二倍體矮牽?；ǚ勰讣?xì)胞異常減數(shù)分裂的觀察與核型分析

魏 躍，蔡善亞，董 慧，史紅林，嵇 怡

(1 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212400；2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，南京 210095)

?

二倍體矮牽?；ǚ勰讣?xì)胞異常減數(shù)分裂的觀察與核型分析

魏 躍1,2，蔡善亞1，董 慧1，史紅林1，嵇 怡1

(1 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212400；2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，南京 210095)

以夏季高溫時(shí)期二倍體矮牽?；ɡ贋椴牧?，采用常規(guī)制片法，對(duì)花粉母細(xì)胞異常減數(shù)分裂進(jìn)行觀察并選取終變期進(jìn)行染色體核型分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):異常減數(shù)分裂主要表現(xiàn)為具有多核仁、二價(jià)體提前分離成單價(jià)體、赤道板外的染色體，姊妹染色單體提前分離、不均等分離，落后和丟失染色體，具有微核的三分體和四分體，中期Ⅱ紡錘體定位發(fā)生異常出現(xiàn)融合紡錘體和八字形紡錘體可導(dǎo)致2n花粉產(chǎn)生；矮牽牛終變期核型公式為K(2n)=2x=14=10m+4sm(2SAT)，其中第1、4、5、6、7號(hào)為中部著絲粒染色體，第2號(hào)(具有隨體)、3號(hào)為亞中部著絲粒染色體，染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為 2n=14=4M1+10M2，核型分類為2A型。研究表明，矮牽牛異常減數(shù)分裂可導(dǎo)致2n花粉和不育花粉的產(chǎn)生，利用終變期進(jìn)行核型分析具有材料豐富、二價(jià)體形態(tài)清晰不需人為配對(duì)分析等優(yōu)點(diǎn)，為矮牽牛細(xì)胞學(xué)研究提供了新方法。

矮牽牛；花粉母細(xì)胞；減數(shù)分裂；2n花粉；核型分析

矮牽牛(PetuniahybridaVilm.)又名碧冬茄、撞羽朝顏和靈芝牡丹，為茄科矮牽牛屬一年生草本花卉，性喜溫暖多在夏秋季開花，花色艷麗多姿花期長(zhǎng)具有較高觀賞價(jià)值，廣泛應(yīng)用于廣場(chǎng)、庭院和露天花壇等的美化裝飾與綠化，被喻為“世界花壇花卉之王”。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)研究人員對(duì)矮牽牛開展了遺傳多樣性[1]、組織培養(yǎng)[2]、多倍體[3]、基因克隆[4]和遺傳轉(zhuǎn)化[5]等方面研究，但對(duì)其細(xì)胞學(xué)研究相對(duì)較少，僅有蔡華等[6]利用根尖進(jìn)行了核型分析并證實(shí)二倍體矮牽牛染色體數(shù)目為2n=14，魏躍等[7-8]也對(duì)二、四倍體矮牽?；ǚ勰讣?xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程進(jìn)行過(guò)初步細(xì)胞學(xué)觀察。夏季高溫會(huì)降低花粉育性，研究表明小麥[9]、百合[10]不育花粉形成與花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂小孢子和雄配子發(fā)育異常有關(guān)，但目前矮牽牛還沒有相關(guān)研究；未減數(shù)分裂配子即2n配子的發(fā)生在植物界是較普遍的現(xiàn)象，據(jù)Veilleux[11]統(tǒng)計(jì)已在13個(gè)科85個(gè)種或種間雜種中發(fā)現(xiàn)過(guò)2n配子的產(chǎn)生，國(guó)內(nèi)學(xué)者在大白菜[12]、小白菜[13]、草莓[14]和甜柿[15]等作物中都發(fā)現(xiàn)了自然產(chǎn)生的2n配子并對(duì)形成的細(xì)胞學(xué)機(jī)制進(jìn)行了研究，但目前矮牽牛也沒有類似研究報(bào)道。

本研究以夏季高溫時(shí)期二倍體矮牽?；ɡ贋椴牧?，對(duì)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的異?，F(xiàn)象進(jìn)行觀察和分析，并對(duì)終變期染色體進(jìn)行核型分析，試圖從細(xì)胞學(xué)角度闡明不育花粉和2n配子形成的機(jī)制。該研究為矮牽牛2n配子的遺傳研究和有性多倍化育種應(yīng)用奠定細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，相關(guān)的核型分析對(duì)研究矮牽牛演化與分類、與其它物種的親緣關(guān)系、遠(yuǎn)源雜交及遺傳工程中染色體鑒別具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料為栽培廣泛的二倍體矮牽牛品種‘夢(mèng)幻’，購(gòu)自浙江虹越花卉有限公司,在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝試驗(yàn)基地塑料大棚進(jìn)行栽培，2014年4月6日穴盤播種、5月2日移入育苗缽、5月24日移入直徑20 cm塑料花盆，6月14日進(jìn)入始花期。

