我國鵝細(xì)小病毒研究進(jìn)展

杜翔宇,李溫明,胡振林,張?zhí)鹛?胡桂學(xué),董　浩

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130118;2.鐵嶺出入境檢驗(yàn)檢疫局,遼寧鐵嶺112616;3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130118)

我國鵝細(xì)小病毒研究進(jìn)展

杜翔宇1,李溫明2,胡振林1,張?zhí)鹛?,胡桂學(xué)3,董浩1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130118;2.鐵嶺出入境檢驗(yàn)檢疫局,遼寧鐵嶺112616;3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130118)

1　小鵝瘟的流行病學(xué)

鵝細(xì)小病毒(GPV)屬于單股DNA病毒,在分類學(xué)上屬于細(xì)小病毒科,細(xì)小病毒亞科,細(xì)小病毒屬的成員.小鵝瘟是由鵝細(xì)小病毒引起的一種傳播快、死亡率高、高度接觸性急性或亞急性敗血性傳染病,大多發(fā)生在1個(gè)月齡以內(nèi)的雛鵝,2～3日齡的雛鵝即開始發(fā)病,7日齡以內(nèi)的雛鵝最易感染.該病具有較強(qiáng)的傳染性和較高的死亡率,隨著近年來對(duì)小鵝瘟病毒流行病學(xué)的研究發(fā)現(xiàn),小鵝瘟易感鵝群的發(fā)病日齡有逐漸增大的趨勢(shì),而且呈現(xiàn)無規(guī)律散發(fā)性流行.黃宇翔等采用臨床調(diào)查、血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了鵝細(xì)小病毒病、鵝副黏病毒病流行病學(xué)調(diào)查,結(jié)果表明,鵝細(xì)小病毒流行季節(jié)為4～8月份,發(fā)病率為60%～70%;鵝副黏病毒病流行季節(jié)為5～7月份,發(fā)病率10%～20%.二者共同點(diǎn)是對(duì)雛鵝有高度的致病性,尤其10日齡以內(nèi)雛鵝感染后,發(fā)病率和死亡率在90%以上,甚至可達(dá)100%[1].

2　GPV的分子生物學(xué)特征

2.1GPV的基因組特征GPV為DNA病毒,分為正鏈DNA和負(fù)鏈DNA,基因組全長(zhǎng)約為5.2 kb(分子質(zhì)量約為6X106Da).GPV基因組的一大特點(diǎn)是正鏈與負(fù)鏈DNA分子均含有回文結(jié)構(gòu)的序列,小鵝瘟病毒的兩種DNA鏈在核酸提取很容易出現(xiàn)退火現(xiàn)象,二者結(jié)合變成互補(bǔ)的雙鏈DNA.病毒的整個(gè)基因組分為編碼區(qū)和非編碼區(qū),非編碼區(qū)位于編碼區(qū)兩側(cè),形成回文序列;編碼區(qū)處于中間位置,包含兩個(gè)開放閱讀框,分別包括左側(cè)LORF和右側(cè)RORF,有一個(gè)長(zhǎng)短為18個(gè)堿基的片段將兩者隔開,LORF編碼NS1、NS2非結(jié)構(gòu)蛋白,RORF編碼VP1、VP2、VP3結(jié)構(gòu)蛋白,VP2和VP3蛋白是小鵝瘟的主要保護(hù)性抗原,可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體,發(fā)生免疫反應(yīng).所有的編碼基因彼此重疊,結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因都有獨(dú)立的啟動(dòng)子區(qū)域,具有共同的羧基末端,形成套式的結(jié)構(gòu). VP基因是GPV的重要基因,關(guān)系到病毒毒粒的衣殼蛋白,同時(shí)也作為抗原能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體,同時(shí)VP蛋白也關(guān)系到病毒的毒力和致病性.

