茶樹谷丙轉氨酶基因的克隆及其表達分析

崔 新，劉志薇，吳致君，李 輝，王文麗，莊 靜

(南京農業(yè)大學 園藝學院，茶葉科學研究所，南京 210095)

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茶樹谷丙轉氨酶基因的克隆及其表達分析

崔 新，劉志薇，吳致君，李 輝，王文麗，莊 靜*

(南京農業(yè)大學 園藝學院，茶葉科學研究所，南京 210095)

該研究基于茶樹的轉錄組數(shù)據(jù)，采用RT-PCR方法從茶樹‘黃金芽’cDNA中克隆獲得茶樹谷丙轉氨酶基因(CsAlaAT)，利用熒光定量PCR方法，對CsAlaAT在茶樹材料‘迎霜’和‘黃金芽’不同組織、溫度脅迫與激素處理的表達進行分析。結果顯示：CsAlaAT基因開放閱讀框長度為1 662 bp，編碼553個氨基酸，含有天冬氨酸轉氨酶家族(Aspartate aminotransferase family)典型的AAT-like保守結構域。多序列比對顯示，該序列與多個相關物種的序列一致性達78.83%，與磷酸吡哆醛(PLP)結合的10個氨基酸殘基以及第358位賴氨酸催化位點在物種間高度保守。茶樹CsAlaAT蛋白屬親水性蛋白，相對分子質量為60 877.5 D，等電點為6.11，堿性、酸性、脂肪族和芳香族氨基酸比例分別為12%、11%、22%和8%，無序化特征不明顯，與大麥HvAlaAT具有相似的三維結構。實時定量PCR分析表明，CsAlaAT在茶樹‘迎霜’和‘黃金芽’中的表達均具有組織特異性，且均在根部的表達量最高；CsAlaAT響應高溫(38 ℃)和低溫(4 ℃)脅迫的表達上調；外源施用脫落酸(ABA)和赤霉素(GA)能夠抑制茶樹中CsAlaAT基因的表達。

茶樹；谷丙轉氨酶；多序列比對；溫度脅迫；激素；表達分析

茶是世界三大無酒精飲料之一，茶樹〔Camelliasinensis(Linn.) O．Kuntze．〕為山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaLinn.)多年生常綠木本植物[1-2]。作為一種重要的商業(yè)飲料作物，茶樹在中國、肯尼亞、斯里蘭卡、印度等地均有種植，栽培歷史悠久[3-4]。茶葉中含有許多對人體健康有益的次級代謝物質，包括茶氨酸、茶多酚、咖啡因和芳香油等[5]。其中茶氨酸(Theanine，N-乙基-γ-L-谷氨酰胺)是茶樹特征性非蛋白質氨基酸，由Sakato首次從綠茶葉片中提取出并命名為茶氨酸[6]。

茶氨酸具有焦糖的香味和類似于味精的鮮爽味，能中和茶湯中的苦澀感，是茶葉品質的重要影響因素之一。茶樹氮素代謝途徑中，氮素大部分以茶氨酸的形式進行儲存和代謝[7-8]。茶氨酸的合成與分解，與茶樹的呼吸代謝和某些物質的代謝有關，并與茶樹碳氮代謝的調節(jié)和控制有關[9]。通過同位素標記研究證實茶樹茶氨酸的代謝前體為谷氨酸和乙胺[7]，通過L-茶氨酸合成酶(TS)在ATP、mg2+、K+的催化下合成[10]。目前，與茶氨酸生物合成直接相關的酶已經(jīng)有很多研究報道，然而其中鮮有對參與茶氨酸代謝前體合成的谷丙轉氨酶的報道。

谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase，AlaAT)又稱為丙氨酸轉移酶，是一種依賴磷酸吡哆醛(PLP)作為輔酶的轉氨酶，廣泛分布于動物、植物、真菌和一些細菌中[11]。在不同的物種中，谷丙轉氨酶可分為2～6個亞型，通過亞細胞定位發(fā)現(xiàn)其亞型可分布于細胞質、線粒體和過氧化酶體中[12]。谷丙轉氨酶可逆地催化丙酮酸和谷氨酸生成丙氨酸和戊酮二酸[13]，在茶樹中這個可逆反應是茶氨酸代謝前體丙氨酸合成的主要途徑，丙氨酸再通過丙氨酸脫羧酶(ADC)脫去羧基形成乙胺用于合成茶氨酸。