1. 2 方 法

1.2.1 不育花粉和2n配子的觀察統(tǒng)計(jì) 分別于6～7月連續(xù)陰雨天(白天溫度22～25 ℃)、7月連續(xù)高溫天(白天33～36 ℃)的早上11:00～12:00時(shí)，取矮牽牛花粉粒于載玻片上，參考李潤(rùn)芳等[16]方法用1%醋酸洋紅染色5 min 后，在光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)可育花粉(染色深、大小正常、外形圓的)和不育花粉(不染色或染色淺、外形皺縮畸形)數(shù)目。不育花粉率=不育花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%。根據(jù)花粉直徑大小[17]確認(rèn)2n花粉。在顯微鏡下用顯微測(cè)微尺測(cè)量花粉的直徑并統(tǒng)計(jì)2n花粉數(shù)，2n花粉百分率=2n花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%。

1.2.2 減數(shù)分裂觀察方法 晴天上午8:00至11:00每隔1 h取矮牽牛的幼小花蕾，用卡諾氏固定液(無(wú)水乙醇∶冰醋酸體積比為3∶1)固定24 h后，經(jīng)90%、80%乙醇梯度脫水最后轉(zhuǎn)入70%乙醇4 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｓ? mol/L鹽酸60 ℃恒溫水浴花蕾約2～3 min，蒸餾水沖洗3～4次，從花蕾中剝?nèi)』ㄋ帲?%醋酸洋紅染色常規(guī)染色、壓片，火焰拷片2 s分色[18]，在德國(guó)ZEISS.Imager.A1光學(xué)顯微鏡鏡檢并照相。

1.2.3 核型分析方法 分別取50個(gè)分散良好、著絲點(diǎn)清晰的終變期分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，從中分別選取5個(gè)染色體完整、形態(tài)與著絲點(diǎn)清晰的分裂相拍照。利用Photoshop軟件進(jìn)行染色體圖像處理分析，染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)按Kuo等[19]的方法劃分，染色體相對(duì)長(zhǎng)度(某染色體的長(zhǎng)度/全組染色體平均長(zhǎng)度×100%)、臂比、著絲粒指數(shù)、著絲粒位置及類型按照Levan等[20]的方法計(jì)算分類，核型分析采用李懋學(xué)等[21]制定的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)Arano[22]的方法計(jì)算染色體不對(duì)稱系數(shù)(染色體長(zhǎng)臂總長(zhǎng)度/染色體組總長(zhǎng)度×100%)，核型分類參照Stebbins[23]的分類標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉粒育性統(tǒng)計(jì)

7月連續(xù)高溫時(shí)期隨機(jī)取樣共觀察統(tǒng)計(jì)了570個(gè)成熟花粉粒，其中不染色或染色淺、外形皺縮畸形的花粉粒為不育花粉(圖1，A)，不育花粉粒82個(gè)不育率為14.39%；6～7月連續(xù)陰雨天共觀察統(tǒng)計(jì)了620個(gè)成熟花粉粒，不育花粉29個(gè)，不育花粉率為4.68%，可見高溫可導(dǎo)致矮牽牛產(chǎn)生較多不育花粉。

2.2 2n花粉統(tǒng)計(jì)

花粉直徑大小通常被作為未減數(shù)花粉的一個(gè)判斷依據(jù)[17]，隨機(jī)取樣共觀察530個(gè)成熟花粉粒，發(fā)現(xiàn)二倍體矮牽牛存在著少量的2n花粉(圖1，B)，未減數(shù)2n花粉的平均直徑為(40.1±2) μm，減數(shù)n花粉平均直徑約為(30.2±3) μm，未減數(shù)花粉的平均直徑約為減數(shù)花粉的1.33倍，2n花粉直徑明顯大于減數(shù)n花粉，經(jīng)統(tǒng)計(jì)2n花粉百分率為1.51%。

2.3 減數(shù)分裂適宜取樣期

為確定適宜的減數(shù)分裂取樣時(shí)期，在晴天上午8:00至11:00每隔1 h取樣，每個(gè)時(shí)間段均制30個(gè)片子進(jìn)行觀察。表1表明早9點(diǎn)左右分裂相最多平均每個(gè)制片可達(dá)16.2個(gè)，此時(shí)氣溫約為25～29 ℃比較適宜減數(shù)分裂、花粉母細(xì)胞處于分裂旺盛期為最佳取樣期；11點(diǎn)取樣制片中的分裂相最少降低為8.1個(gè)，減數(shù)分裂活動(dòng)的降低可能與此時(shí)溫度過(guò)高達(dá)到30～35 ℃有關(guān)。

2.4 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察

二倍體矮牽牛花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程基本正常符合二倍體植物減數(shù)分裂的規(guī)律，但也有一些異常行為，其動(dòng)態(tài)特征如下：

A.敗育花粉粒(箭頭示)；B.2n花粉粒(箭頭示)圖1 花粉(×210)A. Aborted pollen grains (arrow showing); B. 2n pollen grains (arrow showing)Fig.1 Pollen(×210)

取樣時(shí)間Samplingtime單個(gè)制片減數(shù)分裂相數(shù)Numberofmeiosiseveryslide8：0013．79：0016．210：0010．511：008．1

