馬傳染性貧血瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的影響因素

唐艷榮 張海云 張雪梅 王艷紅 楊 榮

（北京市朝陽(yáng)區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100018）

?

馬傳染性貧血瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的影響因素

唐艷榮 張海云 張雪梅 王艷紅 楊 榮

（北京市朝陽(yáng)區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100018）

[摘 要]在馬傳染性貧血防治（簡(jiǎn)稱馬傳貧）工作中，仍以瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)為主要檢測(cè)手段。該方法簡(jiǎn)便特異、快速。但是，該試驗(yàn)容易受到多種因素的影響，使試驗(yàn)特異性、敏感性、精確性不理想，結(jié)果判斷的不準(zhǔn)確。本文就抗原、抗體性質(zhì)、瓊脂板以及反應(yīng)條件等各種影響因素及試驗(yàn)中的注意事項(xiàng)對(duì)馬傳染性貧血病瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的影響進(jìn)行了逐一分析。

[關(guān)鍵詞]馬傳染性貧血 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 影響因素 注意事項(xiàng)

馬傳染性貧血病是馬屬動(dòng)物以反復(fù)發(fā)作、貧血和持續(xù)病毒血癥為特征的傳染性疾病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為B類疫病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部列為二類動(dòng)物疫病。瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)診斷方法是根據(jù)OIE《診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)》和我國(guó)實(shí)際情況制定。該方法在國(guó)際貿(mào)易中為指定的診斷方法，并且簡(jiǎn)便特異。長(zhǎng)久以來(lái)各地區(qū)在防治馬傳貧工作中，仍以瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)法為主要檢測(cè)手段。

但是，該試驗(yàn)容易受到多種因素的影響而導(dǎo)致試驗(yàn)特異性、敏感性、精確性以及結(jié)果判斷的不準(zhǔn)確。本文筆者根據(jù)多年試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，就各種因素及試驗(yàn)注意事項(xiàng)對(duì)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的影響進(jìn)行了逐一分析。以供同行們參考。

1 試驗(yàn)的影響因素

1.1 抗原、抗體因素

1.1.1 抗原、抗體的水溶解性

馬傳貧瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是利用可溶性的抗原與抗體在瓊脂凝膠網(wǎng)格中的水中自由擴(kuò)散，相互結(jié)合形成的沉淀線來(lái)判斷結(jié)果的。該試驗(yàn)要求抗原與抗體必須是水溶性的，所以一些顆粒性的抗原如細(xì)菌、紅細(xì)胞等是不溶的，這樣的抗原相對(duì)應(yīng)的抗體效價(jià)就不能用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)來(lái)測(cè)定?？贵w在非等電點(diǎn)pH值都是水溶性的，所以，試驗(yàn)中調(diào)節(jié)好瓊脂板的pH值就不會(huì)影響抗體的水溶性?？乖贵w的水溶性是瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的首要條件。

1.1.2 抗原、抗體濃度和純度

馬傳貧瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)中所形成的沉淀線的粗細(xì)、清晰度與抗原抗體的量成正比?？乖⒖贵w濃度較高時(shí)，試驗(yàn)的敏感性提高，容易形成清晰可見(jiàn)的沉淀線。但是濃度過(guò)高就有可能導(dǎo)致連線或無(wú)法判斷結(jié)果。抗原與其對(duì)應(yīng)的抗體的反應(yīng)屬于特異性反應(yīng)。但是如果兩者純度較低，含有過(guò)多與反應(yīng)無(wú)關(guān)的蛋白質(zhì)、類脂質(zhì)、多糖等非特異性物質(zhì)，往往抑制抗原抗體的特異性、敏感性。

1.1.3 抗原、抗體的反應(yīng)比例

在馬傳貧瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)中，過(guò)多的抗原或抗體都可能降低實(shí)驗(yàn)敏感性。當(dāng)抗原抗體的反應(yīng)比例適宜時(shí)，抗原抗體結(jié)合后尚未達(dá)到飽和的位點(diǎn)可與其他游離的抗原抗體繼續(xù)結(jié)合，逐漸形成越來(lái)越大的復(fù)合物，最后在抗原與抗體孔之間形成肉眼可見(jiàn)的沉淀線。此時(shí)反應(yīng)最快、最明顯。但當(dāng)兩者的反應(yīng)比例不適合時(shí)，少的一方在聚合初期就達(dá)到飽和，沉淀線變得不清晰甚至沒(méi)有沉淀線，而且沉淀線偏移，向量少的一方移動(dòng)。

1.2 瓊脂及瓊脂板因素

1.2.1 瓊脂粉的質(zhì)量

瓊脂中的不溶性雜質(zhì)和礦物質(zhì)等是影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果主要因素。不溶性雜質(zhì)能直堵塞瓊脂的網(wǎng)格，這樣的雜質(zhì)過(guò)多會(huì)影響抗原抗體的擴(kuò)散，為了避免這些雜質(zhì)的影響，可選擇高質(zhì)量的瓊脂糖制作瓊脂板。瓊脂中的礦物質(zhì)、金屬鹽離子等可能導(dǎo)致抗體、抗原變性或被破壞，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果精確性。

