苦蕎糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及活性鑒定

李茂菲，周 婧，姚攀鋒，趙學(xué)榮，李成磊，吳 琦

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安 625014)

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苦蕎糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及活性鑒定

李茂菲，周 婧，姚攀鋒，趙學(xué)榮，李成磊，吳 琦*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安 625014)

糖基化修飾在調(diào)控各種小分子的溶解度、穩(wěn)定性及生物活性中具有重要的作用。該研究基于苦蕎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆獲得2條糖基轉(zhuǎn)移酶基因(FtUFGT4和FtUFGT5)，并對(duì)其在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行酶催活性鑒定。結(jié)果表明：(1)獲得的苦蕎糖基轉(zhuǎn)移酶基因cDNA分別為1 434和1 470 bp，其編碼蛋白同屬于擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶E類(lèi)群，可能參與黃酮類(lèi)化合物的糖基化。(2)多重序列比對(duì)表明，F(xiàn)tUFGT4和FtUFGT5蛋白C端都具有PSPG框，其催化活性位點(diǎn)分別是H17和H16；FtUFGT4和FtUFGT5都是典型的植物糖基轉(zhuǎn)移酶GT-B結(jié)構(gòu)，二者的蛋白模型能與矢車(chē)菊素和UDP進(jìn)行分子對(duì)接。(3)FtUFGT4和FtUFGT5在大腸桿菌中獲得了可溶性表達(dá)，薄層層析實(shí)驗(yàn)表明二者均具有催化矢車(chē)菊素糖基化為矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的活性。

苦蕎；UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶；基因克隆；活性鑒定

植物次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性是由于植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生化學(xué)適應(yīng)的結(jié)果，具有防御病原微生物，吸引傳粉、固氮和防紫外線等多種功能[1]。植物次生代謝產(chǎn)物種類(lèi)繁多，結(jié)構(gòu)迥異，包括酚類(lèi)化合物、萜類(lèi)化合物和含氮有機(jī)堿等在內(nèi)的小分子化合物動(dòng)態(tài)地調(diào)節(jié)了植物細(xì)胞內(nèi)的平衡。為應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的復(fù)雜變化，植物體內(nèi)經(jīng)常發(fā)生小分子修飾作用賦予了其更大的靈活，從而形成了植物次生代謝產(chǎn)物的多樣性。糖基化是植物體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)機(jī)制之一，由糖基轉(zhuǎn)移酶 (glycosyltransferase, GTs) 催化的糖基化修飾在調(diào)控各種小分子的溶解度、穩(wěn)定性及生物活性中扮演了非常重要的角色。目前，據(jù)序列的相似度進(jìn)行分類(lèi)的碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù) (CAZy, http://www.cazy.org/GlycosylTransferases.html) 中，共儲(chǔ)存了243 230條糖基轉(zhuǎn)移酶的序列，所有的序列被歸到了98個(gè)家族中。其中，尿嘧啶核苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶 (UDP glycosyltransferases, UGTs) 主要存在于GT1家族中，負(fù)責(zé)將活性糖基從糖基供體轉(zhuǎn)移到一些次生代謝產(chǎn)物 (如激素、黃酮醇、花青素) 上以增加其穩(wěn)定性，這些糖基供體可以是UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖醛酸等[2]。

花青素是植物中最大的水溶性天然色素，經(jīng)苯丙烷類(lèi)代謝途徑合成，具有抗氧化、抗突變、預(yù)防心腦血管疾病、保護(hù)肝臟和抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生等多種功能[3]。花青素在結(jié)構(gòu)上主要分3類(lèi)：天竺葵素、矢車(chē)菊素和飛燕草素。植物中游離的花青素極不穩(wěn)定，多以糖基化形式存在。由UGTs催化的糖基化反應(yīng)最常發(fā)生在花青素的C-3、C-5、C-7、C-3’ 和C-4’位置，其中最多的是由花青素3-O糖基轉(zhuǎn)移酶催化的C-3位置的羥基取代反應(yīng)[4]?；ㄇ嗨?-O糖基轉(zhuǎn)移酶最先在玉米中[5]被發(fā)現(xiàn)，之后相繼在石竹、牽牛花、紫羅蘭等植物中都被分離到。大量研究表明，花青素3-O糖基轉(zhuǎn)移酶的活性減小會(huì)導(dǎo)致植物中的花色苷含量的積累也明顯減少[6]。