谷丙轉氨酶在植物氮素同化、蛋白質合成和碳代謝中發(fā)揮重要作用。有研究表明，過表達OsAlaAT基因的水稻可顯著提高產量[14]；Yang等[15]證實在低氧環(huán)境下，OsAlaAT基因參與調控水稻種子胚乳中淀粉的合成。谷丙轉氨酶也與植物抵御非生物脅迫有關，在擬南芥中缺氧環(huán)境會誘導AtAlaAT的表達[16]；也有研究指出AlaAT的活性在植物經(jīng)受干旱脅迫后的復水階段輕微上升，協(xié)助植物恢復正常代謝[17]。

本研究從茶樹品種‘黃金芽’(C.sinensisvar. Huangjinya)中克隆獲得茶樹谷丙轉氨酶基因(CsAlaAT)，并采用生物信息學方法對其氨基酸序列進行序列比對等分析。同時采用熒光定量PCR方法，對茶樹CsAlaAT基因在2個茶樹材料‘迎霜’(C.sinensisvar. Yingshuang)和‘黃金芽’不同組織、不同溫度脅迫及不同激素處理的表達分析，探討了谷丙轉氨酶的組織表達差異與溫度脅迫下的響應，為后續(xù)茶樹中谷丙轉氨酶功能以及茶氨酸代謝的深入研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

供試茶樹材料‘黃金芽’和‘迎霜’種植于南京農業(yè)大學茶葉科學研究所，為2年生扦插幼苗，于2016年春季選取正常生長無病害茶樹植株的根、莖、嫩葉和成熟葉進行總RNA提取及cDNA合成。對正常植株分別進行溫度脅迫處理與外源激素處理， 4 ℃、38 ℃、0.1 mmol/L ABA、1 mmol/L GA分別處理2、8、和24 h，提取葉片組織總RNA并反轉錄成cDNA，以未處理植株作為對照。另外，以茶樹品種‘黃金芽’葉片的cDNA為模板進行茶樹CsAlaAT基因克隆。

1.2 方 法

1.2.1 茶樹CsAlaAT基因克隆 茶樹總RNA按照Quick RNA Isolation Kit(北京華越洋生物科技有限公司)試劑盒操作說明提取，提取RNA樣品濃度由微量紫外檢測儀NanoDrop測定，RNA質量用12 g·L-1變性瓊脂糖凝膠電泳來檢測。cDNA合成按照 Prime Script RT reagent Kit(大連TaKaRa公司) 試劑盒操作說明完成?；诒緦嶒炇耀@得的茶樹轉錄組數(shù)據(jù)[18]設計1對引物(5′-ATGTGGAAATTCGTAGCCGAC-3′和3′- ATCACGAAATTCATCCATGAA-5′)。以‘黃金芽’cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增。擴增體系為20 μL體系：ddH2O 7 μL，ExTaqMix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL。反應條件為:95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產物用12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分離，切取目標膠塊，參照DNA回收試劑盒說明書將其回收純化，連接至pMD19-T載體，轉入感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株，挑取陽性克隆菌液送至南京金斯瑞公司測序。

1.2.2 序列分析 利用NCBI網(wǎng)站相關程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對獲得的核苷酸和蛋白序列進行BLAST比對搜索和保守域預測。序列多重比對、組成成分和理化性質用DNAMAN 6.0和EXPASY(http://web.expasy.org/protparam/)軟件完成；使用MEGA6[19]完成進化樹測試和編輯并生成報告圖形；利用Foldindex[20]程序和SOPMA[21]程序完成蛋白質無序化特性分析和二級結構預測。采用Swiss-model[22]軟件進行蛋白質三維分子結構分析。熒光定量PCR的數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS Statistic 20和 Microsoft Excel2010軟件制作完成。

