自體干細(xì)胞移植治療糖尿病足研究進(jìn)展

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自體干細(xì)胞移植治療糖尿病足研究進(jìn)展

阿賽古麗馬惠霞1張純2賀猛

(西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技能教研室,甘肅蘭州730030)

〔關(guān)鍵詞〕糖尿病足;自體干細(xì)胞

1臨夏州康樂縣白王鄉(xiāng)衛(wèi)生院2蘭州理工大學(xué)校醫(yī)院檢驗(yàn)科

第一作者：阿賽古麗(1972-)，女，教授，博士，主要從事臨床教學(xué)與研究。

糖尿病(DM)發(fā)病率在世界范圍內(nèi)上升，已成為繼心血管疾病及腫瘤后的第3大非傳染性疾病。本文就自體干細(xì)胞(SC)移植治療糖尿病足(DF)的研究進(jìn)展做一綜述。

1DF的概念和常規(guī)治療

DF〔1〕作為DM致死、致殘率較高的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，是由于血管發(fā)生硬化、狹窄、阻塞等病變導(dǎo)致肢體末端缺血，同時(shí)伴有周圍神經(jīng)病變，使患者出現(xiàn)感覺功能障礙且易并發(fā)細(xì)菌感染，常以靜息痛和足部潰瘍?yōu)橹饕憩F(xiàn)。DM所致的下肢血管缺血性改變與單純動脈硬化所致的下肢缺血性疾病相比較，前者的治療更為棘手，表現(xiàn)為治療更復(fù)雜、病程更長、預(yù)后更差。DF對各種治療方法不敏感,治療效果不佳,預(yù)后不良,病變惡化易導(dǎo)致截肢。DF的傳統(tǒng)治療方法有藥物治療、血管搭橋、局部涂抹中藥及介入治療，但是手術(shù)和介入治療對患者的選擇要求較高，有嚴(yán)格的指征，導(dǎo)致許多自身?xiàng)l件欠佳或合并有重要臟器嚴(yán)重病變而不能耐受搭橋手術(shù)及介入治療的中老年患者只能選擇藥物治療，而這些治療方法的遠(yuǎn)期效果均不理想且不能從根本上解決問題，很多患者最終無法避免截肢的厄運(yùn)。

2SC治療的機(jī)制

機(jī)體新血管的生成主要通過血管生成和血管新生2種方式，前者是指在胚胎發(fā)育過程中新生血管形成時(shí)，來源于中胚層的成血管細(xì)胞進(jìn)行原位分化，主要分化為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)及血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)，然后在原位形成原始的毛細(xì)血管網(wǎng)；后者是指通過VEC的增殖、遷移，內(nèi)皮細(xì)胞(EC)以生芽的方式在原有的血管上生長出新的血管。DM患者在糖、脂代謝嚴(yán)重紊亂的情況下，可導(dǎo)致EPC數(shù)量減少和功能障礙，影響其增殖、黏附和血管生成的能力。使用SC移植治療DF的理論基礎(chǔ)主要是SC擁有高度增殖、自我更新及多向分化的潛力，骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞和外周血在特定條件培養(yǎng)下能夠轉(zhuǎn)變成EPC，從而彌補(bǔ)DM患者新陳代謝紊亂所導(dǎo)致的EPC數(shù)量降低和功能的障礙。SC及EPC能分泌多種血管生成因子，改善患肢血液供應(yīng)且能刺激缺血肢體形成新生血管，建立新的側(cè)支循環(huán)，改善局部血液循環(huán)，增加血液灌注，促進(jìn)潰瘍愈合，使患者臨床癥狀減輕，降低截肢平面，甚至避免截肢。