前期Ⅰ：除了具有一個(gè)正常核仁(圖2，A)，還可觀察到核內(nèi)具有雙核仁(圖2，B)。終變期大多數(shù)細(xì)胞核內(nèi)分布著7個(gè)同源配對(duì)的棒狀或環(huán)狀二價(jià)體，也觀察到少數(shù)二價(jià)體結(jié)合不緊密甚至提前分離成二個(gè)單價(jià)體(圖2，C～D)，異常比率為3.63%。

中期Ⅰ：配對(duì)的二價(jià)體排列于赤道板上，大多數(shù)二價(jià)體能同步分離，也有少數(shù)比率為5.51%的細(xì)胞出現(xiàn)二價(jià)體分離延遲(圖2，E)。

后期Ⅰ：同源染色體被紡錘絲均等牽引拉向兩極，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)落后染色體(圖2，F(xiàn))。在后期Ⅰ拉向極區(qū)染色體的1對(duì)姊妹染色單體一般不分離，只有少數(shù)細(xì)胞中1～2對(duì)姊妹染色單體提前發(fā)生分離(圖2，G～K)。其中2對(duì)姊妹染色單體有2∶2均等分離(圖2，G)，還有1∶3不均等分離(圖2，H)；1對(duì)姊妹染色單體除在同極發(fā)生分離(圖2，Ⅰ)，還有其中一染色單體反向牽引至另一極(圖2，J)或滯留在主核外成為丟失染色體(圖2，K) 這將導(dǎo)致不均等分離，后期Ⅰ異常比率統(tǒng)計(jì)為4.79%。后期Ⅰ中產(chǎn)生的落后、丟失和核外滯留染色體將導(dǎo)致四分體時(shí)期產(chǎn)生微核[16]，染色體不均等分離則導(dǎo)致各種非整倍體配子形成[24]。

中期Ⅱ：此期有5.37%的細(xì)胞含有排列在赤道板外的染色體(圖2，L)，2個(gè)紡錘體因角度和相距程度不同，表現(xiàn)為4種形式：平行紡錘體(圖2，L)、融合紡錘體(圖2，M) 、八字形紡錘體(圖2，N)和垂直紡錘體(圖2，O)。

中期Ⅱ融合紡錘體的二組染色體彼此非?？拷?圖2，M)，末期Ⅱ時(shí)整個(gè)花粉母細(xì)胞內(nèi)的4個(gè)子核呈二極分布每一極含雙核，隨后的四分體胞質(zhì)分裂只形成1個(gè)分裂溝形成二分體(圖2，P)實(shí)現(xiàn)了核重組，最終發(fā)育成2個(gè)2n花粉。如有落后或丟失染色體，則形成微核、1個(gè)非整倍體配子和1個(gè)2n配子(圖2，Q)。

中期Ⅱ八字形紡錘體(圖2，N)在后期Ⅱ分離的四組染色體將可能只牽引至三極，其中一極由于二組染色體融合，染色體數(shù)目為n=2x=14，而另兩極各包含有1組染色體(圖2，R)。四分體時(shí)期胞質(zhì)分裂將形成三分體(圖2，S)，最終發(fā)育成1個(gè)2n花粉和2個(gè)n花粉。在觀察到的四種形式的紡錘體中，以平行紡錘體和垂直紡錘體最為普遍，二者比率約合為87.3%，而融合紡錘體、八字形紡錘體比率之和為12.7%。

后期Ⅱ：多數(shù)細(xì)胞中姊妹染色單體正常分離移向兩極，約有比率為7.75%細(xì)胞中出現(xiàn)落后染色體(圖2，T)。

A～B.終變期(A.單核仁，B.雙核仁)；C～D.終變期(單箭頭示二價(jià)體提前分離成2個(gè)單價(jià)體，雙箭示隨體)；E.中期Ⅰ；F.后期Ⅰ；G.后期Ⅰ(箭頭示2對(duì)姊妹染色單體2∶2均等分離)；H.后期Ⅰ(箭頭示2對(duì)姊妹染色單體3:1不均等分離)；I.后期Ⅰ(箭頭示1對(duì)姊妹染色單體分離)；J.后期Ⅰ(單箭頭示染色體留在主核內(nèi)，雙箭頭示反向牽引染色體)；K.后期Ⅰ(單箭頭示染色體滯留在主核外，雙箭頭示反向牽引染色體)； L.中期Ⅱ，平行紡錘體；M.融合紡錘體；N.八字形紡錘體；O.后期Ⅱ,垂直紡錘體；P.二分體；Q.1個(gè)微核+二分體；R.后期Ⅱ，兩極染色體融合；S.三分體；T.后期Ⅱ；U.四分體(左右對(duì)稱型)；V.四分體(四面體型)；W.1個(gè)微核+四分體；X.2個(gè)微核+四分體；圖2 矮牽?；ǚ勰讣?xì)胞減數(shù)分裂(×1300)A-B.Diakinesis(1.mononucleolus,2.binucleolus);C-D.Diakinesis(single arrowhead indicated bivalent dividing into two univalent in advance, double arrowhead indicated satellite); E.Metaphase Ⅰ;F.Anaphase I;G.Anaphase Ⅰ(arrowhead indicated 2:2 equational division of two pairs of sister chromatids);H.Anaphase Ⅰ(arrowhead indicated 3:1 unequal division of two pairs of sister chromatids);I.Anaphase Ⅰ(arrowhead indicated one pairs of sister chromatids dividing);J.Anaphase Ⅰ(single arrowhead indicated chromosome staying outside of the main nucleus, double arrowhead indicated reverse moving chromosome);K.Anaphase Ⅰ(single arrowhead indicated chromosome staying outside of the main nucleus, double arrowhead indicated reverse moving chromosome);L.Metaphase Ⅱ, parallel spindle; M.Fusing spindle; N.Tripolar spindle;O. Anaphase Ⅱ,Vertical spindle; P.Dyad; Q.Dyad with one micronuclei;R.Anaphase Ⅱ,Chromosomes of two polars converging; S.Triad;T. Anaphase Ⅱ;U.Tetrad(isobilateral);V.Tetrad(tetrahedral);W.Tetrad with one micronuclei;X.Tetrad with two micronucleiFig.2 Meiosis of pollen mother cells in petunia (×1 300)