苦蕎 (Fagopyrumtataricum)又稱(chēng)韃靼蕎麥，是一種富含黃酮的藥食兩用小雜糧[7]。研究表明，苦蕎可以通過(guò)增加花青素的合成來(lái)抵御紫外、冷[8]和干旱等非生物學(xué)脅迫，且芽期苦蕎中花青素主要以矢車(chē)菊素3-O-葡萄糖和矢車(chē)菊素3-O-蕓香糖苷的形式存在，游離狀態(tài)的矢車(chē)菊素極少見(jiàn)[9]。本研究在前期獲得3條花青素3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶基因的基礎(chǔ)上[10]，又克隆得到了2條花青素3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶基因FtUFGT4和FtUFGT5，并對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行分子生物學(xué)分析，進(jìn)一步采用原核表達(dá)技術(shù)，在體外初步驗(yàn)證了二者對(duì)矢車(chē)菊素3-O糖基化的酶催活性。

1 材料和方法

1.1 材 料

苦蕎 (‘西蕎2號(hào)’) 種植于四川省雅安市四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地。大腸桿菌DH5α、原核表達(dá)載體pEGX4T-1質(zhì)粒和大腸桿菌BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存，其他化學(xué)藥品為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆 采用植物RNAout試劑盒[天根生化科技 (北京) 有限公司]提取苦蕎花期總RNA。以提取的RNA為模板，多聚胸腺嘧啶(Oligo-d T)為引物，通過(guò)Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas 公司)制備cDNA 第一鏈。根據(jù)苦蕎花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物(表1)。以花期苦蕎cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，含cDNA模板1 μL、引物1 μL、高保真DNA聚合酶(Prime STAR HS Polymerase，TaKaRa)12.5 μL和無(wú)菌去離子水9.5 μL。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性4 min； 98 ℃預(yù)變性 1 min，58 ℃變性 1 min，72 ℃延伸 1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 延伸10 min。按照DNA A-Tailing Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行加A后進(jìn)行T-Vector pMDTM19(Simple)載體克隆(TaKaRa)，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子測(cè)序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用DNAman 8.0對(duì)獲得FtUFGT基因編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)和多重序列比對(duì)。從NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下載其他植物糖基轉(zhuǎn)移酶序列，采用MEGA 4.0軟件，根據(jù)最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建FtUFGT的進(jìn)化樹(shù)。矢車(chē)菊素的三維結(jié)構(gòu)文件從chEBI (http://www.ebi.ac.uk/chebi/init.do)下載，登錄號(hào)為CHEBI:71682，UDP的三維結(jié)構(gòu)文件從RCSB PDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)上下載的黃酮3-O糖苷轉(zhuǎn)移酶(PDB：2C9Z)的三維結(jié)構(gòu)文件中獲得。利用蛋白質(zhì)建模軟件SWISS-Model建立蛋白質(zhì)模型，并用Discovery Studio2.5的剛性對(duì)接程序LibDock將FtUFGT蛋白質(zhì)模型與矢車(chē)菊素配體和UDP進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接范圍的球形半徑設(shè)置為9 ?，其余為默認(rèn)參數(shù)。對(duì)接結(jié)果用Pymol軟件做圖像調(diào)整。

表1 基因克隆及表達(dá)載體引物序列

1.2.3FtUFGT基因的原核表達(dá)和蛋白純化 以含有FtUFGT基因的T載體質(zhì)粒為模板，以加酶切位點(diǎn)引物(表1)進(jìn)行PCR反應(yīng)，并將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到T-Vector pMDTM19(Simple)載體，進(jìn)一步克隆到原核表達(dá)載體pGEX 4T-1。將陽(yáng)性重組表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) ，挑選單菌落接種到10 mL液體LB培養(yǎng)基中 (含氨芐青霉素500 μg/mL)，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。按2%接種量接種于50 mL液體LB培養(yǎng)基中 (含氨芐青霉素500 μg/mL)，37℃培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 至終濃度為0.1 mmol/L，20 ℃誘導(dǎo)8 h。收集菌液，重懸于pH 7.4的磷酸緩沖液經(jīng)超聲波處理后，收獲上清，并按照蛋白純化試劑盒GST-SefinoseTMKit(生工生物工程上海有限公司)的操作步驟純化蛋白。同時(shí)，將菌液、沉淀、上清和蛋白純化產(chǎn)物，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性鑒定 采用薄層層析技術(shù) (TLC) 對(duì)酶的活性進(jìn)行初步的定性鑒定。參照FORD C M[11]的方法，反應(yīng)體系中含9 mmol/L UDP-葡萄糖，14 mmol/L β-巰基乙醇，100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，100 μmol/L的矢車(chē)菊素，約5 μg純化蛋白，于30 ℃反應(yīng)30 min后，用等體積的乙酸乙酯萃取，采用薄層層析法進(jìn)行定性分析。依照薄層色譜法(中國(guó)藥典[12])試驗(yàn)，以1 μL矢車(chē)菊素 (2 mg/mL)、2 μL矢車(chē)菊3-O葡萄糖苷 (1 mg/mL)和兩者的混合物作為對(duì)照，將反應(yīng)后的萃取物分別點(diǎn)樣于羧甲基纖維素鈉硅膠 G 薄層板上，以正丁醇∶乙酸∶水=2∶1∶2為展層劑，展開(kāi)，取出，晾干，碘蒸氣顯色。計(jì)算斑點(diǎn)的Rf值，鑒別反應(yīng)液中新增物質(zhì)的成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性鑒定

