納豆激酶生產(chǎn)菌的亞硝基胍誘變

臧學(xué)麗

（長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林長(zhǎng)春 130031）

納豆激酶生產(chǎn)菌的亞硝基胍誘變

臧學(xué)麗

（長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林長(zhǎng)春 130031）

文章研究了產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌的亞硝基胍誘變。采用亞硝基胍為誘變劑誘變枯草芽孢桿菌，誘變后酶活達(dá)到4 100U/g，提高了122.2%，為進(jìn)一步的發(fā)酵研究提供依據(jù)。

納豆激酶 亞硝基胍 枯草芽孢桿菌

納豆激酶（Nattokinase，NK）是由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto，BSN）產(chǎn)生的一種堿性蛋白酶，它具有溶解血栓的作用[1]。納豆激酶具有安全、副作用少、成本低、易吸收[2]、在體內(nèi)作用時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[3]，是一種具有開發(fā)潛力的溶栓藥物。文章對(duì)產(chǎn)納豆激酶的枯草芽孢桿菌進(jìn)行了化學(xué)誘變[4]，使納豆激酶的活性得到顯著提高。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)菌株：納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto，BSN），長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校生工試驗(yàn)室保藏。篩選培養(yǎng)基：纖維蛋白平板復(fù)篩培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

在37℃條件下以8%的接種量接種納豆枯草芽孢桿菌于液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h后于600 nm波長(zhǎng)的紫外可見分光光度計(jì)下測(cè)其OD值，3組平行并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 納豆激酶活性測(cè)定

（1）纖維蛋白平板法：參照Astrup法[5]。

（2）納豆中納豆激酶活力測(cè)定。稱取黃豆500 g，洗凈加入2.5倍水，浸泡過(guò)夜，分裝到250 ml三角瓶中，121℃高壓滅菌0.5 h，自然冷卻至50℃時(shí)以8%的接種量接上種子液，在37℃條件培養(yǎng)25 h。稱取納豆50 g，加入100 ml生理鹽水，浸泡30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋一定的倍數(shù)，采用纖維蛋白平板法測(cè)定酶活。

1.2.3 枯草芽孢桿菌的誘變育種

培養(yǎng)納豆枯草芽孢桿菌至菌株的對(duì)數(shù)期，4℃冷凍高速離心機(jī)中5 000 r/min離心5 min。利用生理鹽水將菌泥均勻打散，并稀釋至菌體濃度為1×108。取上述菌懸液1 ml，加入pH4.5的醋酸鈉緩沖液2 ml，0.1 mol/L亞硝基胍溶液1 ml于37℃培養(yǎng)箱中分別黑暗孵育10、15、20、25 min后，向各樣品中加入0.07 mol/L的pH8.6的磷酸鹽緩沖液20 ml終止反應(yīng)。取100μl的上述菌懸液涂布到篩選培養(yǎng)基中，37℃避光培養(yǎng)，并計(jì)算致死率。

致死率=（0 s時(shí)的菌落數(shù)-不同誘變時(shí)間的菌落數(shù)）/0 s時(shí)的菌落數(shù)×100%

計(jì)算在不同誘變劑量條件下的致死率，并制作致死率曲線，查找出致死率為80%～90%的致死劑量，并在最佳的致死劑量條件下進(jìn)行誘變。

2 結(jié)果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

通過(guò)試驗(yàn)可以得出，枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)周期適中，8 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，延滯期較短，適合應(yīng)用工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)。

2.2 對(duì)納豆枯草芽孢桿菌進(jìn)行亞硝基胍誘變

致死劑量為80%～90%時(shí)，菌株的突變率最高，通過(guò)試驗(yàn)可看出，枯草芽孢桿菌在亞硝基胍的誘變時(shí)間為20 min時(shí)菌株的致死率為85%，所以該研究中選擇的亞硝基胍誘變時(shí)間為20 min。對(duì)亞硝基胍誘變的菌種進(jìn)行發(fā)酵，比較誘變前后的酶活，誘變后酶活達(dá)到4 100U/g，酶活提高了122.2%，誘變效果較好，經(jīng)過(guò)10代的傳代培養(yǎng)，誘變后菌株的遺傳穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

枯草芽孢桿菌經(jīng)過(guò)亞硝基胍誘變，酶活提高了122.2%，酶活達(dá)到4 100U/g。

[1] 李淑英，趙仲麟，聶瑩，等．納豆激酶研究進(jìn)展．中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2013，（4）：139～143

[2] He Ni，Peng-Cheng Guo，Wei-Ling Jiang，et al．Expression of nattokinase in Escherichia coli and renaturation of its inclusion body．Journal of Biotechnology，2016

[3] 逯京華，孫智杰．納豆激酶的研究現(xiàn)狀與展望．生物技術(shù)通報(bào)，2009，（8）：41～45

[4] 王樂(lè)．納豆激酶高產(chǎn)菌株篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化研究．山東輕工業(yè)學(xué)院，2009

[5] Sumi．Experimentia，1987，43：1110～1111