STAT3，mTOR，ERK1/2磷酸化在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)

阿旺旦增　呂廣超　趙　慧王凱忠　王　凱　(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院胸外科，吉林　長(zhǎng)春　3002)

?

STAT3，mTOR，ERK1/2磷酸化在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)

阿旺旦增呂廣超趙慧1王凱忠王凱(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院胸外科，吉林長(zhǎng)春130021)

〔摘要〕目的探討檢測(cè)信號(hào)傳遞與轉(zhuǎn)錄活化因子( STAT) 3、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白( mTOR)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶( ERK) 1/2的磷酸化在非小細(xì)胞肺癌( NSCLC)中的表達(dá)。方法收集49例手術(shù)治療的原發(fā)性NSCLC患者的病理組織及19例癌旁正常肺組織。免疫組化檢測(cè)肺癌組織及癌旁組織中的STAT3，mTOR和ERK1/2蛋白磷酸化的表達(dá)，將結(jié)果及患者的臨床基本信息及TNM分期、病理類型等因素的進(jìn)行相統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果在NSCLC中STAT3、mTOR和ERK1/2的磷酸化高表達(dá)。磷酸化的STAT3( p－STAT3)在鱗癌中的表達(dá)高于腺癌( P=0．001)。磷酸化的mTOR ( p－mTOR)在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中高表達(dá)( P = 0．043)。本實(shí)驗(yàn)的肺癌組織中蛋白p－ERK1/2與p－STAT3、p－mTOR之間存在相關(guān)性( P = 0．033，P=0．015)。結(jié)論NSCLC的發(fā)生與STAT3、mTOR和ERK1/2的磷酸化表達(dá)有關(guān)。p－STAT3在鱗癌發(fā)病中意義更大。p－mTOR與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。p－ERK1/2與p－mTOR、p－STAT3在NSCLC中的表達(dá)存在正相關(guān)性。

〔關(guān)鍵詞〕非小細(xì)胞肺癌; p－STAT3; p－mTOR; p－ERK1/2

1吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室

第一作者:阿旺旦增( 1984－)，男，在讀碩士，主要從事肺癌的診斷與治療研究。

目前非小細(xì)胞肺癌( NSCLC)首選手術(shù)治療，但當(dāng)確診時(shí)75%病人已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會(huì)，對(duì)于一線化療藥物鉑類，僅30%患者治療有效，分子靶向治療藥物已經(jīng)在臨床上取得了較滿意的效果。目前研究介導(dǎo)NSCLC增殖的主要通路中較為明確的有兩條通路:細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶－絲裂原化蛋白激酶( RAS－ERK/ MAPK)途徑;磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白( P13K/AKT/mTOR)路徑。這些通路可以使細(xì)胞增殖增加，凋亡減少，并使新生血管數(shù)目更多，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象也更加頻繁。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的核心部位的關(guān)鍵蛋白是mTOR，mTOR磷酸化( p－mTOR)可以引起腫瘤細(xì)胞快速增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔1〕。

絲裂原的活化蛋白激酶的胞質(zhì)信號(hào)傳遞路徑的終末蛋白激酶是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶( ERK)，它被激活形成p－ERK，在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中起重要作用。信號(hào)傳遞與轉(zhuǎn)錄活化因子3 ( STATs)作為一種癌基因，被認(rèn)定為信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄相關(guān)激活因子，常過度表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞中。STAT3的活化構(gòu)成即為磷酸化的STAT3( p－STAT3)，它能促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等。張一方等〔2〕發(fā)現(xiàn)在微管結(jié)合蛋白4－間變淋巴瘤激酶( EML4－ALK)融合基因肺癌細(xì)胞株中STAT3表達(dá)有上調(diào)，ERK1/2與AKT及與其相應(yīng)的磷酸化沒有顯著的改變，mTOR表達(dá)有所上調(diào)，磷酸化程度明顯升高。本實(shí)驗(yàn)旨在探討STAT3、AKT、mTOR及ERK等蛋白的磷酸化在NSCLC中的表達(dá)及其相關(guān)性。

1資料與方法

1. 1資料收集原發(fā)性NSCLC患者的病理組織49例及癌旁的正常肺組織19例。所有病例均來源于2013年1～8月在我院胸外科予以手術(shù)治療的患者。手術(shù)前均未給予化、放療等抗腫瘤的治療。癌旁組織由病理科醫(yī)師診斷為正常肺組織。49 例NSCLC標(biāo)本中鱗癌29例( 59．2%)，腺癌20例( 40．8%) ;其中男36例，女13例;年齡≥60歲的19例，＜60歲的30例;吸煙患者30例，不吸煙19例;存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例27例; NSCLC的分期:Ⅰ期23例，Ⅱ期13例，Ⅲ期13例。

