5-FU-PLGA復(fù)乳微球的制備及體外釋放

黃慧玲，李 益，王 玥，魏振平

（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072）

5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是治療消化道癌癥的首選藥物，臨床上主要用于治療胃、肝、腸等多種癌癥。但其本身存在治療劑量大，不良反應(yīng)多如胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制等［1-2］安全性問題。另外5-FU的半衰期只有10～20 min，在體內(nèi)滯留時間短，口服吸收不完全，生物利用度低［3-4］，故需要頻繁給藥。為了降低5-FU的毒性，延長半衰期，減少給藥次數(shù)，提高生物利用度，本研究包含5-FU的可生物降解緩釋微球的制備工藝。

復(fù)乳在藥劑學(xué)、食品等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。W/O/W型復(fù)乳是具有兩膜三相結(jié)構(gòu)的多相體系，包括內(nèi)水相、油相和外水相，在相界面處有內(nèi)油水界面膜和外油水界面膜，可以將一些性質(zhì)不同的物質(zhì)溶解在不同的相中，起到隔離、保護、緩釋、控釋、靶向釋放等效果［5-7］。本實驗中將 5-FU包入W/O/W型復(fù)乳中制備微球。

復(fù)乳本質(zhì)上是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，儲存和使用過程中極易發(fā)生絮凝、聚結(jié)和分層，同時還有很多因素會影響復(fù)乳的穩(wěn)定性，使復(fù)乳的實際應(yīng)用受到許多限制［8-11］。本研究采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法，以乳層保留率為指標(biāo)，單因素考察了第一相體積比、第二相體積比對復(fù)乳穩(wěn)定性的影響。在此基礎(chǔ)上，以包封率為指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計表優(yōu)化處方組成與制備工藝，并對制備的5-FU復(fù)乳微球進行了考察。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），相對分子質(zhì)量為30000，單體比50∶50，濟南岱罡生物科技有限公司；二氯甲烷，分析純，天津大學(xué)科威新材料科技開發(fā)公司；泊洛薩姆188，藥用級，山東聊城安信藥用輔料有限公司。

JD 100-3多功能電子天平，沈陽龍騰電子有限公司；765紫外-可見分光光度計，上海精密儀器科技有限公司；XW-80A型旋渦混合器，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；HZS-H超級恒溫水浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子科技開發(fā)有限公司；DT5-6型臺式離心機，北京時代北利離心機有限公司；SCIENTZ-ΠD型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；BT-1600圖像顆粒分析系統(tǒng)，丹東市百特儀器有限公司；ALPHA 1-2冷凍干燥機，德國 CHRIST公司。

1.2 初乳和復(fù)乳制備

將適量5-FU加入 NaOH水溶液中，作為內(nèi)水相，將其加入含 PLGA的二氯甲烷油相中，超聲1 min，制得初乳。將初乳加入1%泊洛薩姆水溶液中，190 Hz超聲1 min，制得復(fù)乳，繼續(xù)攪拌使二氯甲烷揮發(fā)。2500 r/min離心10 min收集微球［12-14］。用蒸餾水洗滌后再次離心。移去上清液后，取下層沉淀物，真空冷凍干燥，即得5-FU PLGA微球。

1.3 復(fù)乳穩(wěn)定性的初步研究

復(fù)乳界面上的乳化劑容易在油相中遷移而重新分配，影響復(fù)乳穩(wěn)定性。本研究采用單因素實驗考察第一相體積比（內(nèi)水相與油相）、第二相體積比（第一相與外水相）對復(fù)乳穩(wěn)定性的影響。首先固定內(nèi)水相的體積，按照1.2項下制備工藝，設(shè)定內(nèi)水相、油相體積比分別為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3和1∶4，855 Hz超聲1 min，制得初乳。再向初乳中加入適量泊洛薩姆水溶液，設(shè)定初乳與外水相的體積比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5，380 Hz超聲 1 min，制得復(fù)乳。將初乳和復(fù)乳分別離心，測定離心管中的總物料體積及析出的連續(xù)相體積，用離心后的乳層保留率評價其穩(wěn)定性［15-17］。乳層保留率［18-20］的計算見式（1）。

1.4 處方與制備工藝優(yōu)化

1.4.1 評價指標(biāo)的確定

以包封率為評價指標(biāo)，優(yōu)化微球處方和工藝。通過紫外分光光度計測定殘留水層中5-FU的吸光值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出5-FU的含量，計算包封率，見式（2）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精確稱取5-FU 20.02 mg，用0.1 mol/L NaOH溶液溶解并定容，作為母液。將母液稀釋配制成 4.00、8.01、10.01、12.01、14.01 和16.02μg/mL一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其在266 nm處的吸收值，以濃度（C）為橫坐標(biāo)、吸光值（A）為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行線性回歸，得回歸方程：A=0.03317C+0.05451，r2=0.9991。結(jié)果表明 5-FU濃度在4.00～16.02μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.4.2 工藝參數(shù)的優(yōu)化