以花期苦蕎總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，2對(duì)引物PCR擴(kuò)增后均獲得了1條約1 500 bp的特異條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為 1 434和 1 470 bp，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)完全一致，命名為FtUFGT4和FtUFGT5。序列分析表明，苦蕎FtUFGT4 cDNA 序列包含一個(gè)1 434 bp ORF，編碼477個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子量大小為53.4 kD，等電點(diǎn)為5.15；苦蕎FtUFGT5 cDNA 序列包含一個(gè)1 470 bp ORF，編碼489個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子量大小為54.7 kD，等電點(diǎn)為4.94。

2.2 FtUFGT4和FtUFGT5編碼蛋白進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

利用Mega4.0軟件構(gòu)建基于植物UGT氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。結(jié)果表明，LIM E K[13]據(jù)PSPG保守框從擬南芥中鑒定出107條序列，根據(jù)序列之間的進(jìn)化關(guān)系把所有序列分為14個(gè)族(A～N)。據(jù)此分類(lèi)法，苦蕎花青素3-O糖苷轉(zhuǎn)移酶FtUFGT1～3屬于F族，而FtUFGT4和FtUFGT5同屬于E族，此家族中還包括At71和72家族，其中At71C1與FtUFGT4相似度是35.56%，和FtUFGT5相似度是41.12%。

2.3 FtUFGT4和FtUFGT5多重序列比對(duì)

選取已解析出蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)且有花青素-3-O葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶活性的VvGT、Mt78G1、Mt85H2和Ct78k6，與FtUFGT4和FtUFGT5氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)(圖 3)。結(jié)果顯示，它們的蛋白C端序列相對(duì)于N端更保守，C端和N端的連接區(qū)氨基酸的保守度較低。在VvGT1的H20、Mt78G1的H26和Ct78K6的H17，與 FtUFGT4的H17和FtUFGT5的H16是高度保守的。在糖苷轉(zhuǎn)移酶C端都有一個(gè)44氨基酸的PSPG(the plant secondary product glycosyltransferase)保守區(qū)域，此區(qū)域是糖基轉(zhuǎn)移酶的識(shí)別基序。PSPG框的第一位氨基酸和最后一位氨基酸都是非常保守的，在FtUGT4中分別是W341和Q384，在FtUFGT5中是W357和Q400。

M. DNA Marker Ⅲ；1. FtUFGT4； 2. FtUFGT5圖1 苦蕎FtUFGT4和FtUFGT5基因PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of FtUFGT4 and FtUFGT5 form tartary buckwheat

At. 擬南芥；Vv. 葡萄；Mt. 蒺藜苜蓿；Zm. 玉米；Cr. 長(zhǎng)春花；Ac. 洋蔥；St. 馬鈴薯； Bp. 雛菊；Cm. 柚子；Bn. 歐洲油菜； Sr. 甜菊；Sb. 高粱圖2 苦蕎FtUFGT4和FtUFGT5蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)At.Arabidopsis thaliana；Vv.Vitis vinifera；Mt.Medicago trunkatula；Zm. Zea mays；Cr.Catharenthus roseus；Ac.Allium cepa；St.Solanum tuberosum；Bp.Bellis perennis；Cm.Citrus maxima；Bn.Brassica napus；Sr.Stevia rebaudiana; Sb. Sorghum bicolorFig.2 Phylogenetic relationships for tartary buckwheat FtUFGT4, FtUFGT5 and UFGTs in other plants