1. 2方法

1. 2. 1標(biāo)本收集本實(shí)驗(yàn)收集了49例NSCLC病患的腫瘤組織的石蠟包埋標(biāo)本。標(biāo)本切除后20 min內(nèi)予以收集，甲醛固定，脫水后石蠟包埋，連續(xù)切片，每張4 μm。

1. 2. 2免疫組織化學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟: ( 1)脫蠟至水:將組織標(biāo)本放入二甲苯試劑中2遍，5 min/次，不同梯度酒精逐級(jí)脫水。( 2)標(biāo)本用0．01 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液( PBS)漂洗3遍，5 min/次。( 3)滅活內(nèi)源性梓根過氧化物酶( HRP) :用3% H2O2去離子水孵育10 min，用PBS沖洗3遍，5 min/次。( 4)抗原修復(fù):切片浸于0．01 mol/L構(gòu)椽酸鹽抗原修復(fù)液體中，加熱至煮沸10 min，自然冷卻即用PBS洗3遍，5 min/次。( 5)擦干切片周圍水分，切勿碰觸組織。在切片上滴注封閉用山羊血清工作液50 μl，并在室溫下孵育30 min，不沖洗，只倒去切片上封閉血清便可。( 6)滴加50 μl的一抗。分別為兔抗人p－STAT3、p－mTOR和p－ERK1/2，予以在4℃冰箱中貯存一晚。( 7)第2天，將從4℃冰箱中取出的過夜切片在室溫下復(fù)溫半小時(shí)，后用PBS沖洗3遍，5 min/次。( 8)每張切片在加入1滴生物素化二抗工作液后在室溫下孵育半小時(shí)，再用PBS沖洗3次，5 min/次。( 9)每張切片在滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液后室溫下孵育半小時(shí)，后予以PBS溶液沖洗3遍，5 min/次，二氨基聯(lián)苯胺( DAB)顯色:將DAB顯色液滴加于蓋玻片上，待顯微鏡下顯色結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)用自來水沖洗蓋玻片，終止顯色。( 10)用蘇木素復(fù)染2 min，后用鹽酸酒精予以分解，再用自來水沖洗返藍(lán)10 min。( 11)梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。

1. 2. 3結(jié)果判斷在對(duì)患者臨床資料等信息不知情的前提下，病理科醫(yī)師獨(dú)立觀察并分析各切片后判定病理結(jié)果。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):無染色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，褐色計(jì)為3分;

1. 3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19．0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2. 1 STAT、ERK1/2、mTOR在NSCLC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)p－STAT3免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)物為棕黃色小顆粒，主要存在于細(xì)胞核，p－ERK1/2陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，pmTOR為粗細(xì)不一棕黃色顆粒，主要染色位于細(xì)胞質(zhì)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，STAT3、ERK1/2、mTOR磷酸化在NSCLC組織的表達(dá)〔35例( 71．3%)、4例( 83．7%)、37例( 75．5%)〕明顯高于癌旁正常組織中的表達(dá)〔3例( 15．8%)、5例( 26．3%)、3例( 15．8%)〕( P＜0．001)。

2. 2 STAT蛋白在NSCLC中的磷酸化表達(dá)男性的表達(dá)率為75．0%( 27/36)，女性為61．5%( 8/13)，≥60歲患者中表達(dá)率為78．9%( 15/19)，＜60歲為66．7%( 20/30)，吸煙患者陽(yáng)性率為76．7%( 23/30)，不吸煙患者中為63．2%( 12/19)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各期中表達(dá)率分別為69．6%，84．6%和61．5%，在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中表達(dá)率為68．2%( 15/22)，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中為74．1%( 20/27)，以上相關(guān)因素的比較中未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差別( P＞0．05)。p－STAT3在肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)率為89．7%( 26/29)，明顯高于在腺癌中的表達(dá)率〔45．0%( 9/20)〕( P=0．001)。

2. 3 ERK1/2蛋白在NSCLC中的磷酸化表達(dá)在男性中表達(dá)率為80．6%( 29/36)，女性中為92．3%( 12/13)，≥60歲患者中表達(dá)率為89．5%( 17/19)，＜60歲為80．0%( 24/30)，吸煙患者陽(yáng)性率為83．3%( 25/30)，不吸煙患者中為84．2%( 16/19)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各期中表達(dá)率分別為82．6%，100．0%和69．2%，在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中表達(dá)率為81．8%( 18/22)，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中為85．2%( 23/27)，在鱗癌中的表達(dá)率為86．2% ( 25/29)，在腺癌中為80．0%( 16/20)，以上相關(guān)因素的比較中未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差別( P＞0．05)。

