線粒體乙醛脫氫酶2野生型基因?qū)跔顒?dòng)脈搭橋患者的心肌保護(hù)作用

張?jiān)?jiān)，戴一洳，2，夏芳芳，劉樂，徐旭仲

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015；2.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 麻醉科，浙江溫州 325000）

?論 著?

線粒體乙醛脫氫酶2野生型基因?qū)跔顒?dòng)脈搭橋患者的心肌保護(hù)作用

張?jiān)?jiān)1，戴一洳1，2，夏芳芳1，劉樂1，徐旭仲1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015；2.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 麻醉科，浙江溫州 325000）

目的：對在體外循環(huán)（CPB）下行冠狀動(dòng)脈搭橋（CABG）手術(shù)的成年患者，篩查線粒體乙醛脫氫酶2 （ALDH2）野生型基因，觀察其對心肌缺血再灌注損傷（I/R）的保護(hù)作用。方法：收集擇期行CABG的患者48例，根據(jù)對ALDH2基因SNP504位點(diǎn)檢測結(jié)果，分為2組：野生型組（攜帶ALDH2野生型基因，n=29）和突變型組（攜帶ALDH2突變型基因，n=19）。收集患者一般資料，采集術(shù)后24 h中心靜脈血檢測心肌肌鈣蛋白I（cTnI）、肌紅蛋白（Mb）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量以及丙二醛（MDA）含量。記錄術(shù)后機(jī)械通氣時(shí)間、術(shù)后ICU住院時(shí)間和術(shù)后24 h變力性藥物使用評分。結(jié)果：2組患者年齡、性別、體質(zhì)量、術(shù)前左室射血分?jǐn)?shù)、CPB時(shí)間、冠脈搭橋數(shù)目比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。野生型組術(shù)后機(jī)械通氣時(shí)間、ICU住院時(shí)間少于突變型組（均P＜0.05）。野生型組術(shù)后24 h cTnI、Mb、CK-MB含量低于突變型組（均P＜0.05）。野生型組MDA含量低于突變型組（P＜0.05）。野生型組術(shù)后24 h變力性藥物使用評分低于突變型組（P＜0.01）。結(jié)論：對于在CPB下行CABG的患者，攜帶ALDH2野生型基因能顯著降低醛類堆積，減少心肌損傷，縮短術(shù)后機(jī)械通氣時(shí)間以及ICU住院時(shí)間，對心肌I/R具有保護(hù)作用。

線粒體乙醛脫氫酶2；體外循環(huán)；冠狀動(dòng)脈搭橋；缺血再灌注損傷；心肌保護(hù)

隨著缺血性心臟病發(fā)生率的增高，冠狀動(dòng)脈搭橋（coronary artery bypass grafting，CABG）手術(shù)作為一種恢復(fù)心臟再灌注的治療手段越來越普及。然而心臟再灌注治療的同時(shí)，心肌缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，I/R）的發(fā)生難以避免[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)線粒體乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）野生型基因?qū)π募/R具有保護(hù)作用[2-4]。對于在體外循環(huán)（cardiopulmonary by-pass，CPB）下行CABG手術(shù)的患者，攜帶ALDH2野生型基因，在發(fā)生心肌I/R時(shí)，是否存在心肌保護(hù)目前還未得到證實(shí)。因此本研究對擇期在CPB下行CABG的患者基因分型，檢測術(shù)后24 h心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、肌紅蛋白（myoglobin，Mb）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes，CK-MB）以及丙二醛（malonclialdehyde，MDA）含量[5-6]，結(jié)合患者臨床指標(biāo)（術(shù)后機(jī)械通氣時(shí)間、術(shù)后ICU住院時(shí)間以及術(shù)后24 h變力性藥物使用評分），比較2種基因型患者術(shù)后心肌損傷程度以及臨床預(yù)后，討論其可能機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 一般資料 由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書，選擇2015年1月至2015年12月在本院擇期在CPB下行CABG的患者48例。ASA分級I I-I I I級。排除心臟二次手術(shù)、嚴(yán)重肝腎疾病、腦血管疾病、慢性阻塞性肺疾病的病例。所有病例均無術(shù)中主動(dòng)脈二次阻斷以及圍術(shù)期嚴(yán)重感染。根據(jù)ALDH2基因分型結(jié)果，將患者分為2組：野生型組（攜帶ALDH2野生型基因）29例，男20例，女9例；突變型組（攜帶ALDH2突變型基因）19例，男12例，女7例。2組患者年齡、性別、體質(zhì)量、術(shù)前左室射血分?jǐn)?shù)、CPB時(shí)間、冠脈搭橋數(shù)目比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 2組患者臨床資料比較（±s）

