

2015-10-13

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2013QK274);廣東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技計劃項目(2013CZ05)

張世偉(1985-)，男，江西新余人，高級工程師，碩士，主要從事食品質(zhì)量安全研究。E-mail：zsw_8506@163.com

*通訊作者：賴心田(1975-)，男，福建龍巖人，高級工程師，博士，主要從事食品質(zhì)量安全研究。E-mail:lxintian@163.com

TS27

A

1004-3268(2016)04-0145-05