組織工程醫(yī)療產(chǎn)品質(zhì)量控制的關(guān)鍵技術(shù)要求和標(biāo)準(zhǔn)

王春仁　馮曉明　韓倩倩　中國食品藥品檢定研究院?。ū本?00050）

組織工程醫(yī)療產(chǎn)品質(zhì)量控制的關(guān)鍵技術(shù)要求和標(biāo)準(zhǔn)

王春仁馮曉明韓倩倩中國食品藥品檢定研究院（北京100050）

內(nèi)容提要： 我國組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的研發(fā)迅速，已逐漸從實(shí)驗(yàn)室階段進(jìn)入臨床研究階段，有的產(chǎn)品已經(jīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，如何控制組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的安全性和有效性是實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。本文對組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的種子細(xì)胞來源、細(xì)胞的質(zhì)量控制、培養(yǎng)基、材料支架表征等質(zhì)量控制的關(guān)鍵技術(shù)要求和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了綜述。

組織工程 組織工程醫(yī)療產(chǎn)品安全性有效性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

0.前言

組織工程醫(yī)療產(chǎn)品（tissue engineered medical products，TEMPs）是指用組織工程技術(shù)和工藝制備的，用于修復(fù)、改善、再生組織或器官結(jié)構(gòu)與功能的醫(yī)用產(chǎn)品。組織工程醫(yī)療產(chǎn)品通常是復(fù)合產(chǎn)品，細(xì)胞及細(xì)胞類成分是TEMPs的重要組成部分，因此，細(xì)胞與TEMPs產(chǎn)品的質(zhì)量和安全密切相關(guān)。我國TEMPs的研究發(fā)展迅速，已逐漸從實(shí)驗(yàn)室階段開始進(jìn)入臨床研究階段，因此，如何控制用于TEMPs產(chǎn)品生產(chǎn)的質(zhì)量和安全，如何制定TEMPs的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不僅對于保證TEMP產(chǎn)品的安全性具有重要意義，也可以促進(jìn)我國TEMPs產(chǎn)品的健康發(fā)展，解決組織工程產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的瓶頸問題。在國家科技項(xiàng)目的支持下，中國藥品生物制品檢定所組織我國組織工程方面的專家、管理人員和科研工作者起草了組織工程產(chǎn)品的質(zhì)量和安全評價(jià)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，其中12個(gè)標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)報(bào)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)發(fā)布實(shí)施。對于組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的研究、開發(fā)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展起到了促進(jìn)和指導(dǎo)作用。

1.種子細(xì)胞的質(zhì)量控制

生產(chǎn)過程中所使用的各種組份應(yīng)提供來源、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其所進(jìn)行的檢測項(xiàng)目；應(yīng)詳細(xì)說明生產(chǎn)過程中所用的各種試劑，是人源還是動物來源，豬源材料是否進(jìn)行了豬細(xì)小病毒檢測，反芻動物來源是否在可能污染牛海綿狀腦炎病毒，所用試劑是否獲得了FDA的批準(zhǔn)，如果所用試劑是研究級試劑，應(yīng)提供其來源、安全性及性能資料。如無菌試驗(yàn)、內(nèi)毒素、支原體，及外源因子檢測結(jié)果，進(jìn)行功能性分析、純度檢測，有害殘留溶劑檢測結(jié)果。如果這些試劑已知有或潛在有毒性，則需對工藝進(jìn)行驗(yàn)證，確保在終產(chǎn)品中已無這些試劑殘留。

對同種異體或自體細(xì)胞應(yīng)說明細(xì)胞來源的組織及細(xì)胞類型；是否進(jìn)行過體內(nèi)動員及其所用的動員方法；細(xì)胞采集所用的具體方法；采集單位的名稱及地址，供體篩查的內(nèi)容、方法及結(jié)果以評價(jià)供體資質(zhì)；對于自體供體，如果供體某種病原體檢測為陽性，或未進(jìn)行篩查，則需有記錄可以說明在產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中，組織培養(yǎng)方法是否會造成病毒或其他外源因子的增殖或傳播而危及到其他人。對于同種異體，應(yīng)進(jìn)行病毒篩查，如HIV-I/II，HBV、HCV、HTLV-I/II、CMV、EBV的檢測等，并記錄所用試劑及檢測方法。