表1 2組患者臨床資料比較（±s）

1.2 麻醉及手術(shù)方法 患者入手術(shù)室后常規(guī)生命體征監(jiān)護(hù)，開放動(dòng)脈實(shí)時(shí)監(jiān)測血壓，中心靜脈輸液。給予咪唑安定0.3 mg/kg，舒芬太尼0.4 μg/kg，依托咪酯0.25 mg/kg，羅庫溴銨0.9 mg/kg行麻醉誘導(dǎo)，經(jīng)口氣管插管，機(jī)械控制通氣，靜吸復(fù)合維持?麻醉深度。常規(guī)胸骨正中切口、心包切開，經(jīng)中心靜脈導(dǎo)管給予肝素300 U/kg，監(jiān)測激活全血凝固時(shí)間（activated clotting time of whole blood，ACT）值，于主動(dòng)脈及腔房管插管后開始CPB，降溫，阻升主動(dòng)脈，經(jīng)升主動(dòng)脈根部灌注4∶1冷血停搏液，心臟停跳，CPB期間維持平均灌注壓力60～80 mmHg （1 mmHg=0.133 kPa），監(jiān)測鼻咽溫度32～36 ℃。搭橋采用患者自體大隱靜脈吻合血管橋，大隱靜脈橋排氣，開放升主動(dòng)脈，心臟復(fù)跳，魚精蛋白中和肝素，常規(guī)關(guān)胸，機(jī)械通氣送ICU。

1.3 基因檢測 所有病例在麻醉后經(jīng)由中心靜脈導(dǎo)管取血2 mL，采用EDTA抗凝，于-70 ℃冰箱中冷凍保存，該標(biāo)本用于ALDH2基因檢測分型。采用等位基因特異性PCR法進(jìn)行基因檢測：解凍靜脈血，采用血液基因組DNA試劑盒快速提取基因組DNA，產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱保存。獲取DNA后采用多重聚合酶鏈反應(yīng)對ALDH2基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增引物上游5'-AAAATAAAGACTTTGGGGCAATA-3'，下游5'-CTTAAAATGGGAAATTAGTAGGAAAC-3'。按模板DNA 2 μg， 2×MasterMix 25 μL，引物2 μL，雙蒸水補(bǔ)足配成50 μL反應(yīng)體系在ABI7000熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增42個(gè)循環(huán)，再72 ℃延伸6 min。收集目標(biāo)產(chǎn)物，純化產(chǎn)物DNA。使用ABI3130毛細(xì)管測序儀結(jié)合基因測序圖對ALDH2基因SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型[7]。所有試劑均由北京天根生化科技有限公司提供。

1.4 血標(biāo)本采集及檢測 收集患者升主動(dòng)脈開放后24 h靜脈血6 mL，EDTA抗凝，離心后取上清液，分裝2個(gè)試劑管，-20 ℃低溫冰箱保存，采用簡單隨機(jī)抽樣法在2組中分別抽取10例血液標(biāo)本用于生化指標(biāo)檢查，其中cTnI、Mb、CK-MB含量采用FIA8600免疫定量分析儀檢測，試劑由南京基蛋生物科技有限公司提供。MDA含量檢測采用分光光度計(jì)法，試劑由上海齊一生物科技有限公司提供。

