豬流感的流行現(xiàn)狀及分子生物學(xué)診斷方法研究進展

于新友，李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

豬流感的流行現(xiàn)狀及分子生物學(xué)診斷方法研究進展

于新友，李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

豬流感是由豬流感病毒引起的一種急性、高度接觸性豬呼吸道傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大的危害，豬流感病毒也可感染人類，威脅人類的生命健康。文內(nèi)通過綜述我國豬流感的流行現(xiàn)狀及分子生物學(xué)診斷方法的研究進展情況，以期對豬流感的診斷和防控工作提供參考。

豬流感；流行現(xiàn)狀；分子生物學(xué)；診斷

豬流感(swine influenza，SI)是由豬流感病毒(swine influenza virus，SIV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病。該病有明顯的季節(jié)性，早春、深秋和寒冷的冬季多發(fā)，各種年齡、性別和品種的豬均可感染[1]，臨床表現(xiàn)主要是發(fā)病急、呼吸困難、咳嗽、流淚、鼻液增多、衰竭、低死亡率等[2]。SIV可損害豬免疫系統(tǒng)，引起免疫抑制，繼發(fā)感染其他疾病，加劇病情，降低生產(chǎn)性能，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。由于豬呼吸道內(nèi)同時具有人流感和禽流感的唾液酸受體，因此，豬是禽、豬、人流感病毒共同易感宿主，是流感病毒基因重組或重配的“混合器”[3]，豬流感的公共衛(wèi)生學(xué)意義日益突出，在流感大流行中起著重要的作用[4]。本文簡要綜述了近年來我國豬流感的流行現(xiàn)狀與SIV分子生物學(xué)診斷方法研究進展情況，希望廣大基層獸醫(yī)工作者對SI引起足夠的重視，從而建立有效的診斷和防控機制，最大程度地減輕SI對養(yǎng)豬業(yè)所造成的危害。

