牛樟芝萜烯合成酶基因的克隆與鑒定

原曉龍， 趙 能， 陳 劍，陳中華，王 娟， 楊宇明，王 毅

(1 云南省林業(yè)科學(xué)院，國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室，云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室，昆明 650204；2 西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，昆明 650224)

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牛樟芝萜烯合成酶基因的克隆與鑒定

原曉龍1， 趙 能2， 陳 劍1，陳中華1，王 娟1， 楊宇明1，王 毅*

(1 云南省林業(yè)科學(xué)院，國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室，云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室，昆明 650204；2 西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，昆明 650224)

為了研究牛樟芝(Antrodiacamphorata)倍半萜的生物合成，通過對牛樟芝基因組分析獲得倍半萜類合成酶基因 (AcTPS2)，利用RT-PCR克隆獲得其全長cDNA，對其進行生物信息學(xué)分析和表達(dá)譜分析。結(jié)果顯示：AcTPS2 基因cDNA全長1 068 bp，Blast比對發(fā)現(xiàn)，AcTPS2含倍半萜類合成酶所獨具的富含天冬氨酸序列DXXXD及萜類合成酶特有的RRDTSG-LDL保守序列；系統(tǒng)進化分析顯示，AcTPS2基因與其他真菌的倍半萜聚為一類；表達(dá)譜分析顯示，以甘露糖作為碳源、以酪蛋白胨作為氮源能夠有效促進AcTPS2基因的誘導(dǎo)表達(dá)。研究結(jié)果可為以后牛樟芝倍半萜類生物合成提供一定的參考依據(jù)。

牛樟芝；倍半萜類合成酶；基因克?。幌到y(tǒng)進化；誘導(dǎo)表達(dá)

萜類化合物是自然界一種重要的次生代謝產(chǎn)物，其種類繁多、結(jié)構(gòu)多樣，通常被用作芳香劑、藥物和殺蟲劑等[1]。萜類通常由數(shù)量不同的異戊二烯(isoprene)結(jié)構(gòu)單位組成，根據(jù)異戊二烯結(jié)構(gòu)單位的不同，可把萜類分成單萜(monoterpene)、倍半萜(sesquiterpene)、二萜(diterpene)、三萜(triterpene)等；因萜類化合物具不同的碳環(huán)數(shù)，又可將萜類化合物分成鏈萜、單環(huán)帖、雙環(huán)帖和三環(huán)萜等[2-3]。萜類化合物這種豐富的結(jié)構(gòu)多樣性在一定程度上決定了其生物活性的多樣性[4]。

真菌能產(chǎn)生種類豐富的萜類化合物，尤以倍半萜和二萜類化合物居多，目前已從真菌中分離鑒定出倍半萜類化合物300多個[5]。倍半萜類物質(zhì)與其他萜類物質(zhì)相比，可表現(xiàn)出抗腫瘤、抗菌消炎、抗神經(jīng)毒性、抗蟲、抗病毒、免疫抑制劑保肝等生物活性[6]。倍半萜在萜類化合物中，根據(jù)碳環(huán)形成方式包括34種骨架類型，含無環(huán)、單環(huán)、雙環(huán)及三環(huán)倍半萜[5]。目前研究人員已從真菌中分離出多種倍半萜型化合物，如Anchel等[7]從杯傘屬真菌Clitocybeilludens中分離出的第一個原伊魯烷型倍半萜伊魯醇(illudol)；從乳菇Lactifluusvellereus的子實體中分離得到velleratretraol[8]，從擔(dān)子菌Lactariusrufus的子實體中得到了抗真菌的倍半萜rufuslactone[9]等。真菌倍半萜類同植物倍半萜類一致，以法尼基二磷酸為底物，以倍半萜類合成酶為關(guān)鍵酶合成倍半萜類[6]。