如果在生產(chǎn)過程中使用了細(xì)胞系，則應(yīng)記錄細(xì)胞系歷史、來源、分離、檢定及主細(xì)胞庫（MCB）和工作細(xì)胞庫（WCB）檢定頻率。主細(xì)胞包括：①外源因子污染的檢測，如無菌試驗(yàn)、支原體檢測、體內(nèi)及體外法的外源病毒檢測；②特殊病原體的檢測，人源細(xì)胞應(yīng)檢測CMV、HIV-I/ II，HBV、HCV、HTLV-I/II、EBV，牛和/或豬外源因子，應(yīng)均為陰性；③細(xì)胞鑒別或均一性檢測，如細(xì)胞表型、基因型或其他標(biāo)記；④細(xì)胞純度檢測；⑤細(xì)胞活性及細(xì)胞成熟性檢測；⑥記錄細(xì)胞培養(yǎng)條件，如所用培養(yǎng)基、試劑或組份及其檢測報(bào)告；⑦記錄細(xì)胞凍存、運(yùn)輸、復(fù)蘇的內(nèi)容，如細(xì)胞密度、凍存支數(shù)、凍存溫度、細(xì)胞庫位置；⑧多次傳代后細(xì)胞遺傳及表型穩(wěn)定性及復(fù)蘇后細(xì)胞存活率。工作細(xì)胞庫包括：①細(xì)菌、真菌污染的檢測；②支原體檢測；③一定的鑒別試驗(yàn)。

對生產(chǎn)工藝應(yīng)描述自體或同種異體細(xì)胞采集、加工方法及細(xì)胞培養(yǎng)條件，包括細(xì)胞采集體積、物理或酶消化步驟、所用細(xì)胞篩選或分離儀器，培養(yǎng)系統(tǒng)、在線檢測；對于采用放射性照射的體細(xì)胞治療產(chǎn)品，應(yīng)提供細(xì)胞照射后仍具有其特性但無復(fù)制能力的數(shù)據(jù)，放射源的校正；應(yīng)詳細(xì)記錄從細(xì)胞收集到最終收獲間每一步的時(shí)間間隔，從細(xì)胞采集到最后收獲間細(xì)胞保存的時(shí)間及條件，保持細(xì)胞穩(wěn)定性的操作程序；應(yīng)詳細(xì)描述細(xì)胞收獲的過程，細(xì)胞收獲方法、洗滌條件及洗滌介質(zhì)，如果要凍存，應(yīng)說明凍存的條件及保存時(shí)限；應(yīng)提供終產(chǎn)品的配方，應(yīng)說明在最終制劑中是否添加生長因子或人血清白蛋白，并注明其來源、供貨商、終濃度。提供終產(chǎn)品中細(xì)胞濃度、運(yùn)輸條件等相關(guān)數(shù)據(jù)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基的要求

培養(yǎng)基及其添加成份為細(xì)胞體外培養(yǎng)提供生長所需的營養(yǎng)成份，也是引入外源因子而造成細(xì)胞污染的來源之一，從而也是影響細(xì)胞安全性的一個(gè)因素，因此，控制培養(yǎng)基的質(zhì)量是減少細(xì)胞污染提供產(chǎn)品安全性的一個(gè)重要措施。對培養(yǎng)基的要求分為兩個(gè)方面，即基礎(chǔ)培養(yǎng)基及其所添加的各種成份。細(xì)胞、組織及器官的生長、維持用的所有培養(yǎng)基及試劑應(yīng)盡可能采用可用于臨床的培養(yǎng)基及試劑，至少應(yīng)選擇具有良好資質(zhì)供應(yīng)商購買，而且，盡可能選擇非動物來源的或不含動物來源組份的培養(yǎng)基及試劑。

如果培養(yǎng)基中要添加人源成份，如各種細(xì)胞因子，應(yīng)盡可能選擇已獲得國家批準(zhǔn)的臨床用產(chǎn)品。如果無法獲得國家批準(zhǔn)的臨床用產(chǎn)品，則盡可能從符合GMP要求的供應(yīng)商購買，同時(shí)應(yīng)建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并對其進(jìn)行檢測。人源材料還應(yīng)檢測包括人乙型肝炎病毒（HBV），人丙型肝炎病毒（HCV），人免疫缺陷病毒I/II型（HIVI/II）及梅毒螺旋體等病原微生物可能造成的污染。

