蛋白酶體抑制劑乳胞素對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG的抑制作用

張揚朱曉波趙金川韓志國孫陽高顯峰王偉柳敬偉侯坤

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 130031)

蛋白酶體抑制劑乳胞素對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG的抑制作用

張 揚 朱曉波 趙金川 韓志國孫 陽 高顯峰 王 偉 柳敬偉 侯 坤

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 130031)

目的 目的 探討蛋白酶體抑制劑乳胞素對人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG的抑制作用。方法 培養(yǎng)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MGM，分別以5、10、15 μmol/L作用于細(xì)胞株。MTT 法檢測細(xì)胞存活率；bcl-2、Bax及caspase-3 mRNA水平用RT-PCR法檢測；Rh123法檢測線粒體膜電勢；Hoechst 33342檢測細(xì)胞凋亡情況；U87MG細(xì)胞Bax及bcl-2的蛋白表達(dá)用Western印跡法檢測。結(jié)果 與未處理組相比對，U87MG細(xì)胞在實驗組的存活率下降，bcl-2、Bax mRNA及蛋白表達(dá)和線粒體膜電勢均下降，caspase-3 mRNA表達(dá)水平上升。結(jié)論 在體外條件下，乳胞素對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞具有較強的抑制效應(yīng)。

蛋白酶體抑制劑；乳胞素；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤中最高發(fā)的類型，約占全部顱內(nèi)腫瘤的30%，顱內(nèi)惡性腫瘤的80%〔1〕。據(jù)報道，臺灣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的中位生存期是15.1個月〔2〕。最大限度的手術(shù)切除是新診斷膠質(zhì)瘤尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤最主要的治療手段。手術(shù)切除可提供組織學(xué)診斷、緩解臨床癥狀和減少腫瘤負(fù)荷。然而由于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤呈浸潤性生長且常和重要神經(jīng)結(jié)構(gòu)鄰近，臨床實踐中很難完全切除。所以膠質(zhì)瘤的正規(guī)治療方法應(yīng)包括一期外科切除和后續(xù)放療、化療等在內(nèi)的綜合治療方案。有文獻(xiàn)提示，手術(shù)切除后接受放化療患者的中位生存期可延長10個月〔2〕。

泛素-蛋白酶體途徑是真核生物蛋白降解的重要途徑，對正常細(xì)胞周期、細(xì)胞功能和細(xì)胞存活至關(guān)重要。泛素-蛋白酶體途徑代謝障礙可導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。因此，抑制蛋白酶體途徑的活性是當(dāng)代惡性腫瘤診療的一個新方向〔3〕。乳胞素(LAC)是一種蛋白酶體抑制劑，與蛋白酶體的催化中心結(jié)合，進(jìn)而達(dá)到抑制后者活性的作用。實驗顯示，LAC可誘導(dǎo)大鼠C6和人性膠質(zhì)細(xì)胞瘤(U87MG)細(xì)胞凋亡〔4〕。本研究擬進(jìn)一步明確LAC對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用機制及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 上海生工生物工程技術(shù)公司提供引物；于TAKARA 公司購買DNA Marker (DL2000)、逆轉(zhuǎn)錄酶、PCR高保真TaqDNA聚合酶；溴乙錠、四甲基乙二胺(TEMED)、 Lactacystin 、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)購于Sigma 公司；Hoechst33342、Rhodamine 123購自北京百奧萊博科技有限公司；在Invitrogen購買Trizol、RT-PCR試劑盒；十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺(PAGE)、N，N-二甲基雙丙烯酰胺、瓊脂糖購于上海寶曼生物科技有限公司；新生牛血清、IMEM購于Gibco 公司。

1.2 分組 分為對照組(Con)和實驗組。實驗組的LAC 濃度分別為5、10、15 μmol/L組。

1.3 MTT 法檢測細(xì)胞存活率 以2×104/孔將4組細(xì)胞均勻接種在96 孔板中,每組細(xì)胞9復(fù)孔,分別加入5、10、15 μmol/L濃度的LAC后再培養(yǎng),然后加入5 g/L的MTT 20 μl，4 h后清除孔中培養(yǎng)基,每個孔加入150 μl DMSO,孔板振蕩直至完全溶解，用BIO-TEK酶標(biāo)儀檢測每孔的光吸收值。