牛樟芝(Antrodiacamphorata) 屬真菌(Fungi)擔(dān)子菌亞門(Basidomycotina)層菌綱(Hymenomycetes)多孔菌科(Polypolaceae)薄孔菌屬(Antrodia)，主要分布于中國臺灣山區(qū)海拔450～2 000 m的腐朽牛樟樹(Cinnamomumkanehirai)的心材內(nèi)壁中，臺灣地區(qū)特產(chǎn)的傳統(tǒng)食藥兩用真菌[10-12]。牛樟芝菌體內(nèi)含有較多的生物活性物質(zhì)，如多糖類、三萜類、麥角甾醇、樟菇酸等[13]，具抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎及解毒等功效，尤其對酒精性肝損傷、化學(xué)性肝損傷等方面的保護作用極為顯著[14-15]。目前，對牛樟芝的萜類研究主要集中于二萜類、三萜類等萜類化合物分離及其生物活性的研究[16-18]，但對牛樟芝萜類化合物的生物合成報道較少。本研究以2014年完成的牛樟芝基因組為基礎(chǔ)[13]，采用基因組挖掘的方式，初步確定牛樟芝中倍半萜合成酶基因(AcTPS2)，并克隆獲得AcTPS2基因全長cDNA，用半定量PCR檢測不同培養(yǎng)基對AcTPS2基因表達(dá)的影響，為異源表達(dá)牛樟芝萜烯合酶以及進一步研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛樟芝菌體由昆明市食用菌研究所提供，并用malt yeast extract (美國BD)養(yǎng)基在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行擴繁培養(yǎng)。

1.2 方 法

1.2.1 牛樟芝AcTPS2基因全長的克隆 以來源于Coprinopsiscinereaokayama的序列(GenBank登錄號A8NE23.1) 為模板，對牛樟芝基因組數(shù)據(jù)進行本地Blast搜索，獲得牛樟芝AcTPS2基因DNA序列。用植物RNA提取試劑盒 (康為世紀(jì))提取牛樟芝的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以DNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計含有起始密碼子和終止密碼子的特異引物進行cDNA克隆(表1)，以cDNA為模板，以AcTPS2F0和AcTPS2R0為引物，利用高保真聚合酶 (全式金HiFi )進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測后，將目的片段與克隆載體連接轉(zhuǎn)化，并用菌落PCR對陽性克隆菌落進行篩選，最終對陽性克隆進行測序鑒定。

1.2.2AcTPS2基因生物信息學(xué)分析(表2) 將AcTPS2基因的cDNA序列和氨基酸序列進行理化性質(zhì)分析；將AcTPS2陽性測序結(jié)果用DNAman去除載體后，通過NCBI在線比對，對其DNA序列和氨基酸序列進行分析；選擇一致性較高的真菌TPS基因和其他真菌的二萜、單萜基因，用MEGA 6.0進行聚類分析。理化性質(zhì)預(yù)測借助于ProParam在線工具；信號肽預(yù)測利用SignalP 4.1 server；用Target P預(yù)測其亞細(xì)胞定位，用NCBI中的Conversed Domain Database數(shù)據(jù)庫搜索AcTPS2蛋白結(jié)構(gòu)功能域。

表1 克隆反應(yīng)所用引物序列

1.2.3 牛樟芝AcTPS2基因蛋白質(zhì)序列分子系統(tǒng)進化分析 將AcTPS2進行Blast在線比對，選擇一致性較高的6條蛋白質(zhì)序列，外加其他真菌二萜類、單萜類合成酶基因10條蛋白質(zhì)序列，與牛樟芝AcTPS2基因的蛋白質(zhì)序列進行多序列比對。多序列比對采用MEGA 6.0的Clustal W程序進行，使用默認(rèn)參數(shù)；構(gòu)建系統(tǒng)樹應(yīng)用鄰位相接法(Neighbor-Joining)，自展值設(shè)為1 000，其他采用默認(rèn)參數(shù)進行繪制。

表2 生物信息學(xué)在線工具及其網(wǎng)址

1.2.4AcTPS2基因表達(dá)分析 根據(jù)項目組之前的研究，碳氮源以及不同培養(yǎng)基的配方對牛樟芝生長速度有顯著影響[14]。因此，我們選取適合牛樟芝生長快速的培養(yǎng)基作為基因表達(dá)研究的配方(表3)。按照不同培養(yǎng)配置培養(yǎng)基，將牛樟芝菌絲體，分別接種在1～11號培養(yǎng)基上，并將其于25 ℃條件下的人工氣候箱培養(yǎng)40 d后，每種培養(yǎng)基中各獲取0.5 g牛樟芝真菌提取總RNA，并重復(fù)3次取樣。將牛樟芝總RNA合成cDNA，并以特異引物(表1)檢測非核糖體多肽合成酶AcTPS2基因表達(dá)的具體情況。其中，1～ 5號培養(yǎng)基為不同碳源添加物比較，在基本培養(yǎng)基麥芽糖和酵母提取物的基礎(chǔ)上，1號培養(yǎng)基不添加，2～4號培養(yǎng)基上添加等量不同糖類；6～11號添加不同的氮源添加物。在瓊脂糖凝膠電泳檢測過程中，各PCR產(chǎn)物和DNA maker的點樣量均為2.5 μL，電泳結(jié)束后，利用GENE-SNAPS圖像分析軟件分析不同培養(yǎng)基的條帶的積分光密度值，比較各目的條帶的積分光密度值，并以其積分光密度與DNA maker的條帶進行比較，按照相對定量的方法繪制柱狀圖，對凝膠電泳圖像進行相對定量。