如果培養(yǎng)基中必須添加動物源性成份，如動物源性激素或細(xì)胞因子等，則至少應(yīng)充分證明這些培養(yǎng)基或試劑的制備過程采用了病毒滅活工藝，而且病毒滅活工藝經(jīng)過了充分的驗(yàn)證具有有效的的滅活效果。

如果在細(xì)胞培養(yǎng)過程中必須使用動物來源的細(xì)胞、組織及其衍生物等生物活性材料，如作為飼養(yǎng)細(xì)胞，則這些成份應(yīng)從特定的動物飼養(yǎng)單位獲取。如從封閉的無病原體種群的動物獲取，而且應(yīng)對原種進(jìn)行監(jiān)測并定期進(jìn)行病原微生物的檢測。

關(guān)于血清及抗生素的使用，各個(gè)國家的要求稍有所不同。但從血清安全性的角度考慮，培養(yǎng)基中應(yīng)避免使用任何血清。但如果有些細(xì)胞在培養(yǎng)過程中必須添加血清激活或誘導(dǎo)，如牛血清，則必須對每批牛血清進(jìn)行外源因子的檢測，應(yīng)至少包括無菌、支原體及牛源性病毒檢測，而且應(yīng)驗(yàn)證生產(chǎn)過程不會造成牛源性病毒的擴(kuò)增。而為保證細(xì)胞的穩(wěn)定性，特別是長期培養(yǎng)細(xì)胞的穩(wěn)定性，并能及時(shí)發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)環(huán)境及生產(chǎn)過程中可能造成的污染，用于生產(chǎn)的培養(yǎng)基中應(yīng)盡可能不使用抗生素。

3.材料和支架的要求

為滿足組織工程產(chǎn)品預(yù)期設(shè)計(jì)的性能達(dá)到要求，在產(chǎn)品設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)考慮以下要點(diǎn)：材料及支架的生物相容性應(yīng)符合GB/T16886系列標(biāo)準(zhǔn)的要求；材料及支架的物理、力學(xué)和化學(xué)特性應(yīng)根據(jù)預(yù)期用途的性能要求選擇合適的材料，并考慮制造、處理、滅菌和貯存對材料的影響。當(dāng)藥物作為組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的組成部分時(shí)，對其應(yīng)按照藥品法規(guī)進(jìn)行評價(jià)。作為組成部分的藥物的原有性能不應(yīng)受組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的影響，反之亦然。

組織工程醫(yī)療產(chǎn)品使用的材料，包括遺傳工程生產(chǎn)的生物材料，應(yīng)在植入狀態(tài)時(shí)具有可接受的生物相容性。根據(jù)GB/T16886.1的原則進(jìn)行評價(jià)或從在相似的臨床應(yīng)用中已證實(shí)的合適材料中選擇。評價(jià)的主要指標(biāo)有細(xì)胞毒性、致敏試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激試驗(yàn)、全身毒性試驗(yàn)、血液相容性試驗(yàn)、遺傳毒性、植入試驗(yàn)、致癌試驗(yàn)、生殖與發(fā)育毒性和生物降解試驗(yàn)。

應(yīng)對支架材料的以下指標(biāo)進(jìn)行表征：降解特性；孔隙率和孔隙大小；形態(tài)結(jié)構(gòu)；細(xì)胞粘附；化學(xué)成分；分子量；滅菌適宜性；力學(xué)特性；儲存條件和時(shí)間。

制造過程中如果使用其他輔助材料，應(yīng)對加工過程中使用的其他輔助材料和設(shè)備的質(zhì)量進(jìn)行適宜性評價(jià)。

對動物或人體來源的材料可能的傳染性因子傳播帶來的危險(xiǎn)性進(jìn)行評價(jià)，包括非細(xì)菌和非病毒性因子。生物源性材料還應(yīng)進(jìn)行免疫源性評價(jià)。