2. 4 mTOR蛋白在NSCLC中的磷酸化表達(dá)在男性中表達(dá)率為72．2%( 26/36)，女性中為84．6%( 11/13)，≥60歲患者中表達(dá)率為73．7%( 14/19)，＜60歲為76．7%( 23/30)，吸煙患者陽(yáng)性率為73．3%( 22/30)，不吸煙患者中為78．9%( 15/19)，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期中表達(dá)率分別為69．6%，76．9%和84．6%，在鱗癌中的表達(dá)率為79．3%( 23/29)，在腺癌中為70．0%( 14/20)，以上相關(guān)因素的比較中未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差別( P＞0．05)。在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中表達(dá)率為90．9%( 20/22)，明顯高于在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中的63．0%( 17/27) ( P=0．043)。

2. 5磷酸化STAT3和ERK1/2、mTOR在肺癌中表達(dá)的關(guān)系

在p－STAT3陽(yáng)性表達(dá)的35例肺癌組織標(biāo)本中p－ERK1/2有32例陽(yáng)性表達(dá)，在p－STAT3陰性表達(dá)的14例肺癌組織標(biāo)本中p－ERK1/2有5例陰性表達(dá)，兩者存在正相關(guān)性( P= 0．033)。在p－mTOR陽(yáng)性表達(dá)的37例肺癌組織標(biāo)本中p－ERK1/2有34例陽(yáng)性表達(dá)，在p－mTOR陰性表達(dá)的12例肺癌組織標(biāo)本中p－ERK1/2有5例陰性表達(dá)，兩者存在正相關(guān)性( P=0．015)。

3討論

肺癌是當(dāng)今發(fā)生率與致死率最高的惡性腫瘤。我國(guó)衛(wèi)生部2006年統(tǒng)計(jì)資料顯示，城市居民死亡原因排在首位的是肺癌，在所有癌癥中死亡率排第一位，肺癌在農(nóng)村居民的死亡原因中也升至第三位〔3〕。有研究認(rèn)為NSCLC組織中STAT3表達(dá)顯著增高，且腫瘤對(duì)該通路存在依賴性，但也有研究認(rèn)為該通道在NSCLC中不活化。根據(jù)HPRD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的Cytoscape制作的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，本文發(fā)現(xiàn)，STAT3與MAPK家族、mTOR等蛋白存在相互作用。張一方等〔2〕發(fā)現(xiàn)STAT3在EML4－ALK融合基因肺癌細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)，mTOR出現(xiàn)上調(diào)，磷酸化水平顯著提高。STAT3已被確認(rèn)為是一種癌基因，在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮重要功能，因此對(duì)于STAT3的進(jìn)一步研究分析十分重要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在NSCLC中STAT3、mTOR，和ERK1/2的磷酸化高表達(dá)。p－STAT3在鱗癌中的表達(dá)高于腺癌。p－mTOR在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中高表達(dá)，與肺癌的侵襲性、轉(zhuǎn)移能力、預(yù)后可能有關(guān)。p－STAT3與p－ERK1/2，p－ERK1/2與p－mTOR在NSCLC中的表達(dá)存在正相關(guān)性，或許是聯(lián)合使用抑制劑治療肺癌的一個(gè)方向。但是本次實(shí)驗(yàn)只是從蛋白水平觀察了STAT3、ERK1/2、mTOR與NSCLC的關(guān)系，對(duì)于他們之間的具體調(diào)控機(jī)制，尚未進(jìn)行基因水平的研究，仍需進(jìn)一步研究，為了解NSCLC及有效地進(jìn)行NSCLC的靶向治療提供了新的思路和依據(jù)。

STATs是在研究干擾素( IFN)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路時(shí)發(fā)現(xiàn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子，是一類能與DNA結(jié)合的蛋白家族〔2〕。目前為止，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系比較密切的STATs家族成員包括STAT1、STAT3及STAT5，其中以STAT3最為活躍。STAT3與肺癌的相關(guān)性是本次試驗(yàn)要解決的問題。STAT3的活化體現(xiàn)在羧基端705位酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)被磷酸化〔4〕。磷酸化的STAT3單體通過與另外一個(gè)STAT3分子磷酸化的酪氨酸殘基彼此作用形成二聚體，而后進(jìn)入細(xì)胞核〔5〕。后于特異DNA結(jié)合位點(diǎn)作用，直接或間接調(diào)節(jié)凋亡抑制基因，從而調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡。