1.2.2 瓊脂的濃度、黏度

在此瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)中瓊脂主要作為一種空間支持結(jié)構(gòu)。它溶于水冷卻凝固后內(nèi)部形成多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。可允許大分子物質(zhì)自由通過(guò)。而孔徑的大小與瓊脂濃度成反比。實(shí)驗(yàn)中常用的瓊脂濃度為0.8%～1.5%。1.0%瓊脂凝膠孔徑為85nm，大多數(shù)抗原、抗體都可以在瓊脂中自由擴(kuò)散。所以，實(shí)驗(yàn)中如果瓊脂濃度增大容易阻滯抗原、抗體的擴(kuò)散，降低實(shí)驗(yàn)敏感性。瓊脂的濃度應(yīng)該根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)的要求進(jìn)行確定。瓊脂質(zhì)量和加熱溶解過(guò)程水分蒸發(fā)是導(dǎo)致瓊脂濃度變化的主要原因.實(shí)驗(yàn)中應(yīng)予以注意。另外，瓊脂的黏度也是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素之。瓊脂黏度過(guò)大，抗原抗體擴(kuò)散速率減慢，降低實(shí)驗(yàn)敏感性。

1.2.3 電解質(zhì)

電介質(zhì)的存在可以降低免疫復(fù)合物表面的陰電荷，促使其沉淀。所以，適當(dāng)濃度的電介質(zhì)對(duì)免疫復(fù)合物沉淀線形成有促進(jìn)作用。但是，過(guò)高濃度的電解質(zhì)反又不利于抗原抗體沉淀物的形成。原因：（1）過(guò)高濃度的電解質(zhì)阻止蛋白質(zhì)與水分子的相互作用，破壞蛋白質(zhì)表面的水化層.產(chǎn)生鹽析效應(yīng)，使抗原抗體發(fā)生非特異性的沉淀；（2）抗體復(fù)合物形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程。過(guò)高濃度的電解質(zhì)可使抗原抗體結(jié)合物離解。過(guò)高濃度的電介質(zhì)能降低實(shí)驗(yàn)的特異性、精確性。臨床中最常用的電解質(zhì)為pH7.2的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）。

1.2.4 瓊脂的熬制時(shí)間

按1%左右（0.8%～1.5%）的比例加入pH7.2的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS），水浴煮沸融化最好不少于20 min。一方面，要待瓊脂完全溶解，瓊脂溶解不完全將會(huì)嚴(yán)重影響抗原、抗體的擴(kuò)散。甚至直導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。另一方面，熬制時(shí)間過(guò)短，制作出的瓊脂板易滋生細(xì)菌，影響試驗(yàn)的判斷。

1.2.5 瓊脂板的厚度

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)使用的瓊脂板的厚度應(yīng)為2～3mm左右，且制作瓊脂板時(shí)不要產(chǎn)生氣泡。如果瓊脂板太厚，一方面，可能導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合物聚合量較少，形成的沉淀線不清晰，降低試驗(yàn)的敏感性。同時(shí)，瓊脂板太厚又可導(dǎo)致抗原或抗體擴(kuò)散的不均勻性概率增大，可能出現(xiàn)瓊脂底部與表面產(chǎn)生的沉淀線不在一個(gè)平面上，沉淀線發(fā)生扭曲，影響結(jié)果判斷。相反，瓊脂板太薄也會(huì)影響到試驗(yàn)的結(jié)果。

1.2.6 孔間距離

抗原抗體的孔間距離也能影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果。當(dāng)兩者之間的孔距為3～5mm時(shí)?？乖贵w既能形成合適的濃度梯度又能充分結(jié)合。當(dāng)兩者的孔間距離過(guò)大時(shí)，雖然能形成合適的濃度梯度。但由于抗原抗體量太少卻不能充分結(jié)合，敏感性降低。相反孔距太小，試驗(yàn)敏感性提高，卻不能形成合適的濃度梯度。根據(jù)要求可按相應(yīng)模板打孔，也可直用組合打孔器打孔。現(xiàn)在一般多打成梅花形孔圖。挑孔內(nèi)瓊脂時(shí)，注意不要挑破孔緣，以免對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響。

1.2.7 試驗(yàn)用水的影響

馬傳貧瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果在很大程度上也受到試驗(yàn)用水的影響。如果實(shí)驗(yàn)用水中含大量重金屬離子如鉛、汞、銅等。會(huì)使蛋白質(zhì)成分的抗原或抗體變性失去活性。不能再發(fā)生特異性反應(yīng)，降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性。配制pH7.2的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）時(shí)使用無(wú)離子水和蒸餾水，溶解瓊脂可以有效解決該問(wèn)題。

