臧學(xué)麗
(長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校,吉林長(zhǎng)春 130031)
納豆激酶生產(chǎn)菌的亞硝基胍誘變
臧學(xué)麗
(長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校,吉林長(zhǎng)春 130031)
文章研究了產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌的亞硝基胍誘變。采用亞硝基胍為誘變劑誘變枯草芽孢桿菌,誘變后酶活達(dá)到4 100U/g,提高了122.2%,為進(jìn)一步的發(fā)酵研究提供依據(jù)。
納豆激酶 亞硝基胍 枯草芽孢桿菌
納豆激酶(Nattokinase,NK)是由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto,BSN)產(chǎn)生的一種堿性蛋白酶,它具有溶解血栓的作用[1]。納豆激酶具有安全、副作用少、成本低、易吸收[2]、在體內(nèi)作用時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[3],是一種具有開發(fā)潛力的溶栓藥物。文章對(duì)產(chǎn)納豆激酶的枯草芽孢桿菌進(jìn)行了化學(xué)誘變[4],使納豆激酶的活性得到顯著提高。
1.1 材料
試驗(yàn)菌株:納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto,BSN),長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校生工試驗(yàn)室保藏。篩選培養(yǎng)基:纖維蛋白平板復(fù)篩培養(yǎng)基。
1.2 方法
1.2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
在37℃條件下以8%的接種量接種納豆枯草芽孢桿菌于液體培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h后于600 nm波長(zhǎng)的紫外可見分光光度計(jì)下測(cè)其OD值,3組平行并繪制生長(zhǎng)曲線。
1.2.2 納豆激酶活性測(cè)定
(1)纖維蛋白平板法:參照Astrup法[5]。
(2)納豆中納豆激酶活力測(cè)定。稱取黃豆500 g,洗凈加入2.5倍水,浸泡過(guò)夜,分裝到250 ml三角瓶中,121℃高壓滅菌0.5 h,自然冷卻至50℃時(shí)以8%的接種量接上種子液,在37℃條件培養(yǎng)25 h。稱取納豆50 g,加入100 ml生理鹽水,浸泡30 min,5 000 r/min離心10 min,取上清液稀釋一定的倍數(shù),采用纖維蛋白平板法測(cè)定酶活。
1.2.3 枯草芽孢桿菌的誘變育種
培養(yǎng)納豆枯草芽孢桿菌至菌株的對(duì)數(shù)期,4℃冷凍高速離心機(jī)中5 000 r/min離心5 min。利用生理鹽水將菌泥均勻打散,并稀釋至菌體濃度為1×108。取上述菌懸液1 ml,加入pH4.5的醋酸鈉緩沖液2 ml,0.1 mol/L亞硝基胍溶液1 ml于37℃培養(yǎng)箱中分別黑暗孵育10、15、20、25 min后,向各樣品中加入0.07 mol/L的pH8.6的磷酸鹽緩沖液20 ml終止反應(yīng)。取100μl的上述菌懸液涂布到篩選培養(yǎng)基中,37℃避光培養(yǎng),并計(jì)算致死率。
致死率=(0 s時(shí)的菌落數(shù)-不同誘變時(shí)間的菌落數(shù))/0 s時(shí)的菌落數(shù)×100%
計(jì)算在不同誘變劑量條件下的致死率,并制作致死率曲線,查找出致死率為80%~90%的致死劑量,并在最佳的致死劑量條件下進(jìn)行誘變。
2.1 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線
通過(guò)試驗(yàn)可以得出,枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)周期適中,8 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期,24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,延滯期較短,適合應(yīng)用工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)。
2.2 對(duì)納豆枯草芽孢桿菌進(jìn)行亞硝基胍誘變
致死劑量為80%~90%時(shí),菌株的突變率最高,通過(guò)試驗(yàn)可看出,枯草芽孢桿菌在亞硝基胍的誘變時(shí)間為20 min時(shí)菌株的致死率為85%,所以該研究中選擇的亞硝基胍誘變時(shí)間為20 min。對(duì)亞硝基胍誘變的菌種進(jìn)行發(fā)酵,比較誘變前后的酶活,誘變后酶活達(dá)到4 100U/g,酶活提高了122.2%,誘變效果較好,經(jīng)過(guò)10代的傳代培養(yǎng),誘變后菌株的遺傳穩(wěn)定性良好。
枯草芽孢桿菌經(jīng)過(guò)亞硝基胍誘變,酶活提高了122.2%,酶活達(dá)到4 100U/g。
[1] 李淑英,趙仲麟,聶瑩,等.納豆激酶研究進(jìn)展.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2013,(4):139~143
[2] He Ni,Peng-Cheng Guo,Wei-Ling Jiang,et al.Expression of nattokinase in Escherichia coli and renaturation of its inclusion body.Journal of Biotechnology,2016
[3] 逯京華,孫智杰.納豆激酶的研究現(xiàn)狀與展望.生物技術(shù)通報(bào),2009,(8):41~45
[4] 王樂(lè).納豆激酶高產(chǎn)菌株篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化研究.山東輕工業(yè)學(xué)院,2009
[5] Sumi.Experimentia,1987,43:1110~1111