目前僅有7個(gè)GPV毒株已知全基因序列,更多GPV毒株的全基因序列測(cè)定將有助于理解GPV的遺傳、演化、病毒嗜性、宿主域和致病性等相關(guān)信息.王浩等應(yīng)用PCR方法獲得GPVY株和E株的全基因組核苷酸序列,通過分析VP區(qū)糖基化位點(diǎn)的差異發(fā)現(xiàn)Y株和E株均缺失703-705 NRT糖基化位點(diǎn),推測(cè)結(jié)構(gòu)蛋白糖基化位點(diǎn)的改變有可能影響病毒的毒力,甚至使病毒形成免疫逃逸[2].張?jiān)频炔捎肞CR技術(shù)擴(kuò)增了鵝和番鴨全長(zhǎng)細(xì)小病毒基因,序列分析表明,鵝和番鴨細(xì)小病毒NS之間的核苷酸和氨基酸同源性分別為80.9%～82.9%和89.5%～91.2%,鵝和番鴨細(xì)小病毒VP1之間的同源性分別為79.7%～88.7%和85.5%～93.3%[3].王志強(qiáng)等對(duì)鵝細(xì)小病毒VP1-VP3非重疊區(qū)基因的克隆與序列分析,強(qiáng)毒株基因核苷酸序列變化低于弱毒株,這說明目前流行GPV強(qiáng)毒株的基因序列保守性高于弱毒株[4].

2.2結(jié)構(gòu)蛋白GPV能夠編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白,分別為VP1、VP2蛋白和VP3蛋白.小鵝瘟病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP的主要功能是刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體,同時(shí)該結(jié)構(gòu)也與病毒的毒力和致病性有密切關(guān)系.馬波對(duì)鵝細(xì)小病毒VP1基因的原核表達(dá)及抗原性分析,結(jié)果表明,純化的融合蛋白可與GPV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),具有良好的抗原性[5].胡曉靜等對(duì)2株鵝細(xì)小病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因的克隆和序列分析,VP2的核苷酸序列全長(zhǎng)分別為2 044 bp和2 050 bp,與番鴨細(xì)小病毒的同源性為76.8%～80.0%,為細(xì)小病毒載體的構(gòu)建和基因工程疫苗的設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)[6].

VP3蛋白在3種核衣殼蛋白中是含量最多,且在GPV或MDPV感染的水禽體內(nèi)能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生,VP3是檢測(cè)GPV或MDPV抗體最合適的候選蛋白.李永峰建立了檢測(cè)雛番鴨水禽細(xì)小病毒抗體的間接ELISA方法,為水禽細(xì)小病毒感染的診斷、免疫后抗體和母源抗體水平檢測(cè)以及基因工程疫苗的研究提供了一種簡(jiǎn)便、靈敏診斷方法[7].張雅為對(duì)實(shí)驗(yàn)免疫的鵝血清抗體進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,非結(jié)構(gòu)蛋白NS2的抗體最高峰較結(jié)構(gòu)蛋白VP3的早出現(xiàn)一周,選擇了GPV非結(jié)構(gòu)蛋白NS2作為檢測(cè)抗原,為使用重組結(jié)構(gòu)蛋白亞單位疫苗免疫動(dòng)物時(shí)鑒別自然感染與疫苗免疫奠定了基礎(chǔ)[8].

2.3非結(jié)構(gòu)蛋白目前關(guān)于GPV非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein,NS)的報(bào)道不是很多,遠(yuǎn)不如結(jié)構(gòu)蛋白研究的豐富和深入.GPV的非結(jié)構(gòu)蛋白為L(zhǎng)ORF編碼的NS1和NS2,NS蛋白在GPV復(fù)制的早期產(chǎn)生,GPV NS蛋白的主要功能是負(fù)責(zé)病毒DNA的復(fù)制以及對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控.NS2蛋白和NS1蛋白共同作用于細(xì)胞,產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有害的毒性,它的主要作用是協(xié)同、幫助NS1蛋白對(duì)細(xì)胞的毒性作用.孫敏華等克隆了鵝細(xì)小病毒佛山株的NS1基因,并將其克隆至原核表達(dá)載體pET32a(+),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-NS1,分析表明NS1蛋白得到了表達(dá),并且能與抗GPV的番鴨血清發(fā)生特異性反應(yīng)[9].邢明偉將NS2基因亞克隆于原核表達(dá)載體pGEX-6P-1,并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于感受態(tài)菌BL21(DE 3)plyS中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得重組NS2蛋白,發(fā)現(xiàn)其可以與GPV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)[10].