1.4 采取RT-PCR 法檢測bcl-2、Bax和半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)mRNA 總RNA用Trizol試劑提取，先將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后取1 μl cDNA用于PCR反應(yīng)。將磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)調(diào)平后再擴增目的片段。

用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)(GIS)分析擴增產(chǎn)物電泳條帶光密度值，以目的基因和內(nèi)參磷酸鹽緩沖液GAPDH的比值進(jìn)行量化分析。

1.5 羅丹明(Rh123)檢測線粒體膜電勢 將細(xì)胞鋪于24孔板中，5×104/孔，各種濃度LAC處置細(xì)胞后8 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，棄去上清，加上1 μg/ml的Rh123，37℃孵育10～30 min，PBS洗2次，在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞中熒光強度。

1.6 Hoechst 33342檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞鋪于24孔板中，5×104/孔，各種濃度LAC處置細(xì)胞后8 h，PBS洗2次，除上清，加1 μg/ml的Hoechst 33342，37℃孵育20 min，PBS洗2次，顯微鏡下觀察染色質(zhì)凝集情況及其形態(tài)變化。

1.7 Western印跡法檢測U87MG細(xì)胞中Bax、bcl-2蛋白的表達(dá)水平 LAC處理細(xì)胞后倒掉培養(yǎng)液，加入胰酶，離心細(xì)胞，PBS洗2遍，各瓶加入150 μl細(xì)胞蛋白裂解液，細(xì)胞粉碎儀超聲粉碎細(xì)胞3次，放入4℃冰箱(約45 min)，離心后上清即為胞質(zhì)總蛋白，對蛋白進(jìn)行定量分析，以總蛋白45 μg作SDS-PAGE電泳分離蛋白樣本。濃縮膠100 V 30 min，分離膠200 V 60 min，電泳后以轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上 100 V 80 min，轉(zhuǎn)膜完畢后5%脫脂處理奶粉封閉2 h,PBST洗4遍,每遍20 min，加入一抗(1∶200)，4℃孵育12 h，PBST洗膜3次(15 min/次),加入過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000～1∶2 000),水平搖床處理40 min。PBST洗3遍(10 min/遍)。加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進(jìn)行PVDF膜顯色后拍照，內(nèi)參為β-actin。電泳條帶中以灰度×面積/參照物的值記錄表達(dá)的變化。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 MTT檢測U87MG細(xì)胞增殖率 與對照組(100%)比較，LAC 5 μmol/L組〔(70.02± 2.3)%〕、LAC 10 μmol/L組〔(65.09±3.5)%〕及LAC 15 μmol/L組〔(55.1± 2.1)%〕中U87MG細(xì)胞的增殖率明顯降低(P<0.05)。

2.2 RT-PCR檢測bcl-2/Bax、caspase-3 mRNA表達(dá)水平 與對照組比較，LAC 5、10及15 μmol/L組bcl-2/Bax的表達(dá)均顯著降低，caspase-3顯著升高(P<0.05)，提示線粒體凋亡途徑可能參與了此過程。見圖1，圖2。

1 Con；2.LAC 5 μmol/L；3.LAC 10 μmol/L；4.LAC 15 μmol/L圖1 各組細(xì)胞bcl-2/Bax水平比較

1 Con；2.LAC 5 μmol/L；3.LAC 10 μmol/L；4.LAC 15 μmol/L圖2 各組細(xì)胞caspase-3水平比較

2.3 Rh123檢測線粒體膜電勢 與對照組比較，LAC 5、10、15 μmol/L組U87MG細(xì)胞內(nèi)紅色熒光強度明顯減弱，提示線粒體膜電勢明顯減低及細(xì)胞凋亡的存在。見圖3。

2.4 Hoechst 33342檢測細(xì)胞凋亡 與對照組比較，LAC 5、10、15 μmol/L組U87MG細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。細(xì)胞核皺縮及核分裂普遍存在提示凋亡的發(fā)生。見圖4。