在單因素考察的基礎(chǔ)上，以包封率為評價指標(biāo)，選擇攪拌溫度（A）、攪拌時間（B）、PLGA在有機相中濃度（C）、輔料濃度（D）4個因素，每個因素選擇3水平，按 L9（34）正交試驗設(shè)計表設(shè)計 9組實驗，篩選最適宜處方組成和制備工藝。

1.5 微球質(zhì)量考察

1.5.1 形態(tài)與粒度

取1滴微球混懸液滴到載玻片上，顯微鏡下采集圖片并用BT-1600型圖像顆粒分析儀分析微球的形態(tài)、粒徑及其粒度分布。

1.5.2 包封率和載藥量

精密稱取10.03 mg微球溶于0.5mL二氯甲烷中，完全溶解后加入4.5mL NaOH溶液并混勻，然后14500 r/min離心10 min除去載體材料，取上清液并用生理鹽水（pH值為7.4）稀釋10倍。用紫外分光光度計測定藥物吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算5-FU含量，進而計算包封率和載藥量，見式（3）。

1.5.3 體外釋放

本實驗采用恒溫水浴振蕩器，精密稱取20.02 mg微球置于準(zhǔn)備好的透析袋中，往透析袋中加5mL生理鹽水，放于含有45mL生理鹽水（pH值為7.4）的錐形瓶中，控制溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，分別于 30 min、1、2、3、4、5、10 和24 h 等時間點取5mL釋放介質(zhì)于西林瓶中，補加同體積的同溫生理鹽水，在266 nm處測定吸光值。其中第n個點的累積釋放率見式（4）。

其中m為所加樣品中藥物質(zhì)量，Cn為第n個點的藥物濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)乳的穩(wěn)定性考察

2.1.1 第一相體積比的考察

第一相的制備過程中未使用乳化劑，內(nèi)水相與油相體積比對5-FU初乳穩(wěn)定性的影響見表1。

由表1可知，隨著內(nèi)水相體積減小，初乳的穩(wěn)定性先提高后降低，這是因為內(nèi)水相體積過大時，油膜相對較薄，不能對內(nèi)水相起到足夠的保護作用，乳滴容易破裂，穩(wěn)定性差。當(dāng)內(nèi)水相與油相的體積比減小到1∶2時，穩(wěn)定性最好。體積比繼續(xù)減小，有效油相流動性增強，使初乳穩(wěn)定性降低，故最適宜第一相體積比為1∶2。

表1 第一相體積比對初乳穩(wěn)定性的影響Table 1 Influence of the first phase volume ratio on the stability of primary emulsion

2.1.2 第二相體積比的考察

第二相的制備過程中以泊洛沙姆作為乳化劑，初乳與外水相體積比對復(fù)乳的穩(wěn)定性結(jié)果見表2。

表2 第二相體積比對復(fù)乳穩(wěn)定性的影響Table 2 Influence of the second phase volume ratio on the stability of double emulsion

由表2可知，隨著初乳相與外水相的體積比降低，復(fù)乳的穩(wěn)定性下降。這是由于初乳體積分?jǐn)?shù)較小時，乳液的黏度較小，不利于穩(wěn)定；初乳體積分?jǐn)?shù)逐漸增大，體系黏度增大，甚至表現(xiàn)出凝膠狀態(tài)，復(fù)乳穩(wěn)定性提高，但是流動性較差，且容易聚結(jié)、轉(zhuǎn)相，使復(fù)乳的結(jié)構(gòu)破壞；當(dāng)初乳與外水相的體積比接近疏堆積的相體積分?jǐn)?shù)時，乳液最穩(wěn)定［19］。故為得到相對穩(wěn)定的復(fù)乳微球，選擇最適宜第二相體積比為1∶1。

2.2 處方制備與工藝優(yōu)化

2.2.1 因素水平的確定

在預(yù)實驗中單因素考察的基礎(chǔ)上，第一相體積比為1∶2，第二相體積比為1∶1。選定攪拌溫度（A）、攪拌時間（B）、有機相載體材料濃度（C）和輔料濃度（D）為正交設(shè)計考察的因素。因素水平表見表3。

2.2.2 工藝參數(shù)的優(yōu)化

采用L9（34）正交設(shè)計表安排9組實驗，以包封率為評價指標(biāo)，考察各因素對指標(biāo)的影響，確定最優(yōu)處方。正交試驗結(jié)果見表4。極差越大，表明各因素的影響越大。由此可知各因素對微球包封率的影響程度排序為A＞D＞C＞B。