1.2.3 茶樹CsAlaAT基因的表達分析 熒光定量PCR按照SYBR PremixExTaq試劑盒(大連TaKaRa公司)操作說明進行。根據(jù)本克隆的‘黃金芽’CsAlaAT基因序列設計表達檢測引物(5′-CGAGTCCTACGAGTCTTATTATGC-3′和3′-GGAGGCGTTGACAATAGAATG-5′)。每個處理設置3個生物學重復，并分別用茶樹Actin基因和TBP基因作為內參，與目標基因一起擴增[23]。在Bio-CFX96 Real-time PCR System 中完成熒光定量PCR。擴增程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)，然后利用 Bio-cfx manager進行溶解曲線分析，采用2-ΔΔCt法[24]進行結果分析。

2 結果與分析

2.1 茶樹CsALaAT基因克隆

以‘黃金芽’葉片的cDNA為模板，擴增得到長約1 700 bp片段。序列分析結果表明，該片段含有1個長度為1 662 bp開放閱讀框(ORF)，共編碼553個氨基酸(圖1)。

2.2 茶樹CsAlaAT序列比對和進化分析

對茶樹CsAlaAT基因推導氨基酸的保守域預測結果(圖3，A)顯示，第154～528位序列含有1個典型AAT-like保守結構域，該序列還包含磷酸吡哆醛(PLP)結合位點[25]和一個參與形成席夫堿(Schiffbase)或醛亞胺配體(aldimine intermediate)的催化殘基第358位賴氨酸(Lys)[26]，以及形成二聚體多肽結合位點的8個氨基酸殘基，以上特征表明CsAlaAT屬于天冬氨酸轉氨酶家族。

此外，將茶樹CsAlaAT同大麥(Hordeumvulgare)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、油菜(Brassicanapus)、煙草(Nicotianatabacum)、水稻(Oryzasativa)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、玉米(Zeamays)的AlaAT氨基酸序列進行多重對比，結果顯示一致性為78.83%。其中上述物種的AlaAT均含有AAT-like結構域，其中構成磷酸吡哆醛(PLP)結合位點的10個氨基酸殘基，包括一個與PLP形成醛亞胺鍵的關鍵賴氨酸殘基，在上述物種間一致，具有高度的保守性(圖3，B)。

為了進一步分析茶樹CsAlaAT的進化關系，對其進行Blast同源檢索與比對，得到不同物種間與其相似程度較高的AlaAT蛋白氨基酸序列，選取毛果楊(Populustrichocarpa)、可可(Theobromacacao)、甜椒(Capsicumannuum)、煙草(N.tabacum)、蕪菁(Brassicarapa)、咖啡(Coffeacanephora)、番茄(Solanumlycopersicum)、罌粟(Papaversomniferum)、棉花(Gossypiumhirsutum)、甜瓜(Cucumismelo)、馬鈴薯(S.tuberosum)、大豆(Glycinemax)、擬南芥(A.thaliana)、水稻(O.sativa)、大麥(H.vulgare)、油菜(B.napus)、玉米(Z.mays)的AlaAT氨基酸序列構建同源進化樹。結果顯示，茶樹CsAlaAT氨基酸序列與咖啡、甜瓜等的進化關系較近，與水稻、玉米等的進化關系較遠(圖2)。

2.3 茶樹CsAlaAT氨基酸組成及理化性質分析

根據(jù)茶樹CsAlaAT氨基酸序列在BLAST同源檢索與比對，獲得不同植物中相似度較高的AlaAT氨基酸序列，利用ExPASy-ProtParam對其進行氨基酸序列組成及理化性質分析。結果顯示(表1)，在這些植物中AlaAT蛋白殘基數(shù)為481～575。相對分子質量為(5.2～6.3)×104；堿性氨基酸比重略多于酸性氨基酸，等電點范圍為5.3～7.5之間。脂肪族氨基酸占比22%左右，芳香族占比8%；總平均疏水性(GRAVY)均為負值，表明這些蛋白均屬于親水性蛋白。