四分體時(shí)期：大多數(shù)為正常四分體，主要為左右對(duì)稱型(圖2，U)和四面體型(圖2，V)。由于落后或丟失染色體往往導(dǎo)致微核形成，觀察到少數(shù)具有1～2個(gè)微核的四分體(圖2，W～X)和1個(gè)微核的二分體(圖2，Q)；由于紡錘體的異常定位使后期Ⅱ的染色體牽引和末期Ⅱ的核排布方式改變，從而形成二分體(圖2，P)和三分體(圖2，S)。四分體時(shí)期各種異常比率總和為8.0%。

對(duì)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂6個(gè)時(shí)期百分率進(jìn)行平均，每個(gè)時(shí)期約有5.84%的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂表現(xiàn)異常(表2)。

2.5 減數(shù)分裂終變期染色體的核型分析

二倍體矮牽牛終變期核型分析的染色體數(shù)為7對(duì)二價(jià)體，未觀察到非整倍性變異現(xiàn)象，證實(shí)了二價(jià)體矮牽牛2n=2x=14，同時(shí)發(fā)現(xiàn)2號(hào)染色體具有隨體(圖2,C～D)，這與Smith等[25]報(bào)道一致。

核型參數(shù)值見表3，終變期1～7號(hào)染色體絕對(duì)長(zhǎng)度的變化范圍在3.04～4.30 μm之間，相對(duì)長(zhǎng)度的變化范圍在12.27%～17.34%之間，相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)(某染色體長(zhǎng)度/染色體組的平均長(zhǎng)度)[19]，在0.86～1.22之間，其中第1、2對(duì)為中長(zhǎng)染色體(M1)，第3～7對(duì)為中短染色體(M2)。臂比(長(zhǎng)臂/短臂)變化范圍為1.04～2.48，著絲粒指數(shù)為28.74%～49.02%，著絲粒位置為中部著絲粒m和亞中部著絲粒sm，其中第1、4、5、6、7號(hào)為中部著絲粒染色體(m)，第2、3號(hào)為亞中部著絲粒染色體(sm)。

表2 減數(shù)分裂各時(shí)期染色體行為異常的花粉母細(xì)胞百分率

表3 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂終變期的核型參數(shù)

注：＊表示具有隨體

Note：＊indicate satellite

表4 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂終變期的核型分析

圖3 減數(shù)分裂終變期分裂相及其核型圖(×2 000)Fig.3 Diakinesis chromosomes and karyotype(×2 000)

圖4 減數(shù)分裂終變期染色體核型模式Fig.4 Idiogram of diakinesis chromosomes

表4顯示，矮牽牛終變期核型公式為K(2n)=2x=14=10m+4sm(2SAT)，染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為 2n=14=4M1+10M2。染色體長(zhǎng)度比(最長(zhǎng)/最短)比值為1.41，臂比大于2的染色體比例為14.29%，不對(duì)稱系數(shù)為58.88%，為較對(duì)稱類型，按照Stebbins[23]核型分類標(biāo)準(zhǔn)，矮牽牛核型分類均為2A型，屬于較原始類型。減數(shù)分裂終變期分裂相及核型圖見圖3，染色體核型模式見圖4。

3 討 論

通過(guò)觀察二倍體矮牽?；ǚ勰讣?xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程，發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂過(guò)程中各時(shí)期絕大多數(shù)花粉母細(xì)胞的分裂行為正常，只有5.84%細(xì)胞表現(xiàn)減數(shù)分裂異常，主要表現(xiàn)為具有多核仁、二價(jià)體提前分離成單價(jià)體、赤道板外的染色體，姊妹染色單體提前分離、不均等分離，落后染色體、丟失染色體，具有微核的二、三分體和四分體。本試驗(yàn)中夏季高溫矮牽?；ǚ鄄挥蔬_(dá)到14.39%，大于花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂平均異常率5.84%，這表明高溫可能還導(dǎo)致雄配子體發(fā)育異常率升高、致使不育花粉進(jìn)一步增加[10]，這還需要試驗(yàn)證實(shí)。