2.4 FtUFGT4和FtUFGT5蛋白模型及分子對(duì)接

利用蛋白質(zhì)建模軟件Swiss-Model，以三萜烯糖苷轉(zhuǎn)移酶UGT71G1 (PDB:2ACV)為模板建立FtUFGT4和FtUFGT5的蛋白模型，并將蛋白質(zhì)模型與矢車(chē)菊素和UDP進(jìn)行分子對(duì)接(圖4)。由圖4，A可知，F(xiàn)tUFGT4的N端由位于中間的6個(gè)扭曲平行β片層及圍繞它的8個(gè)α螺旋組成，C末端由扭曲平行的6個(gè)β片層和兩側(cè)的10個(gè)α螺旋組成。由圖4，B可知，F(xiàn)tUFGT5的N端由位于中間的7個(gè)扭曲平行β片層及圍繞它的8個(gè)α螺旋組成，C末端由扭曲平行的5個(gè)β片層和兩側(cè)的9個(gè)α螺旋組成。C端和N端是通過(guò)一個(gè)柔性環(huán)連接，在C端和N端之間形成一個(gè)松散可變的深溝。如圖4， C、D 所示。在FtUFGT4中C285、S288、A342、N363和E367與UDP分子形成氫鍵，G16、W362和E383與矢車(chē)菊分子形成氫鍵，Q384、H17、D126、W341和F128等氨基酸殘基形成疏水口袋，為矢車(chē)菊素和UDP的酶促反應(yīng)提供適合的環(huán)境。在FtUFGT5中，G15、A358、A378和A379與UDP形成氫鍵，Q400、H16、F129、F153、F196、F206和W357等氨基酸殘基形成疏水口袋。分子對(duì)接結(jié)果顯示FtUFGT4和FtUFGT5可能以矢車(chē)菊素和UDP-葡萄糖為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)。

2.5 FtUFGT4和FtUFGT5基因在大腸桿菌中的表達(dá)

將含有pEGX 4T-1-FtUFGT4和pEGX 4T-1-FtUFGT5重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)誘導(dǎo)表達(dá)后的全細(xì)胞裂解液、裂解液上清和裂解液沉淀及其親和層析純化的酶蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果(圖5)表明， FtUFGT4和FtUFGT5的基因工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，大腸桿菌產(chǎn)生了一條80 kD條帶，在細(xì)胞破碎物的上清和沉淀中均有存在。由于GST蛋白約25 kD，目的蛋白的分子量實(shí)際約有55 kD，符合理論預(yù)期。由圖5可以看出，表達(dá)蛋白經(jīng)GST-SefinoseTMKit純化后，獲得了條帶單一的FtUFGT4和FtUFGT5融合表達(dá)酶蛋白，可進(jìn)一步用于酶催活性鑒定。

2.6 苦蕎FtUFGT4和FtUFGT5酶催活性鑒定

采用薄層層析法對(duì)FtUFGT4和FtUFGT5反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。FtUFGT4和FtUFGT5的酶促反應(yīng)液都在接近矢車(chē)菊素3-O葡萄糖苷的位置有斑點(diǎn)。分析(圖6)表明，矢車(chē)菊素的Rf值0.67，矢車(chē)菊素3-O葡萄糖苷的Rf值0.46，F(xiàn)tUFGT4和FtUFGT5酶促反應(yīng)液的Rf值分別是0.42和0.47。FtUFGT4和FtUFGT5的Rf值均與矢車(chē)菊素3-O葡萄糖苷的Rf值接近，證明FtUFGT4和FtUFGT5反應(yīng)液中存在矢車(chē)菊素3-O葡萄糖苷，F(xiàn)tUFGT4和FtUFGT5能以UDP-葡萄糖和矢車(chē)菊素為底物，生成矢車(chē)菊素3-O葡萄糖苷。

Vv.葡萄；Mt.蒺藜苜蓿；Ct.蝶豆. 黑色框標(biāo)出催化活性位點(diǎn)H和PSPG圖3 苦蕎FtUFGT4和FtUFGT5蛋白的多重序列比對(duì)Vv. Vitis vinifera; Mt. Medicago truncatula; Ct. Clitoria ternatea. The catalytic base of H and PSPG Box are boxed in blackFig.3 Amino acid sequence alignment of tartary buckwheat FtUFGT4 and FtUFGT5 with UFGTs in other plants