圖3 各組細(xì)胞線粒體膜電勢比較

圖4 各組細(xì)胞核形態(tài)比較

2.5 Western印跡電泳檢測bcl-2/Bax蛋白表達(dá)水平 與對照組比較，LAC 5、10、15 μmol/L組bcl-2/Bax水平顯著降低(P<0.05)，說明可能有線粒體凋亡的發(fā)生。見圖5。

1.Con；2.LAC 5 μmol/L；3.LAC 10 μmol/L；4.LAC 15 μmol/L圖5 各組細(xì)胞bcl-2/Bax水平比較

3 討 論

泛素蛋白酶體途徑對細(xì)胞蛋白質(zhì)的有序降解對于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)和受體功能調(diào)控至關(guān)重要。此途徑控制核因子κB的激活。蛋白酶體在抗原提呈方面也扮演重要角色。罹患癌癥時，這一代謝途徑的失調(diào)將導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展、耐藥和腫瘤監(jiān)控失效。因此，抑制蛋白酶體系統(tǒng)可導(dǎo)致多種調(diào)節(jié)蛋白失衡，細(xì)胞周期停滯和凋亡〔3〕。

蛋白酶體途徑可降解某些轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控蛋白、腫瘤抑制蛋白以及原癌基因。抑制蛋白酶體可引起細(xì)胞凋亡。許多研究證實，蛋白酶體抑制劑對惡性、增殖活躍的細(xì)胞的作用要比正常細(xì)胞敏感。目前已有數(shù)種蛋白酶體抑制劑用于腫瘤的基礎(chǔ)研究。如Imajoh-Ohmi等〔5〕證實，作為蛋白酶體β亞基的一種不可逆性抑制劑，LAC可誘導(dǎo)人U937細(xì)胞凋亡。

LAC是從鏈霉菌中分離的，具有抑制鼠科動物神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)軸突分支的作用〔6〕。LAC的抗腫瘤作用主要通過蛋白酶體起作用，而后者廣泛分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和真核生物細(xì)胞核內(nèi)。蛋白酶體識別并分解已被泛素標(biāo)記的蛋白。LAC抑制泛素蛋白酶體主要通過細(xì)胞色素C依賴性和非依賴性途徑。LAC與26S蛋白酶體的20S核心特異性結(jié)合，抑制細(xì)胞內(nèi)肽鏈的降解。LAC對腫瘤細(xì)胞具有選擇性蛋白酶體抑制作用。當(dāng)與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時，它擁有疊加效應(yīng)，能提高惡性細(xì)胞對放、化療的敏感性〔7〕。有實驗顯示，LAC促進(jìn)c-Myc蛋白穩(wěn)定化和向胞內(nèi)集聚，增加Fas-ligand(FasL)的表達(dá)，并通過激活caspase-3觸發(fā)細(xì)胞凋亡〔8〕。蛋白酶體抑制劑理論上可影響正常組織，而LAC中腫瘤細(xì)胞具有特異性抑制作用。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具有生長迅速、侵襲性和高度的血管生成作用，因此其蛋白代謝較快且對蛋白酶體系統(tǒng)具有高度依賴性。以上特點使得蛋白酶體抑制劑成為一個理想的治療選擇。

綜上所述，LAC在體外條件下對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞具有較強的抑制作用。然而離臨床應(yīng)用還有很大一段距離。進(jìn)一步的動物和人的在體實驗可對其安全性和臨床應(yīng)用前景進(jìn)行評估。

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〔2015-12-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部科研專項基金資助(No.B11)

侯 坤(1986-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病的外科治療研究。

張 揚(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事顱內(nèi)腫瘤和腦血管疾病的研究。

R651.1+9

A

1005-9202(2016)24-6087-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.019