羅雙霞等[26]觀察到大白菜2n-1單體在減數(shù)分裂后期Ⅰ單體染色體的姊妹染色體有提前分離現(xiàn)象，軒淑欣等[27]觀察到同源四倍體結(jié)球甘藍(lán)減數(shù)分裂的終變期、中期Ⅰ出現(xiàn)單價(jià)體，后期Ⅰ出現(xiàn)提前解離的姊妹染色單體，認(rèn)為這導(dǎo)致四倍體結(jié)球甘藍(lán)遺傳不穩(wěn)定、結(jié)實(shí)性較差。本試驗(yàn)中矮牽牛終變期也出現(xiàn)少數(shù)二價(jià)體結(jié)合不緊密提前分離成單價(jià)體現(xiàn)象，與上述作物相同，后期Ⅰ姊妹染色體提前分離與前期Ⅰ單價(jià)體提前形成有很大相關(guān)性，容易導(dǎo)致染色體不均等分離和各種非整倍體雄配子的產(chǎn)生。分子細(xì)胞學(xué)研究已證明姊妹染色體的黏著是由黏著素介導(dǎo)的。當(dāng)細(xì)胞分裂至中后期過(guò)渡時(shí)，分離酶催化的酶解導(dǎo)致著絲點(diǎn)區(qū)域的黏著素蛋白質(zhì)環(huán)開環(huán)，使黏著素從染色體上解離，啟動(dòng)姊妹染色體的分離[28]。張新忠等[29]通過(guò)檢查辣椒小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂染色體行為，觀察到熱激或低溫處理影響聯(lián)會(huì)復(fù)合體的穩(wěn)定性，偶線期的花粉母細(xì)胞經(jīng)過(guò)熱激或低溫處理后聯(lián)會(huì)復(fù)合體的形成受到抑制形成FDR重組核，導(dǎo)致終變期二價(jià)體提前解體。在高溫逆境下，矮牽牛前期Ⅰ花粉母細(xì)胞的聯(lián)會(huì)復(fù)合體是否也提前發(fā)生分離、產(chǎn)生單價(jià)體與分離酶酶解離機(jī)制等還有待于進(jìn)一步研究。

根據(jù)遺傳效應(yīng)，可將2n配子分為FDR(first division restitution)和SDR(second division restitution)2種類型。FDR型配子具有每一對(duì)同源染色體的各1個(gè)染色單體，SDR型則擁有同源染色體其中一條染色體的2個(gè)姊妹染色單體，F(xiàn)DR型和SDR型配子各傳遞親本70%和40%的雜合性，F(xiàn)DR型配子的高度雜合性決定了其高效傳遞親本雜合性和上位性的能力，在育種中有較高的利用價(jià)值[30]。在大白菜[12]、小白菜[13]和草莓[14]等研究中，在減數(shù)分裂Ⅱ紡錘體定位發(fā)生異常、同源染色體發(fā)生再組合，形成的FDR型重組孢子含有整套親本染色體組中的所有非姊妹染色單體。本試驗(yàn)在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅱ觀察到平行、三極和融合紡錘體等類似紡錘體定位異?，F(xiàn)象導(dǎo)致重組2n配子形成，故矮牽牛2n花粉也應(yīng)屬于FDR型，在遺傳育種中具有較好的利用前景。

目前進(jìn)行核型分析主要有兩種方法, 一是對(duì)有絲分裂細(xì)胞(主要為根尖細(xì)胞)染色體進(jìn)行核型分析，二是對(duì)處于減數(shù)分裂染色體進(jìn)行核型分析，前人核型分析的研究報(bào)道絕大多數(shù)都是以根尖體細(xì)胞為材料，只有少量報(bào)道利用減數(shù)分裂進(jìn)行核型分析[31-32]。利用花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)行矮牽牛核型分析主要有2個(gè)優(yōu)點(diǎn)，第一矮牽牛是草本花卉花期長(zhǎng)開花多，確定花蕾大小形態(tài)特征后，可以容易獲得大量處于減數(shù)分裂的花粉母細(xì)胞，對(duì)植株生長(zhǎng)不會(huì)產(chǎn)生影響；而利用有絲分裂進(jìn)行核型分析，材料一般都為種子萌發(fā)后的根尖，材料稀少而且切取根尖對(duì)植株以后生長(zhǎng)不利，對(duì)于種子量較少的試驗(yàn)對(duì)象不適合。第二利用體細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行染色體核型分析時(shí)，需要對(duì)核內(nèi)染色體進(jìn)行逐一測(cè)量、比對(duì)配對(duì)，工作量較大而且配對(duì)容易發(fā)生錯(cuò)誤。而終變期被認(rèn)為是減數(shù)分裂過(guò)程中最理想的觀察染色體時(shí)期，此時(shí)二價(jià)體端化、染色單體分離收縮程度高、形態(tài)清晰，二價(jià)體之間排斥力使它們分散，便于觀察。二條同源染色體處于自然配對(duì)狀態(tài)，省去比對(duì)步驟避免人為配對(duì)錯(cuò)誤。