用于組織工程的可降解生物醫(yī)用材料有兩大類：一類是來源于動物和植物組織的天然生物材料，主要有膠原蛋白、糖氨聚糖、殼聚糖、海藻酸鹽、纖維蛋白等。天然材料通常具有良好的生物相容性，并且具有一定的生物活性和細(xì)胞外基質(zhì)的作用，適合細(xì)胞的生長和分化的要求。這些材料可以在生物體內(nèi)酶的作用下將其降解，其降解產(chǎn)物常是體內(nèi)存在的物質(zhì)對人體沒有毒性，缺陷是天然材料的力學(xué)強(qiáng)度有時(shí)不能滿足要求。有的可能存在傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，有的還具有一定的免疫原性問題；另一類可降解材料是合成的生物材料，主要有聚α-羥基酸包括聚乳酸、聚羥基乙酸、聚ε-已內(nèi)酯聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸等。這些材料在含有水的人體內(nèi)環(huán)境中能被生物酶水解分解，高分子主鏈斷裂，分子量逐漸減少，最終成為單體或分解成水和二氧化碳。合成材料也有較好的生物相容性，但在支持細(xì)胞粘附和生長方面不及天然材料，合成材料沒有抗原性和傳染疾病的風(fēng)險(xiǎn)，其力學(xué)強(qiáng)度可以根據(jù)需要合成。

天然材料和合成材料各有優(yōu)缺點(diǎn)，因此在實(shí)際使用時(shí)常采用天然材料和合成材料的復(fù)合型材料，以滿足組織工程支架各個(gè)方面的要求。在組織工程中除考慮材料的化學(xué)性質(zhì)和物理特性外，還應(yīng)該考慮支架的結(jié)構(gòu)，如空隙狀態(tài)、大小、連通性、空隙率、力學(xué)強(qiáng)度等。支架的這些要求對于細(xì)胞的粘附和生長，以及細(xì)胞所需營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和代謝產(chǎn)物的交換是很重要的。一般要求組織工程支架的空隙率在80%以上，孔徑在100～500μm，空隙之間應(yīng)有良好的貫通性。

4.組織工程醫(yī)療產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)

已有12個(gè)組織工程相關(guān)的質(zhì)量和安全評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)發(fā)布實(shí)施：（1）YY0606.3-2007組織工程醫(yī)療產(chǎn)品通用分類指南，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了組織工程產(chǎn)品的各個(gè)方面，包括：組織工程的定義和范圍、產(chǎn)品分類、組成成分、產(chǎn)品表征、評價(jià)分析、微生物安全以及傳染性物質(zhì)的要求以及檢測方法。（2）YY0606.4-2007組織工程皮膚產(chǎn)品分類指南，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用來治療皮膚損傷，替代恢復(fù)皮膚成分和功能的組織工程產(chǎn)品和材料的術(shù)語和分類標(biāo)準(zhǔn)。（3）YY0606.5-2007組織工程醫(yī)療產(chǎn)品用基質(zhì)材料和支架表征和測試指南，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了組織工程醫(yī)療產(chǎn)品用基質(zhì)材料和支架的理化性能的技術(shù)要求。（4）YY0606.12-2007用于組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的細(xì)胞、組織及器官加工處理指南，本標(biāo)準(zhǔn)主要規(guī)定了用于組織工程醫(yī)療產(chǎn)品的細(xì)胞、組織和器官的加工處理、檢定生產(chǎn)以及質(zhì)量保證。（5）YY0606.9-2007組織工程醫(yī)療產(chǎn)品用透明質(zhì)酸鈉，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了組織工程產(chǎn)品的支架材料的原材料之一透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)對材料的理化性能和生物性能作出了規(guī)定，達(dá)到醫(yī)用級水平，滿足組織工程產(chǎn)品生產(chǎn)的需要。（6）YY0606.8-2008組織工程醫(yī)療產(chǎn)品用海藻酸鈉，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了組織工程產(chǎn)品的支架材料的原材料之一海藻酸鈉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)對材料的理化性能和生物性能作出了規(guī)定，達(dá)到醫(yī)用級水平，滿足組織工程產(chǎn)品生產(chǎn)的需要。（7）YY0606.10-2008骨誘導(dǎo)材料評價(jià)指南，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定脫鈣同種異體骨體內(nèi)誘導(dǎo)骨形成的試驗(yàn)方法。（8）YY0606.13-2008細(xì)胞自動計(jì)數(shù)指南，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定組織工程用細(xì)胞的自動計(jì)數(shù)的方法。（9）YY/ T0606.14-2014組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第14部分：評價(jià)基質(zhì)及支架免疫反應(yīng)的試驗(yàn)方法-ELISA法。（10）YY/T0606.15-2014組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第15部分：評價(jià)基質(zhì)及支架免疫反應(yīng)的試驗(yàn)方法-淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。（11）YY/T0606.20-2014組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第20部分：評價(jià)基質(zhì)及支架免疫反應(yīng)的試驗(yàn)方法-細(xì)胞遷移試驗(yàn)。（12）YY/ T0606.25-2014組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第25部分：動物源生物材料DNA殘留量測定法：熒光染色法。