3　細(xì)小病毒細(xì)胞受體研究進(jìn)展

病毒感染細(xì)胞的第一步就是吸附,病毒能與細(xì)胞吸附的關(guān)鍵就是要和細(xì)胞受體結(jié)合.研究病毒的細(xì)胞受體可以揭示病毒與宿主細(xì)胞之間的關(guān)系,了解病毒對(duì)各種宿主細(xì)胞嗜性,進(jìn)入細(xì)胞的途徑機(jī)制以及對(duì)宿主敏感細(xì)胞的具體影響,還對(duì)了解病毒進(jìn)入細(xì)胞后的復(fù)制動(dòng)力學(xué)以及其他一些細(xì)胞內(nèi)事件,病毒的增殖與免疫機(jī)制相互的關(guān)系和作用提供一定參考[11-12].

李凌云等利用酵母雙雜交技術(shù)分別構(gòu)建了"獵物(prey)"蛋白表達(dá)載體和麻疹病毒VAP"誘餌(bait)"蛋白表達(dá)載體,然后共同轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母菌細(xì)胞,利用已經(jīng)建立好的敏感細(xì)胞cDNA文庫進(jìn)行篩選,得到了一個(gè)受體蛋白.董浩采用酵母雙雜交技術(shù)從鴨胚成纖維細(xì)胞的cDNA表達(dá)文庫中,篩選出GPV細(xì)胞結(jié)合蛋白,為闡明小鵝瘟致病、傳播和定植規(guī)律的研究奠定基礎(chǔ),篩選到三個(gè)與VP1互作的蛋白,分別為核糖體蛋白S12,翻譯延伸因子EEF1A1以及一種未知蛋白,證實(shí)了鴨胚成纖維細(xì)胞的核糖體蛋白S12能夠與鵝細(xì)小病毒VP1蛋白相結(jié)合,為后續(xù)尋找能夠與核糖體蛋白互作的其他蛋白奠定基礎(chǔ).在此研究基礎(chǔ)之上,郭慧通過蛋白體外相互作用的GST Pull-Down技術(shù),驗(yàn)證S12蛋白與小鵝瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的相互作用,結(jié)合產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠分析,結(jié)果證明S12與VP1能夠在體外進(jìn)行結(jié)合,鴨胚成纖維細(xì)胞核糖體蛋白S12對(duì)GPV的增殖存在一定的抑制作用[13].

4　病毒的檢測(cè)方法

臨床上可根據(jù)病鵝的臨床癥狀和病理變化作出初步診斷,隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,小鵝瘟分子生物學(xué)診斷技術(shù)取得了很大的進(jìn)展,由原來傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)受到發(fā)展為免疫學(xué)技術(shù)和高新分子生物學(xué)技術(shù)的方向快速發(fā)展,為當(dāng)前更有效防制GPV和對(duì)GPV進(jìn)一步研究提供最新的技術(shù)保障.朱小麗將抗番鴨GPV單抗腹水采用透析法標(biāo)記異硫氰酸熒光素,制備成抗GPV熒光抗體,與間接熒光方法的符合率為92.9%,表明GPV熒光抗體具有較好的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性,可用于臨床快速診斷番鴨小鵝瘟病[14].劉飛成功地制作成了雙抗夾心法GPV膠體金免疫層析試紙條,在10～15 min內(nèi)可得到檢測(cè)結(jié)果,敏感度為104.1GELD50/0.2 mL,該試紙條特異性高,重復(fù)性好,可用于GPV的臨床快速診斷[15].