蔡華等[6]以矮牽牛有絲分裂中期根尖細(xì)胞為材料進(jìn)行核型分析，認(rèn)為第1、2、4、5、6號(hào)是中部著絲粒(m型)染色體，第3、7號(hào)為亞中部著絲粒(sm型)染色體，核型公式為2n=2x=14=10m+4sm，屬于“2B”型，全套染色體上均無(wú)隨體。而本研究表明矮牽牛第1、4、5、6、7對(duì)為中部著絲粒染色體(m型)，第2、3對(duì)為亞中部著絲粒(sm型)染色體，矮牽牛終變期核型公式雖也為2n=2x=14=10m+4sm(SAT)，但屬于“2A”型。本研究與蔡華對(duì)第2和第7號(hào)染色體核型有分歧，可能與減數(shù)分裂終變期和有絲分裂中期染色體的不同形態(tài)差異有關(guān)。Smith等[25]曾用熒光顯微鏡觀察矮牽牛單倍體根尖細(xì)胞的染色體，用熒光強(qiáng)度變化曲線研究了著絲粒位置和隨體，認(rèn)為第7號(hào)染色體臂比(長(zhǎng)臂/短臂)在1～1.22之間，2號(hào)染色體臂比1.7且具有隨體。本研究第7號(hào)染色體臂比為1.22，2號(hào)染色體臂為1.75且具有隨體，與Smith等[25]的結(jié)論較為接近。

[1] 吳志祥,聶京濤,曹 嫻,等. 利用ISSR對(duì)矮牽牛品種遺傳多樣性的聚類分析[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版),2012,30(3):36-44.

WU Z X,NIE J T,CAO X,etal.Cluster analysis of genetic diversity ofPetuniahybridaVilm by ISSR[J].JournalofShanghaiJiaotongUniversity(Agricultural Science),2012,30(3):36-44.

[2] 代色平,包滿珠.矮牽?；ㄋ幣囵B(yǎng)及植株再生研究[J].亞熱帶植物科學(xué),2003,32(2):55-57.

DAI S P, BAO M Z. The anther culture and plant regeneration ofPetuniahybrida[J].SubtropicalPlantScience,2003,32(2):55-57.

[3] 魏 躍,王開凍,李洪海,等.矮牽牛四倍體的誘導(dǎo)及其形態(tài)特征[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,3:125-127.

WEI Y,WANG K D, LI H H,etal. Induction and morphological characteristics of tetraploidPetuniahybridaVilm[J].JiangsuAgricultureofScience, 2007,3:125-127.

[4] 郭余龍,閆明旭,陳 君,等.矮牽牛PMADS9基因啟動(dòng)子的克隆及分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2011, 12(2): 275-280.

GUO Y L,YAN M X,CHEN J,etal. Cloning and characterization of thePMADS9 gene promoter from petunia[J].JournalofPlantGeneticResources, 2011,12(2): 275-280.

[5] 司愛君,祝建波,李吉蓮,等.F3′5′H基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2008,17(5):306-309,329.

SI A J,ZHU J B,LI J L,etal. Cloning and construction of plant expression vector and transformation ofFlavonoid-3′,5′-hydroxylasegene inPetuniahybrid[J].ActaAgriculturaeBoreali-OccidentalisSinica, 2008,17(5):306-309,329.

[6] 蔡 華,張 傳,王業(yè)精,等.觀賞花卉矮牽牛與野生牽?；ǖ娜旧w核型比較[J].生物學(xué)通報(bào),2006,41(4):49-50

CAI H,ZHANG C,WANG Y J,etal. Karyotypic comparison between of ornamental flowers of petunia and wild morning glory[J].BiologicalBulletin, 2006,41(4):49-50.

[7] 魏 躍,張蜀寧,隋益虎,等.同源四倍體矮牽?；ǚ勰讣?xì)胞減數(shù)分裂觀察[J].西北植物學(xué)報(bào),2008,28(9):1 742 -1 745.

WEI Y,ZHANG S N,SUI Y H,etal. Meiosis of pollen mother cells in autotetraploid petunia[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2008,28(9):1 742-1 745.

[8] 魏 躍,王開凍,張蜀寧.矮牽?；ǚ勰讣?xì)胞減數(shù)分裂和雄配子形成的觀察[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,9:79-81.

WEI Y, WANG K D, ZHANG S N. Studies on the meiosis of pollen mother cell and formation of male gametophyte in Petunia[J].HenanAgricultureofScience, 2007, 9:79-81.

[9] 蒙立穎,石曉藝,胡 甘,等.K型溫敏雄性不育小麥KTM3315A的鑒定及花粉敗育特點(diǎn)的初步分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,20(5):1-8.

