情緒應激造模方法

王慧霞　詹向紅　李　偉　劉勝利　王有杰

(河南中醫(yī)學院，河南　鄭州　450008)

情緒應激造模方法

王慧霞1詹向紅李偉劉勝利王有杰

(河南中醫(yī)學院，河南鄭州450008)

〔關(guān)鍵詞〕情緒應激；動物造模；行為學

社會應激事件頻發(fā)引發(fā)的情緒問題日益增多，情緒沖突已成為多種疾病發(fā)病率升高的重要原因之一，并在引起衰老、導致疾病的過程中起重要作用。由于倫理學的限制，動物實驗是較為理想的研究疾病發(fā)生機制的方法。但情緒的主觀性和復雜性使情緒動物模型的制備和評估存在較大難度，本文對近幾年常用的情緒應激動物模型進行簡要綜述。

1社會應激法

傳統(tǒng)的情緒應激動物模型將動物置于一系列不可逃避的物理或化學應激環(huán)境中，通過建立動物之間短暫的不良社會關(guān)系，從而誘發(fā)負性情緒心理反應及行為，更多地考慮到動物的社會屬性，是一種更加純粹的心理應激造模方法，但模型的復制成功率較低，需對兩種動物的品系、月齡及周圍環(huán)境等因素嚴格控制。

1.1社交失敗模型最早是Mine等〔1〕設計的,實驗者將一批雄性大鼠單獨飼養(yǎng)以誘發(fā)其攻擊行為傾向。一旦另一受試動物進入籠內(nèi),就會受到大鼠的猛烈攻擊。但采用其描述方法復制實驗效果并不理想，研究〔1〕表明，不同品系的動物在社交失敗應激中反應有差異。

王靜等〔2〕采用樹鼩建立社會競爭失敗病因?qū)W模型，持續(xù)21 d。其中爭斗失敗者被稱為服從者，表現(xiàn)出逃跑、恐懼、順從等從屬性特征。這個過程可導致每天1 h的直接社交沖突和23 h的間接相互影響(比如通過氣味、視覺等)。與正常對照相比,失敗者21 d之后顯示體重、自主活動、躲避行為、尿液皮質(zhì)醇水平等的變化,并且這種改變可持續(xù)至少2 w以上。吳曉等〔3〕將攻擊性CD-1小鼠與C57小鼠放于同一環(huán)境中建立小鼠社交失敗模型并分析該模型的行為學變化特征，結(jié)果顯示應激組C57小鼠在角落區(qū)域停留時間延長，而在社交區(qū)域停留軌跡明顯減少。2005年德國哥廷根大學〔4〕選用性情兇猛、攻擊性強的Lister Hooded雄鼠攻擊Wistar雄鼠，成功制備出與臨床表現(xiàn)吻合的抑郁癥動物模型，被擊敗動物糖皮質(zhì)激素和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)水平升高，免疫功能及對疾病的抵抗力下降，且有不同腦區(qū)的多巴胺、γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸和5-羥色胺(HT)結(jié)合受體逆轉(zhuǎn)改變，但Lister Hooded品系大鼠的獲取很難〔5〕。

社交失敗模型是一種社會性應激，它模擬人類在正常交往中遇到挫折并孤立無助的情景，通過引起動物成員之間的社會沖突產(chǎn)生應激，在大鼠中由一個侵略雄性所引起的社交失敗是一種自然應激因子，該種應激能引起分子、生理及行為變化，這種變化有時會很持久，包括自發(fā)及探索活動減少，侵略行為及性行為減少，服從行為及焦慮增加；同時文獻報道顯示，社交失敗應激對獎賞系統(tǒng)產(chǎn)生影響〔6〕，從而引起動物興趣下降及快感缺失，這恰恰與抑郁癥的核心癥狀相似。

2間接刺激法

此類造模方法并非直接對實驗動物進行負性軀體刺激如足底電擊、束縛、禁食禁水或冷刺激產(chǎn)生應激，而是以另一批動物為依托，實驗者對其施加各種電擊等刺激，同時將模型組動物與直接應激動物置于同一環(huán)境中，以此誘發(fā)動物的心理應激反應。該類方法在一定程度上降低了模型的軀體應激成分，是一種較為理想的情緒應激動物模型，但其所誘發(fā)的情緒成分復雜，尚不夠明確。

2.1旁觀電擊法Katsura等〔7〕設計的旁觀電擊小鼠方案作為小鼠的心理應激模型。被電擊小鼠(電擊電流為2 mA，周期5 s，間歇55 s)產(chǎn)生驚叫、驚跳，甚至便失禁；實驗應激組小鼠不受電擊，而是旁觀電擊小鼠遭受電擊的過程，通過視覺、聽覺等產(chǎn)生心理應激。實驗后期有些動物在電擊鼠驚叫驚跳時身體轉(zhuǎn)向另一側(cè)，毫無反應，這與動物在此過程中心理產(chǎn)生的適應性有關(guān)；同時，有的實驗動物為逃避足底電擊,會爬到箱壁和頂部；動物的排泄物可能導致電流減小或消失等,嘗試通過增加電流的強度和延長電擊時間來克服這些問題。