1 我國豬流感流行現(xiàn)狀

1918年美國首次報道了豬流感[5]，迄今為止，歐、美、非、亞、澳等世界各大洲均有豬流感的發(fā)生和流行。目前，已經(jīng)分離的血清型有H1N1、H1N2、H2N3、H3N1，H3N2、H1N7、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2等，在我國豬群中流行較廣的主要是H1N1，H1N2和H3N2，也有H5N1和H9N2感染豬的相關(guān)報道[6-7]。王進香等[8]采用血凝抑制試驗(HI)對寧夏22個縣(區(qū)、市)43個規(guī)模豬場、10個屠宰場、197個散養(yǎng)戶的1 710份豬血清樣品進行了豬流感病毒H1、H3亞型抗體的檢測。結(jié)果顯示，被調(diào)查的樣品中，H1亞型抗體陽性率為11.81%，H3亞型抗體陽性率為0.46%，H1+H3亞型抗體陽性率為0.35%。劉旭等[9]對甘肅省14個地、市、州規(guī)?；B(yǎng)豬場未免疫流感疫苗的380份豬血清進行了豬流感H1N1、H3N2、H5和H9抗體檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多個市、州的豬群中檢出H1N1、H3N2、H5和H9抗體，陽性率分別為35.26%、28.15%、1.05%和7.89%。陳錦成等[10]采用HI對采集于廣東、湖南、河南省12個市縣28個規(guī)?；i場的799份血清進行H1和H3亞型豬流感病毒的抗體檢測。結(jié)果表明，H1亞型抗體陽性率在0～83.33%之間，豬抗體總陽性率為46.18%(369/799)，豬場陽性率為89.29%(25/28)。H3亞型抗體陽性率在0～100.00%之間，豬抗體總陽性率為61.33%(490/799)，豬場陽性率為85.71%(24/28)。廣東、湖南和河南地區(qū)H1亞型抗體陽性率分別為48.91%、40.26%和50.67%，H3亞型抗體陽性率分別為58.55%、70.78%和 78.67%。在被調(diào)查的上述3個地區(qū)的豬群中，H1和H3亞型豬流感病毒的感染較為普遍，其中H3亞型感染率高于H1亞型，且各地區(qū)豬流感病毒的流行情況存在地域性差異。李凱航等[11]2011年對上海市46個場戶的723份豬血清應(yīng)用HI和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)進行了檢測。結(jié)果顯示：該市豬群中豬流感病毒的H1亞型為優(yōu)勢亞型，H3亞型病毒感染率較低，被檢場戶流感病毒抗體的場陽性率為1.25%～100%，樣品陽性率為1.3%～74.7%。曹振鵬等[12]采用ELISA方法和HI對2011—2012年采集的1 050份血清樣品進行SIV血清學(xué)檢測。兩種檢測方法結(jié)果顯示1 050份血清樣品中SIV抗體陽性率分別為50.4%(ELISA)和50.2%(HI)。其中珠三角地區(qū)和粵東地區(qū)的感染率高于粵西地區(qū)。SIV亞型調(diào)查結(jié)果顯示該地區(qū)流行的SIV主要為H1和H3亞型，抗體陽性率分別為39.2%和18.2%(ELISA)。部分豬場存在H9亞型SIV抗體。部分豬群中同時存在H1和H3兩種亞型SIV抗體，表明豬群中存在不同亞型SIV混合感染。劉麗萍等[13]于2012年10月至2013年12月從全國養(yǎng)豬重點省份的養(yǎng)殖場、屠宰場采集豬血清樣品共計5 856份，采用HI進行豬流感抗體檢測。結(jié)果顯示，我國豬群中SIV抗體陽性率分別為55.52%、13.92%和2.00%，其中H1N1 SIV抗體平均陽性率高于其他亞型。2013年1月和3月份，又集中在廣東和湖南兩個省份的部分養(yǎng)殖場和屠宰場采集豬血清樣品共計9 910份，采用ELISA進行抗體檢測。結(jié)果共檢出陽性血清3 518份，平均陽性率分別為36.14%和34.89%。王剛等[14]于2009—2014年期間分別從西藏林芝、拉薩、山南、日喀則、昌都和那曲等地區(qū)隨機采集豬血清1 537頭份，采用ELISA法進行抗體檢測。結(jié)果表明：西藏地區(qū)SIV H1N1抗體陽性率達71%，SIV H3N2抗體陽性率達27%，SIV H1N1和H31N2抗體陽性重復(fù)率達19%。何淑儀等[15]采用HI，對2013—2014年從5個省份采集的2 208份血清樣品進行SIV血清學(xué)檢測，結(jié)果顯示陽性血清共1 269份(57.42%)，其中廣東省和廣西省的感染率最高(P＜0.01)。H1N1 SIV、H3N2 SIV抗體陽性率分別為22.51%、32.97%。H1N1 SIV和H3N2 SIV在冬季血清陽性率最高，然而在冬末(2月)陽性率卻最低(P ＜0.01)。母豬的H1N1 SIV抗體陽性率高于仔豬和育肥豬，但仔豬的H3N2 SIV抗體陽性率卻比較高。隋金鈺等[16]分別對2013年11-12月期間采集于福建等9個重點養(yǎng)豬省份的2 198份以及2014年3-4月期間采自于廣東和湖南兩省的3 654份豬血清樣品進行了血凝抑制抗體的檢測。結(jié)果顯示，2013年我國豬群中歐亞類禽型豬H1N1、2009/H1N1、H3N2 SIV、H5N1 AIV、H9N2 AIV及H7N9流感病毒平均抗體陽性率分別為49.73%、11.87%、1.71%、0、0、1.36%，2014年分別為48.52%、12.10%、1.04%、0、0、2.05%。

2 豬流感病毒分子生物學(xué)診斷方法研究進展

2.1 核酸探針

核酸探針技術(shù)是常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，它具有操作簡單，不受抗原抗體反應(yīng)的限制，結(jié)果易于判定等優(yōu)點。Junk等用非放射性地高辛標記的582個堿基cDNA探針來檢測A型H1N1 SIV編碼核蛋白的RNA，陽性細胞呈明顯的暗黑色，證明該探針有較好的特異性和敏感性。呂翠等[17]以地高辛標記SIV基質(zhì)蛋白(M)基因的保守片段制成核酸探針，與H1及H3亞型的SIV的cDNA、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的cDNA、豬圓環(huán)病毒2型的DNA、豬瘟病毒cDNA、豬偽狂犬病的DNA進行斑點雜交，以檢測探針的特異性，結(jié)果該探針僅與H1及H3亞型的SIV的cDNA雜交呈陽性，與其余病毒雜交呈陰性，敏感性試驗顯示，探針最低能檢出約5 pg的H3亞型的SIV RT-PCR產(chǎn)物，應(yīng)用該探針對35份疑似SI臨床病料進行檢測，結(jié)果檢出9份陽性，與RT-PCR檢測結(jié)果一致。

2.2 RT-PCR方法

RT-PCR是以病毒的RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，再以PCR進行核酸擴增來檢測病毒的方法，以其簡便、迅速、靈敏等優(yōu)點在動物疾病診斷上得到了廣泛的應(yīng)用。王隆柏等[18]根據(jù)GenBank發(fā)表H1N1、H1N2和H3N2亞型豬流感病毒M基因片段的引物序列，設(shè)計合成1對引物，建立豬流感病毒RTPCR檢測方法。結(jié)果顯示，該法能擴增出675 bp的基因片段，同條件擴增的偽狂犬病毒、豬瘟病毒、圓環(huán)病毒2型及豬繁殖與呼吸綜合征病毒均為陰性，可檢測到3.5 pg豬流感的核酸，能從被流感病毒感染的小白鼠和疑似豬流感的病料中檢測到SIV。