1.3 反應(yīng)條件

1.3.1 反應(yīng)溫度

抗原抗體的反應(yīng)速度、結(jié)合程度與反應(yīng)溫度高低有密切關(guān)系。溫度高，分子運(yùn)動(dòng)加快，增加抗原抗體碰撞概率，反應(yīng)會(huì)加快，但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)反應(yīng)速度反而變慢，抗原抗體復(fù)合物往往會(huì)重新解離，甚至?xí)黄茐?。反?yīng)溫度低時(shí)，反應(yīng)速度變慢，但抗原抗體結(jié)合完全，沉淀量增多，結(jié)果清晰，但溫度過(guò)低也會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。馬傳貧瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的最適反應(yīng)溫度為15℃～30℃左右。

1.3.2 空氣濕度

馬傳貧瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是抗原抗體在瓊脂網(wǎng)格的水中擴(kuò)散時(shí)形成的結(jié)果，如果空氣中濕度太低，瓊脂中的水分很容易蒸發(fā)，使瓊脂網(wǎng)格中的水分減少，瓊脂孔徑變小，不利于抗原抗體的自由擴(kuò)散，降低實(shí)驗(yàn)敏感度和精確度。所以，在進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)時(shí)。往往倒置平皿，然后放在一個(gè)有濕棉紗布的有蓋搪瓷盤中，以防水分蒸發(fā)。濕度過(guò)大可能使瓊脂表面形成水滴，導(dǎo)致抗原、抗體發(fā)生混合，也會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的判斷。

2 注意事項(xiàng)

2.1 加樣

樣品加入孔內(nèi)時(shí)，注意不要產(chǎn)生氣泡，以加滿為度。加少了，影響反應(yīng)程度，加多了，易溢出，也影響反應(yīng)結(jié)果。

2.2 封板

打孔后瓊脂底部融封效果也能影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果，在火焰上緩緩加熱時(shí)，且加熱要均勻，使孔底邊緣的瓊脂少許熔化，以封底，以免加樣后液體從孔底滲漏，影響試驗(yàn)結(jié)果。

2.3 結(jié)果判讀

（1）在觀察結(jié)果時(shí)，最好從不同折光角度仔細(xì)觀察平皿上抗原孔與受檢血清孔之間有無(wú)沉淀線。為了觀察方便，可在與平皿有適當(dāng)距離的下方，置一黑色紙等，有助于觀察。

（2）用做血清流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，將標(biāo)準(zhǔn)抗原置中心孔，周圍1、3、5孔加標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，2、4、6孔分別加待檢血清。待檢孔與陽(yáng)性孔出現(xiàn)的沉淀帶完全融合者判為陽(yáng)性。待檢血清無(wú)沉淀帶或所出現(xiàn)的沉淀帶與陽(yáng)性對(duì)照的沉淀帶完全交叉者判為陰性。待檢孔雖未出現(xiàn)沉淀帶，但兩陽(yáng)性孔的沉淀帶末端在近待檢孔時(shí)，兩端均向內(nèi)有所彎曲者判弱陽(yáng)性。若僅一端有所彎曲，另一端仍為直線者，判為可疑，需重檢。重檢時(shí)，可加大檢樣的量。檢樣孔無(wú)沉淀帶，但兩側(cè)陽(yáng)性孔的沉淀帶在近檢樣孔時(shí)變得模糊、消失，可能為待檢血清中抗體濃度過(guò)大，致使沉淀帶溶解，可將樣品稀釋后重檢。

（3）不規(guī)則的沉淀線可能是加樣過(guò)滿溢出、孔型不規(guī)則、邊緣開(kāi)裂、孔底滲漏、孵育時(shí)沒(méi)放水平、擴(kuò)散時(shí)瓊脂變干燥、溫度過(guò)高蛋白質(zhì)變性或未加防腐劑導(dǎo)致細(xì)菌污染等所致。

（4）抗原抗體的比例與沉淀帶的位置、清晰度有關(guān)。如抗原過(guò)多，沉淀帶向抗體孔偏移和增厚，反之亦然?？捎貌煌♂尪鹊姆磻?yīng)液試驗(yàn)后調(diào)節(jié)。

總之，多種因素都可以影響到瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的特異性、敏感性、精確性，甚至導(dǎo)致結(jié)果無(wú)法判斷。這也就要求試驗(yàn)工作者在試驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格按照要求進(jìn)行操作，并積極總結(jié)經(jīng)驗(yàn)及試驗(yàn)中的注意事項(xiàng)，在實(shí)踐中摸索掌握馬傳然性貧血瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的要點(diǎn)。

通訊作者：張海云（1964-），女，本科，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病防控工作。

作者簡(jiǎn)介：唐艷榮（1972-），女，本科，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病防控工作。