A和B. FtUFGT4和FtUFGT5的三維結(jié)構(gòu)帶狀圖；PSPG框用紅色顯示。C和D. FtUFGT4和FtUFGT5結(jié)合區(qū)域的局部圖。矢車(chē)菊素分子(靛藍(lán))和UDP(藍(lán)色)用棍狀模型顯示，參與UDP和矢車(chē)菊素結(jié)合的氨基酸用紅色線狀結(jié)構(gòu)表示并加標(biāo)簽。綠色虛線表示氫鍵圖4 苦蕎FtUFGT4和FtUFGT5的同源建模及分子對(duì)接圖A，B. Ribbon diagram of the crystal structure of FtUFGT4 and FtUFGT5; PSPG box is shown in red；C，D. Close-up view of the donor-binding site in FtUFGT4 and FtUFGT5；The cyanidin molecule (cyan) and a UDP moiety (blue) are shown as stick models. Residues involved in the UDP and cyanidin-binding are shown as red lines and labeled；Hydrogen bonds are depicted with grean dotted linesFig.4 The homology modeling and molecular docking of FtUFGT4 and FtUFGT5

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ；1～4為誘導(dǎo)后FtUFGT4的全細(xì)胞裂解液、裂解液上清、裂解液沉淀和親和層析后蛋白；5～8為誘導(dǎo)后FtUFGT5全細(xì)胞裂解液、裂解液上清、裂解液沉淀和親和層析后蛋白圖5 FtUFGT4和FtUFGT5在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE分析M. Standard molecular Ⅲ；1-4. Whole cell lysate of FtUFGT4 induced, its lysate supernatant, its lysate precipitation and the protein purified by affinity chromatography, respectively；5-8. Whole cell lysate of FtUFGT5 induced, its lysate supernatant, its lysate precipitation and the protein purified by affinity chromatography, respectively.Fig.5 SDS-PAGE analysis of FtUFGT4 and FtUFGT5 expressed in E. coli

1.矢車(chē)菊素；2.矢車(chē)菊3-O葡萄糖苷；3.矢車(chē)菊素+矢車(chē)菊3-O葡萄糖苷；A，4. FtUFGT4的反應(yīng)液；B，4. FtUFGT5的反應(yīng)液。箭頭所指為酶促反應(yīng)產(chǎn)物圖6 苦蕎FtUFGT4和FtUFGT5催化反應(yīng)產(chǎn)物的薄層層析1.Cyaniding; 2.Cyanidin 3-O-glucoside; 3.Cyaindin + cyanidin 3-O-glucoside; A，4. Reaction product of FtUFGT4; B，4. Reaction product of FtUFGT5. Arrows show the production location of enzymatic reactionFig.6 Activity identification for tartary buckwheat FtUFGT4 and FtUFGT5with thin layer chromatography

3 討 論

糖基化修飾自然界中最重要的生理生化反應(yīng)之一，也是理解植物次生代謝的前沿領(lǐng)域。最近研究顯示，每個(gè)有機(jī)體中有接近1%的基因產(chǎn)物參與糖基化[14]。構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，F(xiàn)tUFGT4和FtUFGT5都被分到E族，且E族是植物的糖基轉(zhuǎn)移酶中最大的家族，擬南芥的此家族可以催化包括萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、脫落酸在內(nèi)的化合物[15]。

一般來(lái)說(shuō)GTs有嚴(yán)格的底物專(zhuān)一性和區(qū)域選擇性，這主要由一些短的基序和一系列的氨基酸決定[14]。多重比對(duì)結(jié)果顯示，GTs的蛋白C端氨基酸相對(duì)于N端更保守，C端和N端的連接區(qū)的保守度較低。GTs的C端是識(shí)別和結(jié)合糖基供體區(qū)，N端是識(shí)別和結(jié)合糖基受體區(qū)[16]。Mt71G1[17]的H22，Mt78G1[18]的H26，VvGT[19]的H20，Ct78K6[20]的H17等都是催化活性位點(diǎn)，是受體去質(zhì)子化必不可少的氨基酸。本研究中，H17 和H16可能分別就是FtUFGT4和FtUFGT5的催化活性位點(diǎn)。PSPG框中的44個(gè)氨基酸中有10個(gè)高度保守的氨基酸有可能與UDP-葡萄糖的結(jié)合有聯(lián)系[21]，F(xiàn)tUFGT4的PSPG框中第一個(gè)和最末氨基酸分別是W341和Q384，F(xiàn)tUFGT5的則為W357和Q400。PSPG框第一個(gè)氨基酸W的改變會(huì)影響植物UGTs與UDP-糖的結(jié)合，Mt85H2中的W360的吲哚環(huán)可以穩(wěn)定UDP-糖的嘧啶環(huán)[22]。PSPG框中的最后一個(gè)殘基若是H則更易結(jié)合半乳糖，若是Q則更利于結(jié)合葡萄糖糖苷[23]。因此，F(xiàn)tUFGT4和FtUFGT5可能更傾向于轉(zhuǎn)移UDP-葡萄糖。