Ras/Raf/MEK/ERK途徑是最具代表性的MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一，在NSCLC中起重要作用。MAPK信號(hào)系統(tǒng)是一組非常保守的絲氨酸(蘇氨酸)雙重磷酸化蛋白激酶家族，在信號(hào)傳遞的過程中占據(jù)著相當(dāng)重要的地位。ERK是調(diào)控細(xì)胞增殖的重要途徑，在細(xì)胞分化發(fā)育、周期循環(huán)調(diào)控、胞間功能同步等多種生理病理過程中發(fā)揮作用。ERK1/2活化的形式即是p－ERK1/2。p－ERK1/2進(jìn)入細(xì)胞核作用于c－jun、核轉(zhuǎn)錄因子( NF－κB)、Elk－1、c－fos、c－myc等轉(zhuǎn)錄因子，可磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子等多種底物，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，并在細(xì)胞惡性化過程中起重要作用〔6〕。Mi等〔7〕研究認(rèn)為P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路和MAPK/ERK通路之間或存在以下聯(lián)系，抑制mTOR將會(huì)通過負(fù)反饋方式激活MAPK/ERK通路。

mTOR屬于PI3K蛋白激酶類家族，是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶。其對(duì)于細(xì)胞的調(diào)控作用通過PI3K/AKT/mTOR途徑來實(shí)現(xiàn)〔8〕。mTOR活化狀態(tài)即p－mTOR，在NSCLC中mTOR磷酸化程度隨惡性腫瘤進(jìn)展增加。本實(shí)驗(yàn)說明mTOR的磷酸化表達(dá)與NSCLC的侵襲性、轉(zhuǎn)移能力有密切關(guān)系，對(duì)肺癌患者的預(yù)后有影響。這在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌中早已有報(bào)道。有研究〔9〕顯示在74%的NSCLC中發(fā)現(xiàn)磷酸化或活化的mTOR，表明mTOR抑制劑與傳統(tǒng)放、化療聯(lián)合應(yīng)用在肺癌治療中，可能會(huì)顯示出更明確的療效〔10〕。

4參考文獻(xiàn)

1 Kozma SC，Thomas G．Regulation of cell size in growth，development and human disease: P13K，PKB and S6K〔J〕．Bioessays，2002; 24 ( 1) : 65－71．

2張一方，吳一龍．EML4－ALK融合基因在非小細(xì)胞肺癌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用〔J〕．癌癥進(jìn)展，2010; 8( 6) : 530－7．

3趙亞力，李琦，韓為東．肺癌的表皮生長(zhǎng)因子受體分子靶向治療與基因突變〔J〕．生物技術(shù)通訊，2007; 18( 6) : 1007－9．

4王炯鐵，姜斌，劉峰．STAT3、p－STAT3、VEGF和bFGF在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)〔J〕．上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009; 29( 12) : 1450－4．

5 Levy DE，Darnell JE Jr．Stats: transcriptional control and biological impact 〔J〕．Nat Rev Mol Cell Biol，2002; 3( 9) : 651－62．

6谷艷嬌，包翠芬，魏嘉，等．ERK1/2和p－ERK1/2在肺癌組織中的表達(dá)及意義〔J〕．中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞學(xué)雜志，2009; 18( 3) : 328－32．

7 Mi R，Ma J，Zhang D，et al．Efficacy of combined inhibition of mTOR and ERK/MAPK signaling pathways in treating a tuberous sclerosis complex cell model〔J〕．J Genet Genomics，2009; 36( 6) : 355－61．

8鄭鵬生，冀靜．mTOR信號(hào)通路與腫瘤的研究進(jìn)展〔J〕．西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010; 31( 1) : 1－9．

9 Marinov M，F(xiàn)ischer B，Arcaro A．Targeting mTOR signaling in lung cancer〔J〕．Crit Rev Oncol Hematol，2007; 63( 2) : 172－82．

10祁慧薇．P13K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與非小細(xì)胞肺癌〔J〕．中國(guó)肺癌雜志; 2010; 13( 12) : 1149－54．

〔2015－05－16修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:王凱忠( 1968－)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事肺癌的診斷與治療研究。

〔中圖分類號(hào)〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202( 2016) 02-0354-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 046