圖1 茶樹CsALaAT核苷酸和推導氨基酸序列Fig.1 Nucleotide acid and deduced amino acid sequences of CsAlaAT from tea plant

2.4 茶樹CsAlaAT氨基酸序列的無序化分析

利用FoldIndex程序對CsAlaAT氨基酸序列進行了折疊的無序化分析。結果顯示(圖4)：序列中無序化區(qū)域共有2個，最大無序化區(qū)域含28個氨基酸，總的無序化氨基酸數(shù)目為42，無序化比例為7.59%；總體而言CsAlaAT氨基酸序列無序化不明顯。

2.5 茶樹CsAlaAT的二級結構和三級結構預測

從茶樹CsAlaAT全序列的二級結構預測結果

可知(圖5)，CsAlaAT蛋白由41.41%的α螺旋，16.09%的β-折疊，12.84%的β-轉角和26.66%的隨機卷曲組成。結果表明，α-螺旋是CsAlaAT的主要組成部分，而β轉角和β-折疊則散布于CsAlaAT蛋白序列中。

圖2 茶樹CsAlaAT與其他物種氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.2 The phylogenetic tree of amino acid sequences of the CsAlaAT

以大麥HvAlaAT(PDB ID:3TCM)為模型，對CsAlaAT進行蛋白質三級結構建模分析，結果顯示HvAlaAT與CsAlaAT的三級結構非常相似(圖6)，一致性為78.38%。茶樹CsAlaAT在細胞內以二聚體的形式存在，其結構域與HVAlaAT相比均包括蛋白質N端(3～63)、一個較小的αβ-結構域(氨基酸殘基64～107，396～517)和一個較大的αβα-結構域(氨基酸殘基107～395)，活化位點以及PLP加合物(PLP adduct)處于這兩個結構域中間。

上劃線部分為AAT-like結構域，下標三角形的為PLP結合位點，下標矩形的為催化位點圖3 茶樹CsAalAT保守域(A)及與其他物種氨基酸序列的多重對比(B)Upper score represents the AAT-like conserved domain; triangles represent the PLP binding sites; rectangle represents the catalytic residue respectivelyFig.3 The conserved domain (A) of CsAalAT and alignment of amino acid sequences from tea plant and other different plants (B)

序列圖中下劃線代表無序狀態(tài)的氨基酸，無下劃線代表有序狀態(tài)的氨基酸，坐標圖中正負數(shù)值分別表示蛋白的有序和無序狀態(tài)圖4 CsAlaAT折疊狀態(tài)的分析Amino acids represented ordered and non-ordered regions are shown in non-underline and underline, respectively; Positive and negative numbers represent ordered and disordered protein, respectivelyFig.4 Prediction of the folding state of CsAlaAT

植物Plant名稱Name登錄號GenBankNo．總氨基酸數(shù)目Totalaminoacid/aa相對分子質量Molecularweight/D理論等電點pI各氨基酸比例Compositionofaminoacid/%堿性Basic酸性Acid脂肪族Aliphatic芳香族Aromatics總平均疏水性Grandaverageofhydropathicity茶樹C．sinensisCsAlaAT55360877．56．111211228-0．209擬南芥A．thalianaAtAlaAT2NP＿565040．254059510．65．951312218-0．269咖啡C．canephoraCaAlaATCDO97792．148753518．95．441212228-0．213甜瓜C．meloCmAlaAT2XP＿008460348．151356307．16．251211228-0．176大豆G．maxGmAlaAT1ABW17196．148653320．65．311112218-0．213甜椒C．annuumCaAlaATAAR05449．148152793．25．291112238-0．147煙草N．tabacumNtAlaAT2XP＿016473669．154760127．46．011211218-0．233番茄S．lycopersicumSlAlaAT2XP＿004235527．157563179．27．541311228-0．184馬鈴薯S．tuberosumStAlaAT2XP＿006342897．154559613．75．891211218-0．219水稻O．sativaOsAlaATAAK52114．148452692．36．221111238-0．110油菜B．napusBnAlaATXP＿013744571．154059573．06．251312218-0．241玉米Z．maysZmAlaATAAC62456．148252997．76．291211229-0．165大麥H．vulgareHvAlaAT39575927350055135．76．061412228-0．214