風(fēng)險(xiǎn)管理也是醫(yī)療器械安全性保障的重要組成部分，企業(yè)應(yīng)建立和保持與組織工程醫(yī)療產(chǎn)品有關(guān)的危害、識別和評價(jià)相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，控制這些風(fēng)險(xiǎn)并監(jiān)視控制有效性的過程。這個(gè)過程應(yīng)形成文件并包括下列要素：風(fēng)險(xiǎn)識別；風(fēng)險(xiǎn)分析；風(fēng)險(xiǎn)控制和生產(chǎn)后的信息。風(fēng)險(xiǎn)管理按照醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《YY/T0316-2003（ISO14971：2000）醫(yī)療器械風(fēng)險(xiǎn)管理對醫(yī)療器械的應(yīng)用》的規(guī)定進(jìn)行。

［1］ FDA， Guidance for Reviewers ，Instructions and Template for Chemistry， Manufacturing，and Control（CMC） Reviewers of Human Somatic Cell Therapy Investigational new Drug Applications（INDs），2003.

［2］ USA， Federal Register ，Part II， 21 CFR Part 210， 211， 820， and 1271， Eligibility Determination for Donors of Human Cells， Tissues，and Cellular and Tissue-Based Products； Final Rule and Notice.

［3］ ASTM F2210-02 Standard guide for processing cells，tissues，and organs for use in tissue engineered medical products.

［4］ 王軍志:《生物技術(shù)藥物研究開發(fā)和質(zhì)量控制》（第二版），科學(xué)出版社，2007.

［5］ European Pharmacopeia-Method 5.2.3-Cell substrates for the production of vaccines for human use.

［6］ WHO - Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as substrates for the manufacture of biological medicinal products and for the characterization of cell banks 2010.

［7］ FDA Guidance for Industry-Characterization and Qualification of Cell Substrates and other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications 2010

［8］ FDA Guidance-Potency Tests for Cellular and Gene Therapy 2011.

［9］ FDA Guidance for Industry-Current Good Tissue Practice （CGTP） and Additional Requirements for Manufactures of Human Cells，Tissues， and Cellular and Tissue-Based Products （HCT/Ps）.

［10］ 國家衛(wèi)生計(jì)生委，食品藥品監(jiān)管總局: 干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則（試行），2015

The Key Technical Requirement and Standard of Tissue Engineered Medical Products

WANG ChunrenFENG XiaomingHAN QianqianNational Institutes of Food and Drug Control（Beijing100050）

The progress has been made rapidly in the tissue engineering research and development in China. So the tissue engineered medical products （TEMPs） begin from the laboratory bench move into market since some products realize the commercialization. The most important point is how to control the safety and effectiveness of the TEMPs. In this paper we propose some principle for the quality control of TEMPs associated with seeding cell resource， cell quality control， culture medium， raw material and scaffold characterization and standard etc.

tissue engineering， tissue engineered medical products， safety， effectiveness， evaluation， standard

1006-6586（2016）10-0001-04

R318

A

2016-06-08

王春仁，醫(yī)學(xué)博士，研究員，中國食品藥品檢定研究院生物材料與組織工程室主任。從事生物材料、無菌醫(yī)療器械，外科敷料、介入器械、植入器械、人工臟器、體外診斷試劑和組織工程方面的研究和檢測工作。