荊志強(qiáng)組裝膠體金免疫層析試紙條,并利用Point-of-care testing(POCT)scanner進(jìn)行定量研究,制得的試紙條與瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)相比,符合率分別為100%、97.7%,表明膠體金免疫層析技術(shù)正是一種簡(jiǎn)易、快速的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)[16].饒桂波建立了PCR-DHPLC檢測(cè)方法是一種新的檢測(cè)GPV的方法,陽性檢出率達(dá)100%,是常規(guī)PCR方法的100倍,監(jiān)測(cè)和防制工作上升到新的水平[17].傅秋玲等建立了一種快速檢測(cè)鵝細(xì)小病毒的LAMP方法,且其檢測(cè)靈敏度達(dá)150 pg/μL,可見該方法為適合基層及現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)、實(shí)用靈敏的分子生物學(xué)方法[18].

5　鵝細(xì)小病毒免疫學(xué)研究

目前關(guān)于鵝細(xì)小病毒的免疫學(xué)方面的研究熱點(diǎn)主要包括活疫苗、滅活疫苗及基因工程疫苗的研制、單克隆抗體的研制與開發(fā)和抗原表位的研究等幾個(gè)方面.王倩用篩選出4株分泌抗GPV抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株,其中1G3和3B11雜交瘤細(xì)胞在體外具有穩(wěn)定分泌抗GPV單克隆抗體的能力,并對(duì)免疫后的抗體水平進(jìn)行監(jiān)測(cè),為鵝細(xì)小病毒病的疫情監(jiān)測(cè)和免疫抗體效價(jià)測(cè)定奠定基礎(chǔ)[19].盧菲等鵝細(xì)小病毒VP3基因疫苗與弱毒疫苗誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的比較,結(jié)果顯示,小鵝瘟VP3基因疫苗免疫小鼠的外周血T淋巴細(xì)胞對(duì)ConA刺激的反應(yīng),誘導(dǎo)的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞免疫功能和血清IgG抗體水平在不同時(shí)間段都顯著或極顯著高于弱毒疫苗免疫組[20].郭鷺利用Ni-NTA親和層析純化后的GPV VP3重組蛋白作為免疫原,通過Western Blot定位出兩個(gè)抗原表位為430～435 aa和643～647 aa[21].王娟對(duì)抗GPV單克隆抗體的抗原表位分析,結(jié)果顯示,在VP3基因的135～332 aa和322～535 aa處用間接免疫熒光檢測(cè),并初步確定3E8株單抗的抗原表位在322～332 aa上[22].

6　展望

蛋白質(zhì)相互作用的研究,是揭示生物體正常生長(zhǎng)發(fā)育及其應(yīng)對(duì)各種生物或非生物脅迫的分子機(jī)制重要途徑,深入研究小鵝瘟病毒的復(fù)制機(jī)理、揭示病毒結(jié)構(gòu)蛋白與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用,從蛋白質(zhì)水平闡明病毒侵染的過程,將會(huì)成為我們未來研究工作的重點(diǎn);同時(shí)為了加強(qiáng)該病的流行監(jiān)測(cè),進(jìn)一步完善和建立及時(shí)、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法,是該病臨床診斷、防疫與檢疫的迫切要求,將有助于降低該病在家禽的流行;鵝細(xì)小病毒免疫學(xué)是研究鵝細(xì)小病毒工作的重要組成部分,研制基因工程活載體疫苗和DNA疫苗等新型疫苗也勢(shì)在必行;我國小鵝瘟研究工作雖然取得了一定的成果,但是目前的小鵝瘟防控仍舊存在問題,一些科學(xué)研究成果還沒得到應(yīng)用和推廣,需要研究工作者在小鵝瘟病毒方面的研究付出更多的努力.