2.3 多重RT-PCR方法

多重PCR是在單一PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，通過寡核苷酸引物組合，在一個PCR反應(yīng)體系中同時擴增多個靶序列，其擴增的特異性和效率與單一PCR相當，但同時可擴增針對不同模板的多個靶序列，能節(jié)約時間和精力。齊海濤等[19]根據(jù)GenBank中H1N1和H3N2亞型SIV血凝素、神經(jīng)氨酸酶和M基因保守序列，分別設(shè)計合成了5對特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)對SIV的型和亞型進行鑒定。結(jié)果表明，該方法的型RT-PCR可以檢測出104EID50病毒量所提取的RNA，H1、H3、N1和N2的亞型RT-PCR均可以檢測出104EID50病毒量所提取的RNA。除每對特異性引物所對應(yīng)的亞型外，對其他亞型及豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒的檢測均為陰性。王洪光等[20]根據(jù)GenBank登錄的相關(guān)病毒基因序列，選擇保守區(qū)域設(shè)計引物，經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了可同時檢測以豬繁殖與呼吸綜合征病毒與SIV的RT-PCR診斷方法，擴增的目的片段長度分別為364 bp和981 bp。通過實驗證明該方法具有良好的特異性和較高的敏感性，對豬繁殖與呼吸綜合征病毒和SIV的核酸檢測最低濃度分別為3.2×10-3ng和2.7×10-3ng。應(yīng)用該方法對32份臨床樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)，豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性率為43.8%，SIV陽性率為31.3%，二重感染率為9.4%。韋冠東等[21]根據(jù)GenBank登錄的相關(guān)病毒基因序列，選擇保守區(qū)域設(shè)計引物，經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了可同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒與SIV的三重RT-PCR診斷方法，擴增的目的片段長度分別為364 bp、530 bp和981 bp。通過實驗證明該方法具有良好的特異性和較高的敏感性，對豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和SIV的核酸檢測最低濃度分別為3.2×10-2ng、8.3×10-2ng和3.7×10-2ng。

2.4 熒光定量RT-PCR方法

實時熒光定量PCR是融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點，具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點。張?zhí)璧萚22]選取SIV的核蛋白基因序列設(shè)計引物和探針，建立了檢測SIV的TaqMan實時熒光定量PCR方法。以梯度稀釋的含有SIV目的擴增片段的質(zhì)粒作為標準品，進行定量PCR反應(yīng)以確定檢測靈敏度。2.0×108至2.0×102拷貝/μL 7個數(shù)量級的范圍內(nèi)定量PCR有“S”型擴增曲線，檢測靈敏度為20個拷貝/μL，并根據(jù)病毒拷貝數(shù)與Ct值的關(guān)系繪制了標準曲線。該方法具有特異性，對豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸都沒有擴增反應(yīng)。劉好朋等[23]根據(jù)H1亞型SIV血凝素基因保守序列，分別設(shè)計并合成1對特異性引物和1條TaqMan MGB探針，建立檢測H1亞型SIV的一步法實時熒光定量RT-PCR技術(shù)。結(jié)果顯示，該方法的敏感性可達102拷貝/ μL，除H1亞型SIV外，對H3N2亞型SIV、H9N1亞型SIV、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒的檢測均為陰性，且應(yīng)用該方法對疑似豬流感樣品進行檢測，其結(jié)果與SPF雞胚分離病毒方法結(jié)果的符合率為94%。王建華等[24]分別根據(jù)尼帕病毒(NiV)和SIV的M基因序列設(shè)計引物和TaqMan-MGB探針，通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立了一種鑒別NiV和SIV的雙重實時熒光定量RT-PCR檢測方法，對該方法的定量線性范圍、敏感性、重復(fù)性和特異性進行了評價及初步應(yīng)用。結(jié)果顯示，用該方法檢測NiVM基因的RNA標準對照(NiV-M-RNA)和SIVM基因的RNA標準對照(SIV-M-RNA)，定量線性范圍分別為4.6×101copies/ μL-4.6×108copies/μL和 5.8× 101copies/μL-5.8×108copies/μL，檢出限分別為46個拷貝和58個拷貝。該方法的組內(nèi)試驗和組間試驗的變異系數(shù)均小于1.6%，顯示其良好的可重復(fù)性。該方法僅對NiV-M-RNA和SIV呈現(xiàn)特異性擴增曲線，不與豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細小病毒、豬圓環(huán)病毒2型和偽狂犬病病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.5 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法是日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一項恒溫核酸擴增技術(shù)，具有操作簡便、快速、敏感、特異等特點，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用。蘇霞等[25]從GenBank中獲得H1N1 SIV血凝素、神經(jīng)氨酸酶基因序列，應(yīng)用DNAStar軟件MegAlign程序分析其序列，利用Primer ExplorerV4軟件在序列保守區(qū)域設(shè)計LAMP引物，即外引物和內(nèi)引物，同時以H1N1 SIV的cDNA作為陽性模板，對實驗中的幾個反應(yīng)條件進行優(yōu)化。建立H1N1 SIV LAMP快速檢測方法。結(jié)果顯示，該法對H1N1 SIV的靈敏度達到4～6個拷貝，其引物對于H9亞型禽流感病毒、豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒均無非特異性擴增，表現(xiàn)出良好的特異性。張莉等[26]針對SIV NP基因保守區(qū)域設(shè)計并合成6條引物，建立了SIV的LAMP檢測方法，并進行了特異性、敏感性和重復(fù)性試驗。結(jié)果顯示，該方法可特異性檢測H1N1、H1N2、H3N2、類禽H1N1亞型SIV及甲型H1N1流感病毒，但不能檢測出豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細小病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、日本乙型腦炎病毒，該方法的最低檢測量為100拷貝/μL質(zhì)粒DNA。