糖基轉(zhuǎn)移酶在功能和序列的變化復(fù)雜，但在化學(xué)反應(yīng)機(jī)制和三維結(jié)構(gòu)上并沒(méi)有很大的變化，所以用蛋白質(zhì)的建模是一種有效的分析方式[24]。同源建模結(jié)果顯示FtUFGT4和FtUFGT5是典型的GT-B構(gòu)象。此外，分子對(duì)接結(jié)果證實(shí)FtUFGT4的H17、W341和Q384，以及和FtUFGT5H16、W357和Q400可參與形成疏水口袋，對(duì)蛋白質(zhì)與UDP和矢車(chē)菊素的結(jié)合有重要作用。同時(shí)，Zhu等[25]在研究細(xì)菌的黏附和致病機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)在糖苷轉(zhuǎn)移酶表面暴露的F111可能提供潛在的連接位置。FtUFGT4的F128和FtUFGT5的F129可能就是為矢車(chē)菊素的結(jié)合提供潛在位點(diǎn)的氨基酸。從生物信息學(xué)分析結(jié)果推測(cè)，F(xiàn)tUFGT4和FtUFGT5很有可能參與矢車(chē)菊素的糖基化，這也得到了進(jìn)一步活性鑒定的證實(shí)。

植物的花青素糖苷轉(zhuǎn)移酶不僅對(duì)花青素糖苷合成具有直接催化作用，而且在植物逆境應(yīng)答分子機(jī)制方面也發(fā)揮重要作用。在對(duì)荔枝[26]和小蒼蘭[27]等的研究中都已證明矢車(chē)菊素的積累與矢車(chē)菊素糖基轉(zhuǎn)移酶的活性成明顯的正相關(guān)。在紫外和缺肥的處理下苜蓿中花青素-3-O糖苷轉(zhuǎn)移酶基因UGT78G1的表達(dá)量上升，還可以與ANS基因協(xié)同表達(dá)，顯著提高花色苷的含量[28]。Zhou等[10]對(duì)冷脅迫處理后的苦蕎研究證明，花青素的增加伴隨著FtUFGT1-3基因的上調(diào)表達(dá)?？梢?jiàn)，本實(shí)驗(yàn)獲得的FtUFGT4和FtUFGT5均具有催化矢車(chē)菊素形成矢車(chē)菊素3-O-葡萄糖苷的活性，可能也參與了苦蕎花青素積累和抗逆應(yīng)答，有待進(jìn)一步深入研究。

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(編輯:宋亞珍)

Molecular Cloning and Expression of Glycosyltransferases Gene fromFagopyrumtataricum

LI Maofei, ZHOU Jing, YAO Panfeng, ZHAO Xuerong, LI Chenglei, WU Qi*

(College of Life Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014, China)

Glycosylation modification plays an important role in the regulation of solubility, stability and biological activity of various small molecules. Based on transcriptome data, we cloned two glycosyltransferase genes from tartary buckwheat and expressed them inE.coli. The result showed that: (1) the cDNA sequences ofFtUFGT4 andFtUFGT5 were 1 434 bp and 1 470 bp in length, respectively. Both of their coding proteins were classifieds E group of AtUFGTs fromArabidopsisthaliana, which may be involved in flavonoid glycosylation. (2) Multiple sequence alignment indicated that there was a PSPG Box at their C-terminal, and the catalytic activity site was H16 and H17, respectively. Meanwhile, both of them had a typical GT-B structures in plant glycosyltransferase. Moreover, the molecular docking results exhibited that FtUFGT4 and FtUFGT5 could dock with cyanidin and UDP. (3) FtUFGT4 and FtUFGT5 were ectopic expressed in theE.colisolubly. The thin layer chromatography (TLC) proved that they showed the cyanidin 3-O-glucoside activity.

tartary buckwheat；UDP-glucosyltransferase； gene cloning；activity identification

1000-4025(2016)12-2391-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2391

2016-07-28;修改稿收到日期:2016-10-31

國(guó)家自然科學(xué)基金(31500289)

李茂菲(1992-)，女，在讀碩士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail:1242009272@qq.com

*通信作者:吳 琦，博士，教授，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail: wuqi@sicau.edu.cn

Q785；Q786

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