[1]黃宇翔,劉力威,李洪彬,等.鵝細(xì)小病毒病、副黏病毒病的流行病學(xué)調(diào)查及病原分離鑒定[J].中國家禽,2013,35(2): 22-29.

[2]王浩,田先舉,張爍,等.2株鵝細(xì)小病毒全基因組特征分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,44(40):602-609.

[3]張?jiān)?鵝和番鴨細(xì)小病毒全基因克隆與序列分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)報(bào),2008,30(6):415-419.

[4]王志強(qiáng).鵝細(xì)小病毒VP1_VP3非重疊區(qū)基因的克隆與序列分析[J].中國家禽,2011,33(19):28-30.

[5]馬波.鵝細(xì)小病毒VP1基因的克隆序列分析及表達(dá)載體的構(gòu)建[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2010,40(2):135-138.

[6]胡曉靜.2株鵝細(xì)小病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因的克隆和序列分析[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2008,23:261-264.

[7]李永峰.鵝和番鴨細(xì)小病毒VP3-ELISA診斷方法的建立[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2010.

[8]張雅為.鵝細(xì)小病毒VP3-ELISA和NS2-ELISA檢測(cè)方法的建立及抗體消長(zhǎng)規(guī)律的測(cè)定[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[9]孫敏華,董嘉文,李林林,等.鵝細(xì)小病毒VP3基因的克隆及表達(dá)[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技,2013,38(5):25-28.

[10]邢明偉.鵝細(xì)小病毒NS2基因的原核表達(dá)及抗原性檢測(cè)[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,32(2):148-150.

[11]Tsugama D,Liu S,Takano T.A putative myristoylated 2C-type protein phosphatase,PP2C74,interacts with SnRK1 in Arabidop?sis[J].FEBS Letters,2012,586(6):693-698.

[12]Tominaga-Wada R,Iwata M,Nukumizu Y,et al.A full-length R-like basic-helix-loop-helix transcription factor is required for an?thocyanin upregulation whereas the N-terminal region regulates epidermal hair formation[J].Plant Science,2012,183(1):115-122.

[13]郭慧.GPV VP1蛋白與DEF核糖體蛋白S12的互作驗(yàn)證及其對(duì)GPV增殖的影響[D].長(zhǎng)春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[14]朱小麗.應(yīng)用膠乳凝集技術(shù)診斷番鴨小鵝瘟病[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,34(9):715-718.

[15]劉飛.抗小鵝瘟病毒單克隆抗體的制備及膠體金免疫層析試紙條的研制[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[16]荊志強(qiáng).鵝細(xì)小病毒抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條的研制[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[17]饒桂波.鵝細(xì)小病毒的分離鑒定及PCR-DHPLC檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用[D].長(zhǎng)春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2013,28-37.

[18]傅秋玲,施少華,萬春和,等.檢測(cè)鵝細(xì)小病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的建立及結(jié)果判定方法改進(jìn)[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,28(1):9-13.

[19]王倩.鵝細(xì)小病毒NS基因PCR和單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[20]盧菲.鵝細(xì)小病毒VP3基因疫苗與弱毒疫苗誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的比較[J].中國獸醫(yī)科學(xué)2008,38(07):576-581.

[21]郭鷺.抗鵝細(xì)小病毒VP3蛋白單克隆抗體的制備及對(duì)應(yīng)抗原表位的定位[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2013,21(4):1-6.

[22]王娟.鵝細(xì)小病毒VP3基因的原核表達(dá)及其單克隆抗體的研制[D].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2012.

S852.65+9.2

A

0529-6005(2016)06-0063-03

2015-05-25

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20130522086JH);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20112223110002);吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(201231);吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2015209)

杜翔宇(1989-),女,碩士生,從事分子病原微生物與分子免疫學(xué)研究,E-mail:dxy1209@163.com

董浩,E-mail:donghao_jlau@163.com