MENG L Y,SHI X Y,HU G,etal.Identification and characteristics of KTM3315A，a thermo-sensitive male sterile line withAegilopskotschyicytoplasm [J].JournalofChinaAgriculturalUniversity, 2015,20(5):1-8.

[10] 李 雪,陳麗梅,杜 捷,等.蘭州百合小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂異?，F(xiàn)象的觀察[J].西北植物學(xué)報(bào),2003,23(10):1 796-1 799.

LI X,CHEN L M, DU J,etal. Observations on abnormal meiosis of pollen mother cells inLiliumdavidiivar.unicolor[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 2003,23(10):1 796-1 799.

[11] VELLLEUX R E. Diploid and polyploid gametes in crop plants[J].PlantBreedingReviews,1985,3:253-258.

[12] 張成合,申書興,劉學(xué)崛,等.三分體形成是大白菜2n雄配子發(fā)生的主要途徑[J].遺傳學(xué)報(bào), 1999,26(1):76-80.

ZHANG C H, SHEN S X, LIU X J,etal. Cytological studies of 2n gamete formation in Chinese cabbage(Brassicacamepastrisssp.pekinenssi)[J].ActaGeneticaSinica, 1999,26(1):76-80.

[13] 于旭紅,陳芳莉,張蜀寧,等.普通白菜未減數(shù)雄配子形成的細(xì)胞學(xué)機(jī)制[J].西北植物學(xué)報(bào),2010,30(9):1 799-1 803.

YU X H,CHEN F L,ZHANG S N,etal. Cytological mechanism of unreduced male gamete formation inBrassicacampestrisssp.chinensisMakino[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 2010,30(9):1 799-1 803.

[14] 時(shí)翠平,葛會(huì)波,張成合,等.草莓未減數(shù)配子形成的細(xì)胞學(xué)研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,35(10):1 260-1 263.

SHI C P,GE H B, ZHANG C H,etal. Cytological studies on unreduced gamete formation of strawberries(Fragaria) [J].ScientiaAgriculturaSinica, 2002,35(10):1 260-1 263.

[15] 唐仙英,羅正榮. 甜柿2n花粉形成的細(xì)胞學(xué)機(jī)理研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,35(5):585-588.

TANG X Y,LUO Z R.Cytology of 2n pollen formation in nonastringent persimmon [J].ScientiaAgriculturaSinica, 2002,35(5):585-588.

[16] 李潤(rùn)芳,呂 松,鄧瑞寧,等.薺菜的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及核型分析[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2008,30(4):506-510.

LI R F,Lü S, DENG R N,etal. Karyotype analysis and meiotic observations of pollen mother cells inCapsellabursa-pastorisL. Medick[J].ChineseJournalofOilCropSciences, 2008,30(4):506-510.

[17] OHKUMA T, TAO R, TAMURA M, SUGIURA A. Use of unreduced giant pollen to produce nonaploid persimmon[J].JournaloftheJapaneseSocietyforHorticulturalScience,1997,66(suppl.):134-135.

[18] 張蜀寧,張 偉,張紅梅.同源四倍體蘿卜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009, 32(1): 27-30.

ZHANG S N,ZHANG W,ZHANG H M.Meiosis of pollen mother cells in autotetraploid radish[J].JournalofNanjingAgriculturalUniversity, 2009, 32(1): 27-30.

[19] KUO S R,WANG T T,HUANG T C. Karyotype analysis of some formosam gymnosperms [J].Talwante, 1972, 17(1): 66-80.

[20] LEVAN A, FREDGA K, SAMDBERG A A. Nomenclacture for centromeric position on chromosomes [J].Hereditas, 1964, 52: 201-220.

[21] 李懋學(xué),陳瑞陽(yáng).關(guān)于植物核型分析的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題[J].武漢植物學(xué)研究,1985,3(4):297-302.

LI M X,CHEN R Y.A suggestion on the standardization of karyotype analysis in plants[J].JournalofWuhanBotanicalResearch, 1985,3(4):297-302.

[22] ARANO H. Cytological studies in subfamily Carduoideae (Compositae) of Japan IX [J].TheBotanicalMagazine(Tokyo),1963, 76(895):32-39.

[23] STEBBINS G L.Chromosomal Evolution in High Plants [M].London:Edward Amold Ltd., 1971: 87-90

[24] 申書興,侯喜林,張成合.利用小孢子培養(yǎng)創(chuàng)建大白菜初級(jí)三體的研究[J].園藝學(xué)報(bào), 2006,33(6):1 209-1 214.

SHEN S X, HOU X L, ZHANG C H. A study on obtain primary trisomics by the isolated microspore culture of autoetraploid chinese cabbage[J].ActaHorticulturaeSinica, 2006,33(6):1 209-1 214.

[25] SMITH F J, OUD J L, DEJONG J H. A standard karyogram ofPetuniahybridaHort[J].Genetica,1973,44(3): 474-484.

[26] 羅雙霞，陳雪平，申書興. 大白菜單體的鑒定及染色體行為研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2012,39(3):561-566.