藍色. α-螺旋；紅色. β-折疊；綠色. β-轉角；粉色. 隨機卷曲圖5 茶樹CsAlaAT的二級結構預測Blue. Alpha helix, Red. Extended strand, Green. Beta turn, Pink. Random coilFig.5 The secondary structure of the deduced CsAlaAT polypeptide

圖6 茶樹CsAlaAT的三維結構預測Fig.6 The three-dimension structures of CsAlaAT from tea plant

2.6 茶樹CsAlaAT基因在茶樹不同部位的表達分析

通過實時熒光定量PCR檢測CsAlaAT基因在茶樹‘迎霜’和‘黃金芽’不同部位的表達情況。結果顯示，茶樹CsAlaAT基因在‘迎霜’和‘黃金芽’中的表達模式較為相似，均在根部表達量最高(圖7)?！汀S金芽’CsAlaAT基因表達量由高到低均為根、莖、成熟葉、幼葉；根的表達量顯著高于其他3個部位，幼葉和成熟葉表達量較為接近。此外，CsAlaAT基因在‘黃金芽’根部的表達量顯著高于在‘迎霜’根部的表達量，為‘迎霜’根部的26.3倍。

2.7 CsAlaAT基因不同溫度和激素處理下的表達情況

茶樹‘迎霜’在4 ℃低溫、ABA處理和GA處理下，CsAlaAT表達量較對照均表現(xiàn)出一定程度下調，基本趨勢為處理初的2 h左右表達量最低，隨處理時間延長表達量有一定回升，但仍顯著低于對照(圖8，A)。‘黃金芽’與‘迎霜’的CsAlaAT基因在38 ℃高溫處理下，表達量相對于對照均有上調，在處理2、8、24 h后的表達量分別為對照的1.7、1.1、

2.4倍和4.2、2.5、2.1倍(圖8，B)。茶樹品種‘黃金芽’，在4 ℃低溫處理下，表達量相較對照有一定上調，在處理2、8、24 h后分別為對照的1.2、1.7和1.6倍(圖8，C)。在ABA處理下，‘黃金芽’的CsAlaAT基因表達與‘迎霜’的表達模式相似，即處理最初下調最顯著，隨處理時間延長開始有一定回升。在GA處理下，‘黃金芽’的CsAlaAT在處理2 與8 h情況下，下調量并未達到顯著水平，在持續(xù)處理24 h后，下調量達到顯著水平(圖8,D)。

不同小寫字母表示同一品種不同組織的差異顯著(P<0.05)圖7 CsAlaAT基因在茶樹不同組織的表達Different letters represent significant difference among tissues of two cultivarsFig.7 Expression analysis of AlaAT in different tissues

不同小寫字母表示同一品種不同處理的差異顯著(P<0.05)圖8 CsAlaAT基因在不同處理下的表達Different letters represent significant difference among different treatments of two cultivars (P<0.05)Fig.8 Expression analysis of CsAlaAT under different stress treatments

3 討 論

谷丙轉氨酶是一類依賴磷酸吡哆醛作為輔酶的轉氨酶類，其催化的可逆反應中可利用的底物有碳代謝中關鍵的戊酮二酸、丙酮酸，以及參與氮素同化及信號轉導的谷氨酸。谷丙轉氨酶在植物的碳氮代謝有著不可或缺的作用，研究也證實其可協(xié)助植物抵御脅迫[27-28]。本實驗從茶樹品種‘黃金芽’中克隆出長約1 700 bp片段，該片段含有1個典型的AAT-like保守結構域，屬于天冬氨酸轉氨酶超家族。與多種親緣關系相近的植物AlaAT氨基酸序列具有較高的相似性和相近的理化性質。推導的三級結構與大麥HvAlaAT三級結構一致性較高，以二聚體的形式進行催化，參與形成希夫堿的活化位點第358位賴氨酸(Lys)殘基在2個物種間保持一致。