1.5 術(shù)后臨床資料 觀察并記錄患者術(shù)后機(jī)械通氣時(shí)間，ICU住院時(shí)間。術(shù)后查閱病歷資料，記算患者術(shù)后24 h變力性藥物使用評分，計(jì)算公式：變力性藥物評分=多巴胺劑量+多巴酚丁胺劑量+腎上腺素劑量×100+米力農(nóng)劑量×10+去氧腎上腺素劑量×100+去甲腎上腺素劑量×100[8]，公式中所有藥物單位均為μg/（kg?min）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，2組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后機(jī)械通氣時(shí)間及ICU住院時(shí)間 野生型組術(shù)后機(jī)械通氣時(shí)間顯著少于突變型組（P＜0.05）。野生型組術(shù)后ICU住院時(shí)間顯著少于突變型組（P＜0.01）。見表1。

2.2 術(shù)后24 h cTnI、Mb、CK-MB、MDA含量 術(shù)后24 h野生型組cTnI含量顯著低于突變型組（P＜0.05）；野生型組Mb含量顯著低于突變型組（P＜0.05）；野生型組CK-MB含量顯著低于突變型組（P＜0.05）；野生型組心肌毒性醛類物質(zhì)MDA含量顯著低于突變型組（P＜0.05）。見表2。

表2 2組患者術(shù)后24 h血液標(biāo)本檢測結(jié)果（n=10，±s）

表2 2組患者術(shù)后24 h血液標(biāo)本檢測結(jié)果（n=10，±s）

與突變型組比：aP＜0.05

2.3 術(shù)后24 h變力性藥物使用評分 術(shù)后24 h變力性藥物使用評分野生型組（9.11±3.34）分，突變型組（12.59±4.82）分，2組比較野生型組顯著低于突變型組（P＜0.01）。

3 討論

隨著中國人口老齡化的趨勢，老年患者CPB下行CABG的人數(shù)逐漸增多。搭橋手術(shù)過程中心肌I/R機(jī)制一直以來是研究熱點(diǎn)[9]。研究發(fā)現(xiàn)活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）攻擊人體內(nèi)脂質(zhì)導(dǎo)致過氧化產(chǎn)生毒性醛類物質(zhì)是心肌I/R的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10]。

ALDH2是醛類代謝的關(guān)鍵酶，通過將毒性醛轉(zhuǎn)化為無毒性的羧酸起到保護(hù)作用[11]。人類編碼ALDH2的基因第12號外顯子504位點(diǎn)存在A被G替代的SNP，由此導(dǎo)致野生型基因（編碼的酶活性正常）和突變型基因（編碼的酶活性降低或者散失）的差異[12]。2008年Chen等[10]研究發(fā)現(xiàn)激活A(yù)LDH2酶活性，降解毒性醛，可以減輕大鼠心肌缺血損傷。2012年Zhang等[5]通過對先天性心臟病的患兒研究發(fā)現(xiàn)，攜帶ALDH2突變型基因?qū)π募∪毖獡p傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與醛類堆積激活谷胱甘肽氧化還原通路導(dǎo)致心肌保護(hù)有關(guān)。對于這2種截然不同的心肌保護(hù)通路，目前仍存在爭議。那么對于攜帶ALDH2不同基因型的老年患者，施行CPB下CABG，心肌保護(hù)是否存在差異？本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶ALDH2野生型基因?qū)π募/R具有保護(hù)作用。