2.2間接電擊法課題組〔8〕前期的實驗提出一種新的情緒誘發(fā)方法——間接電擊激怒法，實驗過程中人為地用電極觸碰攻擊鼠胸腹部，攻擊鼠受電擊后被激怒，對應激組大鼠發(fā)起攻擊，雙方互相撕咬、對峙，產(chǎn)生憤怒心理和行為。該法的優(yōu)點在于誘發(fā)的憤怒情緒較為理想，很大程度上減少軀體應激成分。

3直接刺激法

直接刺激法的種類較多，是目前情緒應激動物模型最常用的方法，特點是將動物置于一種不可避免的應激環(huán)境，給予一種或多種刺激，如足底電擊、束縛等，模型制作過程相對簡單易操作，對實驗條件要求較低，更容易實現(xiàn)；但不可避免地存在軀體應激，若合理控制則較為成功。

3.1足底電擊、束縛等很多文獻以足底電擊結(jié)合聲音或光照作為應激條件，結(jié)果顯示:應激對照組與心理應激組受到的軀體刺激相同,但后者無法根據(jù)光信號預見電刺激,因此較前者更緊張,心理應激程度更高〔9〕。研究〔10〕采用光電結(jié)合方法對糖尿病大鼠進行應激。結(jié)果顯示糖尿病大鼠血糖明顯升高，光電結(jié)合應激抑制大鼠的反應，并對糖尿病大鼠的行為、 血糖產(chǎn)生影響。

束縛是一種純粹的挫折應激，短時間的束縛應激可成功制作動物焦慮模型，隨著束縛應激時程的增長，動物更多地表現(xiàn)出嗜睡、興趣降低等抑郁樣行為。但不同的束縛方式所引起的軀體應激差異大。賀立娟等〔11〕運用慢性束縛應激結(jié)合孤養(yǎng)法建立肝氣郁結(jié)證大鼠模型，研究發(fā)現(xiàn),給予大鼠慢性束縛21 d后，模型組 ACTH、皮質(zhì)酮(CORT)水平顯著升高，柴胡疏肝散給藥干預后可顯著降低其水平，該結(jié)果提示此模型的中醫(yī)病理機制與肝失疏泄有關(guān)。此外,噪音刺激、強迫游泳、冷熱刺激等也可引發(fā)不可逃避性應激模型。

3.2慢性不可預知性心理應激近幾年來國內(nèi)外研究多采用多重復合應激法誘發(fā)動物的情緒反應，慢性不可預見性心理應激方法誘導動物抑郁等復合負性情緒行為，此種應激模型中應激因子多樣化且不可預測，能避免單一刺激所引起的適應性，可應用于慢性心理應激的神經(jīng)生物學和行為心理學研究。它包括一系列不可預知的低強度應激,如束縛、強迫游泳、禁食禁水、搖晃等,從病因?qū)W角度模擬抑郁癥的環(huán)境誘因,以曠場行為反應及動物糖水消耗量作為觀測指標,經(jīng)過特異性及可信性評價,被認為是經(jīng)典的慢性抑郁模型〔12〕。富文俊等〔13〕發(fā)現(xiàn)逍遙散可通過下調(diào)慢性不可預知性心理應激損傷大鼠下丘腦室旁核區(qū)ACTH釋放激素(CRH)mRNA表達而部分恢復慢性應激大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)負反饋功能，結(jié)果提示此動物模型的預測效度較優(yōu)。研究〔14〕顯示，慢性不可預知性心理應激上調(diào)多巴胺D2受體表達，下調(diào)前額皮質(zhì)蛋白激酶A,轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應原件結(jié)合蛋白(CREB)、p-CREB、cAMP 和蛋白激酶A水平下降，這與臨床上抑郁患者的發(fā)現(xiàn)一致，初步提示多巴胺系統(tǒng)功能失調(diào)在應激相關(guān)的抑郁癥等精神障礙疾病中起到核心作用。Mahar等〔15〕將抑郁癥和抗抑郁藥物作用的血清素和神經(jīng)性假設聯(lián)系起來，發(fā)現(xiàn)慢性不可預知性應激顯著地減弱5-HT 神經(jīng)遞質(zhì)和5-HT1A 自受體的敏感性，并且通過減少神經(jīng)再生減輕海馬對HPA軸的抑制，使應激軸過度活躍惡化。