一條胡同走到盡頭，沒胡同可拐，一幢多層樓攔在我們面前。李大頭走進樓洞，樓洞漆黑無燈。李大頭掏出鑰匙，打開一道鐵門。我們進去。屋子里有三個人，坐在地鋪上玩手機，屋外的光線透過半遮半擋的窗簾，打在他們臉上，還有手機反射的光，他們的臉便半人半鬼。如果前面沒有李大頭，后面沒有新來的王幸福，我肯定拔腿而逃。

2 結(jié)果與分析

2.1 AcTPS2基因全長的獲得

以牛樟芝cDNA為模板進行特異擴增，以AcTPS2F0和AcTPS2R0為引物，獲得了牛樟芝AcTPS2基因，全長1 068 bp，通過對比DNA和cDNA序列發(fā)現(xiàn)AcTPS2含有3個內(nèi)含子(從起始密碼子開始依次為395-442、648-700、776-833)，4個外顯子(圖1)。4個外顯子的拼接總長為1 068 bp，編碼355個氨基酸。將AcTPS2氨基酸序列與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，AcTPS2屬非植物萜類合成酶家族，與灰蓋鬼傘菌(Coprinopsiscinereaokayama)的α-依蘭油烯合成酶[α-muurolene synthase，A8NE23]具49%的相似度，一致性達(dá)98%。

表3 不同培養(yǎng)基配方

2.2 AcTPS2蛋白的理化性質(zhì)和序列比對分析

用在線軟件ProtParam預(yù)測AcTPS2蛋白質(zhì)氨基酸序列的理化性質(zhì)，相對分子質(zhì)量為40 028.5，結(jié)構(gòu)式C1775H2765N497O524S18，等電點pI為6.31，脂肪系數(shù)為87.01，不穩(wěn)定系數(shù)為40.69，屬于不穩(wěn)定蛋白。SignalP分析結(jié)果(圖2)顯示，AcTPS2不存在信號肽，為非分泌蛋白；采用Wolf Psort軟件預(yù)測其亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明其蛋白位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中。蛋白質(zhì)活性保守位點分析顯示，AcTPS2包含萜類合成酶特有的RRDTSG-LDL保守序列，富含天冬氨酸的基序DXXXD，能夠確定其編碼萜類合成酶類蛋白。

2.3 AcTPS2的分子系統(tǒng)進化分析

2.4 AcTPS2在不同培養(yǎng)基下的表達(dá)

以肌動蛋白(actin)作為參照，TTPSF、TTPSR為引物檢測AcTPS2基因在不同碳氮源培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)表達(dá)情況。AcTPS2基因在添加不同碳、氮源的條件下，誘導(dǎo)表達(dá)情況差異較大(圖4)。以基本培養(yǎng)基Mal(麥芽糖6 g, 酵母提取物3 g)為對照，添加甘露糖和果糖后AcTPS2基因誘導(dǎo)表達(dá)明顯提高，而乳糖和葡萄糖則顯示出一定的抑制作用，甘露糖的誘導(dǎo)AcTPS2基因表達(dá)能力最強，果糖次之；葡萄糖的抑制AcTPS2基因表達(dá)能力最高，乳糖次之。AcTPS2基因在不同氮源條件下，其誘導(dǎo)表達(dá)情況差異顯著，表現(xiàn)為酪蛋白胨(casein) > 番茄浸粉(tomato extract) > 土豆蛋白胨(potato peptone) > 酵母提取物(yeast extract) > 胰蛋白胨(trypeptone) > 牛肉浸粉(beef extract powder)，在添加牛肉浸粉的培養(yǎng)基上AcTPS2基因不表達(dá)，說明酪蛋白胨、番茄浸粉和土豆蛋白胨作為氮源添加物對AcTPS2基因的誘導(dǎo)表達(dá)具較明顯的增強作用，而牛肉浸粉對AcTPS2基因的誘導(dǎo)表達(dá)有抑制作用。