‘黃金芽’和‘迎霜’不同組織和不同逆境處理下表達分析顯示，茶樹CsAlaAT基因表達具有組織特異性，均在根部表達量最高。其中‘黃金芽’根部表達量顯著地高于‘迎霜’根部表達量。Rocha等[29]測量了谷丙轉氨酶在大豆(Glycinemax)中的組織特異性表達，GmAlaAT在接種了根瘤菌的大豆植株的根部表達量最高，高于沒接種根瘤菌的根部表達量，也高于在葉和豆莢中的表達量。這個結果同CSAlaAT在‘黃金芽’中的表達模式相似。接種根瘤菌可提高大豆的氮素同化率[30]，‘黃金芽’屬白化茶樹品種，具有氨基酸含量高，茶多酚和咖啡因量適中的特點[31]，推測其根部大量的茶氨酸合成和旺盛的氮素同化是CsAlaAT在根部表達量高的可能原因。

目前，對茶氨酸代謝相關的研究較多，然而對茶樹谷丙轉氨酶研究報道較少，對其在茶樹碳氮代謝以及抵御脅迫中的作用和機理有待深入研究。對茶樹谷丙轉氨酶及其家族成員的研究，可作為一個新的角度來理解茶樹茶氨酸代謝與碳氮代謝之間的聯(lián)系以及其響應茶樹非生物脅迫的分子機理。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis of the Gene Encoding Alanine Aminotransferase inCamelliasinensis

CUI Xin, LIU Zhiwei, WU Zhijun, LI Hui, WANG Wenli, ZHUANG Jing*

(College of Horticulture, Tea Science Research Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Alanine aminotransferase (AlaAT) is a pyridoxal-5′-phosphate-dependent (PLP) enzyme which plays a critical role in linking carbon and nitrogen metabolism. AlaAT is also involved in plant responses to abiotic stress. In this study, based on the transcriptome data of tea plant, we clonedCsAlaATgene encoding alanine aminotransferase from cDNA of ‘Huangjinya’ by RT-PCR method. In addition, the expression profiles of theCsAlaATgene in different tissues and under extreme temperatures and hormone treatments in two tea plant varieties (‘Huangjinya’ and ‘Yingshuang’) were analyzed by quantitative real time PCR. Results showed that the length of open reading frame (ORF) ofCsAlaATgene was 1 662 bp, encoding 553 amino acids. CsAlaAT contains typical conserved AAT-like domain which belongs to Aspartate aminotransferase family. Multiple alignments of CsAlaAT with related plant species showed that the identity of them was 78.83%. The PLP binding sites and the catalytic residue of 358 Lys were highly conserved. The CsAlaAT is hydrophilic protein. Its theoretical relative molecular weight is 60 877.5 D. Theoretical isoelectric point is 6.11. Percentages of basic, acidic, aliphatic and aromatic amino acids were 12%, 11%, 22% and 8%, respectively. A three-dimension crystal structure of CsAlaAT was established on the basis of the HvAlaAT which share identity of 78.38% with CsAlaAT. Quantitative real-time PCR analysis of the expression profiles showed that theCsAlaATgene was tissue-specific expressed in two tea plant varieties ‘Huangjinya’ and ‘Yingshuang’. The highest expression level was found in the root. TheCsAlaATgene could respond to high temperature (38 ℃) and low temperature (4 ℃) treatments. Exogenous application of abscisic acid (ABA) and gibberellins (GA) could down-regulated theCsAlaAT.

Camelliasinensis; alanine aminotransferase; multiple alignment; temperature stress; hormone; expression profiles

1000-4025(2016)12-2361-09

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2361

2016-10-18;修改稿收到日期:2016-12-09

國家自然科學基金(31570691)

崔 新(1992-)，男，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學研究。E-mail: 2015104091@njau.edu.cn

*通信作者:莊 靜，教授，博士生導師,主要從事茶樹遺傳育種與茶樹分子生物學研究。E-mail: zhuangjing@njau.edu.cn

Q785;Q786

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