由表3可知，攪拌溫度對微球包封率的影響最大。隨著外水相溫度的升高，微球粒徑有減小的趨勢，原因可能是高溫使分散相的黏度降低，有利于O/W乳滴的分散。升高溫度，可加快溶劑揮發(fā)，微球包封率提高，結(jié)果與文獻報道一致［21］。但是高溫過高時，微球表面快速固化，易產(chǎn)生孔洞，導(dǎo)致包封率降低。

表3 因素水平表Table 3 Factors and levels

輔料的濃度在微球的穩(wěn)定性過程中有一最佳值0.5%。當(dāng)溶液中泊洛沙姆的濃度增大時，表面張力不斷下降，有利于藥物包封率的提高。若繼續(xù)增大泊洛沙姆的濃度，其達到一定值后對微球質(zhì)量影響不大，此時乳化劑分子在水溶液中可能會形成球狀和棒狀膠團，不再起到更好的乳化效果。

隨著藥酯比的增加，微球的包封率有增大趨勢。但是當(dāng)藥物量超過其在二氯甲烷中的飽和濃度時，過量的藥物形成沉淀不會被包入微球中。制備時間對微球粒徑的影響最小。原因可能是微球表面的快速固化阻礙了藥物向外水相的流失，因此即使延長固化時間，也不會有藥物泄露。

制備微球的最適宜因素水平組合為：A1-B3-C2-D2，即攪拌溫度10℃、攪拌時間6 h、PLGA在有機相中濃度為15%、輔料濃度為0.5%。

表4 正交實驗設(shè)計結(jié)果Table 4 Results of orthogonal design

2.3 微球質(zhì)量考察

2.3.1 形態(tài)與粒徑

按優(yōu)選處方制備微球，所得微球為乳白色粉末狀。目測凍干微球色澤為白色，顏色均勻，無花斑，表面光滑細膩，較疏松，流動性良好，再分散性良好。將微球溶于蒸餾水中，制成混懸液，滴1滴于載玻片，分布均勻，用BT-1600型圖像顆粒分析儀分析微球形態(tài)。放大5倍，見清晰的復(fù)乳照片，如圖1。

圖1 微球的照片及放大5倍后微球的照片F(xiàn)ig.1 Figures of the microspheres and（×5）of microspheres

粒度分布結(jié)果和微球圓形度見圖2和圖3。

圖2 微球的粒徑分布Fig.2 The particle size distribution of the microspheres

圖3 微球的圓形度Fig.3 The sphericity of the microspheres

由結(jié)果可知，最適宜處方的平均粒徑為5.05μm，圖2中顆粒數(shù)目 477，最大顆粒 60.39 μm，最小顆粒0.83μm，圓形度0.72，長徑比1.29。由此可見，優(yōu)選處方的微球圓整度較好，且粒徑較均勻。

2.3.2 包封率和載藥量

按照優(yōu)選的處方制備3批微球，包封率和載藥量結(jié)果見表5。

表5 微球的包封率和載藥量Table 5 Entrapment efficiency and drug loading of microspheres

由表5可知，最適宜工藝制備的5-FU PLGA微球重現(xiàn)性較好，平均粒徑5.20μm，載藥量5.34%，包封率為77.22%。

2.3.3 體外釋放

微球體外釋放結(jié)果見圖4。

圖4 微球體外釋放曲線Fig.4 The in vitro release profile of microsphere

微球在0.5 h的釋藥率為6.89%，不存在明顯的突釋現(xiàn)象。微球在48 h內(nèi)釋藥速度相對較快，釋放了約50%的藥量，之后釋藥速度變慢。20 d的累積釋放率為87.03%，而原藥10 h已釋放完全，表現(xiàn)出明顯的緩釋效果。

分別按零級、一級、Higuichi方程擬合釋藥行為，經(jīng)回歸處理得直線方程：

擬合結(jié)果表明微球體外釋放行為較符合Higuchi模型，這與有關(guān)文獻的報道［22-23］一致。

3 結(jié)論

本研究采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備5-FU-PLGA微球，采用單因素試驗和正交設(shè)計考察處方與制備工藝對復(fù)乳穩(wěn)定性和微球質(zhì)量的影響。結(jié)果表明第一相體積比1∶2、第二相體積比1∶1時，可制備相對穩(wěn)定的微球。PLGA濃度為15%、輔料濃度為0.5%、攪拌溫度為10℃，攪拌時間為6 h時，制備的微球重現(xiàn)性好，粒徑均勻，圓整度好，平均粒徑5.20μm，包封率在70%以上。微球體外釋放實驗顯示釋放行為符合Higuchi模型，具有較好的緩釋特性。與文獻［22-23］中制備的微球比較，本研究制備的微球粒徑更小（為5.20μm），可進一步制成注射劑等，具有更廣泛的用途。

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