圖1 AcTPS2基因的內(nèi)含子和外顯子Fig.1 The introns and exons of AcTPS2 in Antrodia camphorata

FrTPS. 根纖維孔菌(XP_012182541.1)；DqTPS. 櫟迷孔菌(KZT69920.1)；LsTPS. 硫磺多孔菌(KZT04442.1)；OrTPS. 擬蠟菌(OCH86844.1)；FqTPS. 松生擬層孔菌(EPT00598.1)；AcTPS2. 牛樟芝圖2 牛樟芝AcTPS2與其他真菌TPS氨基酸序列比對分析FrTPS. Fibroporia radiculosa (XP_012182541.1); DqTPS. Daedalea quercina (KZT69920.1); LsTPS. Laetiporus sulphureus (KZT04442.1); OrTPS. Obba rivulosa (OCH86844.1); FqTPS. Fomitopsis pinicola (EPT00598.1); AcTPS2. Antrodia camphorataFig.2 Amino acid sequence alignment of AcTPS2 with other related fungus proteins

圖3 牛樟芝AcTPS2蛋白與其他真菌相關(guān)蛋白序列的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of AcTPS2 in A. camphorata with other related proteins in different fungi

圖4 不同添加物對AcTPS2的誘導(dǎo)表達(dá)情況Fig.4 The inducible expression of Antrodia camphorata's gene AcTPS2 cultivated in different additives

3 討 論

萜類化合物是一類生物自身產(chǎn)生的具多重生理功能的次生代謝產(chǎn)物，是天然產(chǎn)物的最大家族，迄今為止已發(fā)現(xiàn)了超過55 000多種不同結(jié)構(gòu)的帖類化合物，且以每10年翻一番的速度遞增[19]。萜類根據(jù)碳原子數(shù)量的不同，可分為單萜、倍半萜、二萜、三萜和多萜等，其中倍半萜類不僅在植物中比較常見，近年來已從真菌的菌絲體和子實體中分離鑒定出了大量倍半萜類化合物[5]。倍半萜類化合物是由倍半萜合成酶作為其關(guān)鍵合成酶，以法尼基二磷酸為底物合成的[20]。隨著真菌中的倍半萜類化合物不斷發(fā)現(xiàn)新的結(jié)構(gòu)，目前從真菌中分離鑒定出的倍半萜類化合物已達(dá)300多個，對真菌的萜類合成酶的研究也逐漸增多[5]。