4基于條件反射的造模方法

4.1懲罰性飲水懲罰性飲水模型是將動物的飲水行為和不確定的電擊結(jié)合起來，動物如果想滿足飲水的需要就可能會受到電擊的創(chuàng)傷，由此造成動物在飲水和避免電擊之間的趨避沖突，產(chǎn)生焦慮反應。這種造模方法是從動物的本能需要出發(fā)，當動物的本能遭到威脅時，它們在心理上產(chǎn)生趨避反應沖突，誘發(fā)焦慮情緒〔16〕。此種動物模型有較好的預測效度，是研究抗焦慮藥物藥理學機制的良好模型。

在實施這種造模方法前，必須禁水足夠時間，同時要將大鼠置于電擊箱中適應4～5 h，才能達到理想效果；由于不同性別甚至不同動物個體在飲水需求方面的差異，它們所遭受的電擊程度不一，造成個體所誘發(fā)的焦慮程度不一；這與Basso等〔17〕的研究結(jié)果一致，當與雄性大鼠同等體重匹配時，雌性大鼠受到更少的懲罰反應，更少的飲水攝入量，雌性大鼠比雄性大鼠對足底電擊有更低的疼痛閾值，不同的抗焦慮藥物在兩種性別中顯示出的抗焦慮樣作用有較大差異。Pisua等〔18〕研究顯示，喹硫平對C57BL6/N 飲水沖突模型大鼠顯示出一種抗焦慮作用，可以認為懲罰性飲水模型大鼠血漿中5-HT含量的變化與模型所誘發(fā)的負性情緒反應有一定的相關(guān)性。這些提示5-HT系統(tǒng)在焦慮情感障礙模型中的重要作用。

4.2空瓶應激空瓶應激法是以不確定性空瓶飲水刺激作為應激源，訓練動物在特定的時間段飲水，當動物感受到缺水應激之后，只給予動物一個沒有水的空瓶,動物吸吮空瓶而得不到水,從而產(chǎn)生挫折感，進而誘發(fā)動物的情緒反應。

王瑋文等〔19〕發(fā)現(xiàn)不同時程的空瓶應激激活HPA和交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(SNS)軸(腎上腺素、去甲腎上腺素和CORT水平升高)的程度不同,這可能與持續(xù)的慢性應激后SNS反應出現(xiàn)一定程度的適應性相關(guān)。歐陽俊彥等〔20〕采用不確定性空瓶應激制作焦慮大鼠模型，發(fā)現(xiàn)GABA與焦慮大鼠額葉皮質(zhì)的一氧化氮(NO)合酶(NOS)及NO均呈劑量-效應關(guān)系，提示GABA可能通過調(diào)節(jié)焦慮大鼠額葉皮質(zhì)中的NO含量發(fā)揮抗焦慮作用。

5問題與展望

情緒應激動物模型嘗試在實驗動物上復制人類精神障礙疾病的特征，此模型相關(guān)的生理和行為變化需符合特定情緒狀態(tài)(表面效度)、疾病的病因?qū)W(結(jié)構(gòu)效度)及藥理學治療反應(預測效度)。但情緒應激的發(fā)生是一個復雜過程，應激反應因應激原種類、動物種屬、性別、生理狀態(tài)、周齡、應激狀態(tài)、應激持續(xù)時間的不同而有所差異,在一定程度上解釋了各種情緒應激所導致的結(jié)果不一致性，但存在著一個基本的趨勢：SNS和HPA是應激反應的重要環(huán)節(jié),而血清兒茶酚胺和糖皮質(zhì)激素含量的上升被視為應激反應的標志〔9〕。應激所引起的個體反應是由神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫等系統(tǒng)網(wǎng)絡共同作用的，究竟哪些系統(tǒng)在情緒應激發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在應激的哪一進程起作用，有待進一步證實。

另外認知在應激發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的中介作用，不同認知水平及性格特質(zhì)個體產(chǎn)生的應激反應不同，且應激的病理生理改變涉及多個腦區(qū)，考察動物的基線認知水平，并將其加入情緒應激動物模型的考慮因素中，會使情緒應激動物模型更接近人類情緒障礙疾病的發(fā)生機制，例如在實驗之前，采用水迷宮篩選認知水平接近的動物參與造模。

因此，發(fā)展有效、客觀的情緒應激動物模型，優(yōu)化實驗設計、指標選擇，系統(tǒng)全面地認識指標的變化，將會對進一步明確情緒應激過程的各個生理反應，深入分析情緒的心理學發(fā)生機制及探討中醫(yī)情志疾病起因和發(fā)病機制有重要指導意義。

6參考文獻

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〔2015-04-30修回〕

(編輯苑云杰/王一涵)

基金項目：國家自然科學基金資助項目(30973695，81173148)

通訊作者：詹向紅(1963-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事情志與衰老相關(guān)疾病的理論及應用研究。

〔中圖分類號〕R33

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2530-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.105

1河南醫(yī)學高等專科學校

李偉(1969-)，男，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合病理學實驗研究。

第一作者：王慧霞(1987-)，女，碩士，主要從事情志與衰老相關(guān)性疾病的理論及應用研究。