3 小結(jié)與展望

SI是一種世界性的豬的呼吸道傳染病，在豬場內(nèi)廣泛存在，是規(guī)?；B(yǎng)豬場的常發(fā)病，并呈現(xiàn)地方流行性，單純感染SIV后，豬死亡率并不高，但SI是一種免疫抑制性疾病，容易導(dǎo)致其他病原繼發(fā)感染，造成豬大量死亡。SIV能感染人，威脅人的生命安全，因此，平時要加強豬飼養(yǎng)管理和日常衛(wèi)生消毒工作，降低飼養(yǎng)密度，增強豬的抵抗力，控制好豬只和人員進出，防止疫病的傳入，可以定期免疫現(xiàn)有滅活疫苗，有條件的豬場也可分離出相應(yīng)毒株，委托一些生物制品企業(yè)生產(chǎn)自家苗。對已發(fā)生豬流感的豬場，對全群豬緊急免疫接種滅活疫苗，并肌注抗生素，避免其他細菌病的繼發(fā)感染，隔離病豬，保證病豬的休息和營養(yǎng)，加強管理，防止病毒傳播。一旦發(fā)現(xiàn)豬疑似感染豬流感，一定要做好個人防護工作，盡量佩戴口罩、手套、帽子，接觸后洗手、洗澡，避免感染SIV。

SI及時準確的檢測對其防控意義重大，目前SI的血清學(xué)檢測方法主要有HI和ELISA，但這些方法不能區(qū)分是疫苗毒還是野毒產(chǎn)生的抗體，而病原檢測中病原分離、鑒定的檢測方法雖然準確、可靠，但耗時太長，滿足不了臨床快速確診的需求，因此，需要采用近幾年發(fā)展起來的分子生物學(xué)方法進行檢測，雖然目前已經(jīng)建立了多種分子診斷方法，在臨床SI的診斷中起到了一定作用，但這些方法都有利有弊，如常規(guī)RT-PCR方法敏感性不夠高，可能造成漏檢，且不能實現(xiàn)對病毒的定量檢測，熒光定量RT-PCR方法可彌補常規(guī)RT-PCR的缺點，但對人員和設(shè)備儀器要求太高，基層人員不易掌握儀器的操作使用和結(jié)果的分析，需要儀器和耗材的維持運作費用較高，不適合獸醫(yī)基層單位大規(guī)模推廣和應(yīng)用。LAMP方法檢測快速、簡便，適合在基層獸醫(yī)和養(yǎng)殖場進行推廣使用，但容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，上述檢測試劑的核酸檢測試劑均需要冷凍保存，成本高昂且運輸半徑極其受限，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，目前對其他疾病的檢測方面已經(jīng)研制出了基因試紙卡檢測盒，具有LAMP檢測方法的優(yōu)點，又能避免假陽性的出現(xiàn)，操作簡單，全程時間短，最重要的是檢測試劑不需要冷凍保存，易保存和運輸，適合基層獸醫(yī)部門應(yīng)用，筆者認為基因試紙卡及其配套適合攜帶的簡易核酸制備設(shè)備是未來SIV檢測試劑的研究方向。

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2016-05-10）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-06-022-15) ，山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2013CQ006)，山東省自然科學(xué)基金青年基金項目（ZR2014CQ010）

于新友(1983-)，男，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷技術(shù)研究