LUO S X,CHEN X P,SHEN S X. Identification of several monosomics in Chinese cabbage and observation of their chromosome behaviors[J].ActaHorticulturaeSinica,2012,39(3):561-566.

[27] 軒淑欣, 張成合, 申書興,等.二倍體和四倍體結(jié)球甘藍(lán)減數(shù)分裂觀察[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,31(2):22-26.

XUAN S X,ZHANG C H,SHEN S X,etal. Meiotic observation of pollen mother cells in diploid and autotetraploid cabbage(Brassicaoleraceavar.capitata)[J].JournalofHebeiAgriculturalUniversity, 2008,31(2):21-26.

[28] 丁兆軍,鄧祝云,陶佳乙,等.染色體分離的分子機(jī)理[J].科學(xué)通報(bào),2003,48(19):2 014-2 021.

DING Z J,DENG Z Y,TAO J Y,etal. Molecular mechanism of chromosome segregation[J].ChineseScienceBulletin, 2003, 48(19):2 014-2 021.

[29] 張新忠,劉國(guó)儉,閆立英.熱激或低溫誘導(dǎo)辣椒產(chǎn)生2n花粉的細(xì)胞遺傳學(xué)機(jī)理[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,7(3):7-12.

ZHANG X Z, LIU G J, YAN L Y. Cytogenetic mechanism of 2n pollen formation induced with heat-shock or low temperature inCapsicumAnnuumL[J].JournalofHebeiAgriculturalSciences, 2003,7(3):7-12.

[30] 張正海,康向陽(yáng).植物2n配子發(fā)生及其遺傳標(biāo)記研究進(jìn)展[J].遺傳, 2006,28(1):105-109,200.

ZHANG Z H，KANG X Y. Advances in researches on genetic markers of 2n gametes[J].Hereditas, 2006,28(1):105-109,200.

[31] 趙 冬,張蜀寧,鄭金雙,等.中國(guó)芹花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂終變期的核型分析[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 34(1): 25 -28.

ZHAO D,ZHANG S N, ZHENG J S,etal. Karyotype analysis for pollen mother cells meiosis diakinesis ofApiumgraveolensL.[J].JournalofNanjingAgriculturalUniversity, 2011,34(1): 25-28.

[32] 刁 英,佘朝文,胡中立.中國(guó)蓮的偶線期核型分析[J].氨基酸和生物資源, 2006, 28(3): 34-35.

DIAO Y,SHE C W,HU Z L.Karyotype analysis for zygotene chromosome ofNelumbonucifera. [J].AminoAcids&BioticResources, 2006, 28(3): 34-35.

(編輯:潘新社)

Observations of Abnormal Meiosis and Karyotype Analysis for Pollen Mother Cells in DiploidPetuniahybridaVilm.

WEI Yue1,2, CAI Shanya1, DONG Hui1, SHI Honglin1, JI Yi1

(1 Polytechnical College of Agriculture and Forestry, Zhenjiang, Jiangsu 212400,China; 2 Horticultural College of Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,China)

In order to illuminate cytological mechanism of small amount 2n pollen existing in petunia, high sterile rate of petunia pollen in hot summer and explore chromosomal karyotype analysis in meiosis period, we conducted the observation of abnormal meiosis and karyotype analysis in meiosis diakinesis period by conventional plate method using flower buds of diploid petunia plant in hot summer as material. The results showed that abnormal meiosis was mainly characterized by multinucleolus, bivalent and sister chromatids dividing beforehand, chromosomes outside metaphase plate, unequal segregation, lagged chromosomes, lost chromosomes, triad and tetrad with micronucleus. These abnormal meiosis behaviour could cause the production of abortive pollen. In metaphase Ⅱ, fusing spindles, tripolar spindle in which spindle were orientated abnormally could easily lead to 2n pollen formation, the occurrence of 2n pollen percentage was 1.51% through statistics. The karyotype formula ofPetuniahybridaVilm. in meiosis diakinesie was K(2n)=2x=14=10m+4sm(SAT), which had 5 pairs of metacentric chromosomes (chrom. No.1,4,5,6,7), 2 pairs of submetacentric chromosomes(chrom. No.2 and 3, No.2 with satellite). Relative length was 2n=14=4M1+10M2, belonging to 2A type. The abnormal meiosis ofP.hybridacould lead to the production of 2n pollen and sterile pollen, the advantages of karyotype analysis in diakinesis for petunia included abundant materials, clear bivalents form and without artificial pairing analysis, etc al. It provided a new method for study on petunia cytology.

PetuniahybridaVilm.; pollen mother cells; meiosis; 2n pollen; karyotype analysis

1000-4025(2016)12-2440-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2440

2016-10-24;修改稿收到日期:2016-11-22

江蘇省科技廳自然科學(xué)基金(BK20131243)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金(CX(15)1021)；江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研項(xiàng)目(2013kj003)

魏 躍(1970-)，男，博士，副教授，主要從事園藝花卉細(xì)胞學(xué)與遺傳育種研究。E-mail:1069125418@qq.com

Q253;Q343.2+4

A