cTnI是檢測心肌損傷實(shí)效性、敏感性、特異性均良好的指標(biāo)，由于與骨骼肌細(xì)胞中的TnI編碼基因不同，其評價(jià)心肌損傷特異性高達(dá)97%以上，其在術(shù)后4～6 h升高，20～24 h達(dá)到高峰[13-14]。Mb是心臟外科手術(shù)患者術(shù)后心肌損傷早期診斷靈敏指標(biāo)，術(shù)后2 h即可升高，12～24 h達(dá)到高峰，36 h即恢復(fù)正常[15]。CK-MB也是早期診斷心肌損傷的標(biāo)志物，對于心肌不可逆損傷具有較強(qiáng)說服力，4～6 h出現(xiàn)，12～36 h達(dá)高值[15]。結(jié)合cTnI、Mb、CK-MB綜合評價(jià)心肌損傷更具有臨床意義，是臨床中作為術(shù)后心肌損傷評價(jià)的重要指標(biāo)。本研究中由于實(shí)驗(yàn)對象的限制，無法多點(diǎn)采集血液標(biāo)本，在各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)高峰即術(shù)后24 h取血化驗(yàn)。結(jié)果顯示，野生型組患者術(shù)后24 h cTnI、Mb、CK-MB含量均顯著低于突變型組，說明攜帶野生型基因患者心肌損傷程度較突變型組輕。同時(shí)野生型組患者術(shù)后較短的機(jī)械通氣時(shí)間、ICU住院時(shí)間以及術(shù)后24 h變力性藥物使用評分也說明了攜帶野生型基因患者術(shù)后恢復(fù)更好。

MDA是醛類的一種，是心肌I/R中最常見的毒性醛類，易通過Michaels加成反應(yīng)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子物質(zhì)結(jié)合影響生物活性從而導(dǎo)致心肌損傷。在本研究中，野生型組術(shù)后24 h血液MDA含量少于突變型組，可能與野生型組表達(dá)的ALDH2活性較高有關(guān)，高活性的ALDH2通過代謝更多的MDA，降低心臟毒性，從而減少了心肌損傷。

總之，通過本研究發(fā)現(xiàn)，在CPB下行CABG中，攜帶ALDH2野生型基因患者毒性醛堆積更少，心肌損傷程度更低，術(shù)后恢復(fù)更快，ALDH2野生型基因?qū)π募/R有保護(hù)作用。

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（本文編輯：吳昔昔）

Effect of mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2 genotype on cardio-protection in patients with coronary artery bypass grafting

ZHANG Yujian1, DAI Yiru1,2, XIA Fangfang1, LIU Le1, XU Xuzhong1.
1.Department of Anesthesiology, the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Anesthesiology, Chinese Traditional and Western Medicine Hospital, Wenzhou, 325000

Objective: To investigate the clinical effect of ALDH2*1 allele on cardio-protection of patients with coronary artery bypass grafting (CABG).Methods: Forty eight patients undergone simple CABG were divided into 2 group: ALDH2*1 (n=29) and ALDH2*2 (n=19), according to the results of ALDH2 gene SNP504 detection.24 hours after operation, blood sample were taken for the measurement of cTnI, Mb, CK-MB and MDA.Postoperative mechanical ventilation time, ICU length of stay and postoperative 24 h cardiac drug use score were recorded.Results: There was no difference in the patient’s data among two groups, including age, body weight, ejection fractions and operation time.ALDH2*1 carriers showed lower cTnI, Mb, CK-MB and MDA, and shorter postoperative mechanical ventilation time, ICU length of stay and postoperative 24 h cardiac drug use score.Conclusion: ALDH2*1 allele protects against myocardium injury during open heart surgery cardiopulmonary bypass.The mechanism may be related to ALDH2 enzymes metabolism of toxic aldehydes.

mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2; extracorporeal circulation; coronary artery bypass grafting; ischemic reperfusion injury; myocardial protection

Q319.1；R339.34

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.12.010

2016-03-14

浙江省科技廳課題（2012C24018）。

張?jiān)?jiān)（1984-），男，福建古田人，住院醫(yī)師，碩士。

徐旭仲，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：xuzh ong@263.net。