牛樟芝作為中國臺灣地區(qū)特有的珍稀藥用真菌，具防癌、抗癌、提高免疫力等生理活性，經(jīng)分離發(fā)現(xiàn)其內(nèi)含物的主要生理活性成分為多糖和三萜類化合物[21]。目前，對牛樟芝的萜類化合物研究主要集中在三萜類化合物，從中發(fā)現(xiàn)了11種三萜類化合物，以麥角甾烷類三萜為主，這些三萜類化合物具明顯的抗炎效果[22-23]。但是對牛樟芝中倍半萜類化合物的研究尚未見報道。三萜和倍半萜的合成均來自于甲羥戊酸途徑，均以法尼基焦磷酸(FPP)為原料，其中三萜是以2分子的FPP為原料合成鯊烯，鯊烯在三萜合成酶的作用下形成甾醇或三萜；倍半萜以法尼基焦磷酸為原料，在倍半萜合成酶的催化下形成倍半萜[24]。最終所形成的倍半萜骨架可通過不同的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，如羥基化、羰基化、氫化、環(huán)氧化等生成不同的倍半萜類化合物[25]。倍半萜類合成酶的序列在植物、真菌中均具有較高的同源序列，如DXXXD或DDXXD序列，這種天冬氨酸富集基序具結(jié)合金屬離子的作用[26,27]。真菌中的基因在不同碳氮源添加物的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)表達(dá)水平具有不同程度的差異，有些基因在不同培養(yǎng)基條件下能夠大量表達(dá)，而在另外的培養(yǎng)基中完全不表達(dá)[28]。王毅等[29]研究發(fā)現(xiàn)，長松蘿地衣型真菌中聚酮合酶基因(PKS)在添加山梨醇(10%) 和蔗糖(2%和10%)的培養(yǎng)基上能大量表達(dá)，說明培養(yǎng)基成分能夠影響基因的誘導(dǎo)表達(dá)；Nielsen等[30]采用單株多產(chǎn)物(one strain-many comounds, OSMAC)策略從8種培養(yǎng)基中篩選出YES(Yeast Extract Sucrose)能夠有效刺激構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)PKS、NRPS基因的表達(dá)，并成功合成arugosins 和violaceols；王文靜等[31]通過改變培養(yǎng)基成分和pH及其他添加物，成功地篩選出Czapek Dox broth培養(yǎng)基，并利用該培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)海洋真菌Ascotrichasp. ZJ-M-5中三萜類合成酶基因的過量表達(dá)，成功地合成了3,4-裂環(huán)羊毛脂烷型三萜。這些研究均表明不同添加物對基因表達(dá)產(chǎn)生顯著影響，如本研究中碳源添加物中甘露糖和果糖能夠增強AcTPS2基因的表達(dá)，而乳糖和葡萄糖則對該基因有不同程度的抑制作用；氮源添加物中酪蛋白胨、番茄浸粉和土豆蛋白胨對AcTPS2基因的誘導(dǎo)表達(dá)具較明顯的增強作用，而牛肉浸粉對AcTPS2基因的誘導(dǎo)表達(dá)有抑制作用。這同其他真菌的單株多產(chǎn)物情況類似[32]，不同的培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和添加酶抑制劑等能夠刺激或激活不同的基因或基因簇，挖掘其產(chǎn)生不同次級代謝產(chǎn)物的能力，獲得具骨架新穎、活性不同的新穎化合物。

目前，牛樟芝倍半萜類合成酶的生物合成功能基因的研究較少，本研究從牛樟芝中獲得牛樟芝萜烯合成酶(AcTPS2)基因cDNA，同時利用RT-PCR檢測AcTPS2基因在不同碳氮源添加物的培養(yǎng)基上表達(dá)情況，為進一步探討牛樟芝倍半萜類物質(zhì)生物合成奠定基礎(chǔ)，同時也為異源表達(dá)牛樟芝倍半萜類物質(zhì)提供必要的材料。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Identification of Terpene Synthetases Gene inAntrodiacamphorata

YUAN Xiaolong1, ZHAO Neng2, CHEN Jian1, CHEN Zhonghua1,WANG Juan1, YANG Yuming1,WANG Yi1*

(1 Key Laboratory for Conservation of Rare, Endanger&Endemic Forest Plants, State Forestry Administration, Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploition of Forest Plants, Yunnan Academy of Forestry, Kunming 650204, China; 2 Forestry College, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)

In order to study the biosynthesis of sesquiterpene, this text analyzed the sesquiterpene synthetases gene(AcTPS2) through genome analysis ofAntrodiacamphorata, and obtained the full length cDNA with RT-PCR, carried on bioinformatics and mRNA analysis. The results showed thatAcTPS2 cDNA has 1 086 bp; Blast analysis revealed thatAcTPS2 included abundant asparagic acid motif DXXXD that is specific motif of sesquiterpene synthetase, and terpene synthetase special conserved sequence RRDTSG-LDL; phylogenetic trees showedAcTPS2 and other fungus sesquiterpene synthetase amino acid sequence clustered in one clade; mRNA analysis showed manitol as carbon source, casein peptone as nitrogen source could promoteAcTPS2 effectively, and the results could supply some basis in sesquiterpene biosynthesis.

Antrodiacamphorata; sesquiterpene synthetases; gene cloning; phylogenetic tree; inducible expression

1000-4025(2016)12-2398-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2398

2016-10-12;修改稿收到日期:2016-12-06

云南省科技廳對外科技合作計劃(2015IA004)；國家自然科學(xué)基金(31400488)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目 (2016FB055)

原曉龍(1986- )，男，碩士，助理研究員，主要從事分子生物學(xué)研究。E-mail: xiaolony@126.com

*通信作者:王 毅，博士，助理研究員，主要從事植物學(xué)和分子生物學(xué)研究。E-mail: 22825818@qq.com

Q785;Q786

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