3SC的分類和臨床應(yīng)用

3.1自體骨髓SC移植現(xiàn)用于移植的骨髓SC成分大體分為5種:骨髓單個(gè)核細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、造血干細(xì)胞(HSC)、邊緣細(xì)胞群和特殊細(xì)胞群等〔2〕。研究認(rèn)為HSC可表現(xiàn)為血管、血液的雙重活性，是血液循環(huán)中EC的豐富來源〔3〕。MSC在缺血、缺氧等特定刺激作用下可分化成EPC，后者進(jìn)一步增殖、分化形成VEC，重塑和形成新的血管。MSC具備內(nèi)皮分化的細(xì)胞免疫學(xué)基礎(chǔ)，首先向EPC方向分化成一種過渡性細(xì)胞群，此類型細(xì)胞再分化為VEC〔4〕。缺血和(或)缺氧等刺激可促進(jìn)組織向微環(huán)境中分泌有關(guān)的血管生長因子，骨髓單個(gè)核細(xì)胞含有數(shù)種細(xì)胞成分，包括EPC、MSC及骨髓基質(zhì)細(xì)胞等，其中CD34+細(xì)胞中含有EPC，這些細(xì)胞在組織缺血時(shí)可以分化成為VEC。在缺血缺氧的組織中，骨髓單個(gè)核細(xì)胞里面的CD34+細(xì)胞可以釋放出很多種能夠促進(jìn)血管生長的因子，因而可以促使新生血管形成〔5,6〕。骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植后起主要作用的是EPC，EPC移植到DM患者缺血下肢，在肢體缺血這種特定環(huán)境刺激下即可分化出大量EPC，通過分裂、增殖、產(chǎn)生大量成熟的EC，VEC再經(jīng)過增殖、分化、遷移能誘導(dǎo)毛細(xì)血管生成，改善缺血肢體的血液循環(huán)，達(dá)到治療目的。自體骨髓SC移植方法：在連續(xù)硬膜外麻醉或局部麻醉下在髂前上棘、髂前后棘等處抽取自體骨髓血 200~400 ml，去除紅細(xì)胞，經(jīng)密度梯度離心，分離出單核細(xì)胞懸液30~40 ml，計(jì)數(shù)細(xì)胞總量，并測出CD34+細(xì)胞的含量。將采集來的單個(gè)核細(xì)胞配制成16×108/ml的干細(xì)胞混懸液，然后在病變肢體小腿腓腸肌內(nèi)按1 cm×1 cm間距進(jìn)行多點(diǎn)注射，注射完畢后再對注射部位進(jìn)行較為適當(dāng)?shù)募訅喊?。谷涌泉等?〕首次采用下肢局部肌肉注射及下肢動脈導(dǎo)管注射SC治療血管病變導(dǎo)致缺血的肢體，取得較滿意的效果。張會峰等〔8〕選用30個(gè)臨床上已確診是DM下肢動脈血管阻塞或DF、還同時(shí)有不同程度周圍神經(jīng)病變的患者；選擇癥狀明顯、實(shí)驗(yàn)室檢查提示有嚴(yán)重的動脈閉塞及明顯神經(jīng)電生理改變的下肢為治療組，進(jìn)行自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療，對側(cè)肢體作為對照組，結(jié)果治療組總有效率(9.0%)高于對照組(4.0%)(P<0.05)。 Prochazka等〔9〕選取37例經(jīng)傳統(tǒng)藥物治療無效發(fā)生潰爛的患者進(jìn)行自體骨髓SC移植。全組30例患者通過治療保肢成功，7例由于末端發(fā)生了嚴(yán)重缺血導(dǎo)致壞疽，病情惡化而截肢。經(jīng)治療有效的患者行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查如經(jīng)皮動脈血壓測定、患肢血流灌注、感覺功能等均較治療前有明顯提高，再次證明骨髓SC移植對血管再生的有效性。

3.2自體外周血SC移植正常情況下人體內(nèi)的SC主要以骨髓為儲存場所，外周血中SC數(shù)量很少，不足以進(jìn)行SC移植，缺乏臨床研究價(jià)值。研究顯示正常健康人的循環(huán)血中CD34+細(xì)胞含量僅占外周血單核細(xì)胞數(shù)的0.02%〔10〕；經(jīng)骨髓動員后，外周血中的CD34+細(xì)胞含量明顯升高，CD34+細(xì)胞中含有較高濃度的EPC，而EPC在特定的刺激下如機(jī)體缺血、缺氧時(shí)可定向分化成VEC，從而促進(jìn)血管新生，改善患肢血液循環(huán)，促進(jìn)潰瘍愈合。在自體外周血HSC的移植過程中，進(jìn)行外周血HSC的動員時(shí)，最常使用的是重組人粒細(xì)胞集落刺激因子。它主要有兩方面作用：一方面能促進(jìn)粒系造血祖細(xì)胞的增殖與分化；另一方面還可有效地促進(jìn)骨髓中的HSC大量釋放到外周血中，促進(jìn)新生血管形成，改善患肢血液循環(huán)，促進(jìn)潰瘍愈合。2003年Matsui等〔11〕首次對骨髓和外周血SC進(jìn)行移植治療DM周圍血管性病變進(jìn)行臨床對照研究，結(jié)果肯定了自體骨髓單核細(xì)胞移植在有效增加缺血肢體血管再生方面的療效，而對于自體外周血單核細(xì)胞移植治療的有效性并沒有確切的證據(jù)。黃平平等〔12〕研究證明使用自體外周血SC移植對治療下肢缺血性疾病具有顯著療效，并提供相對有效的證據(jù)：他們對1例下肢動脈硬化閉塞的患者采用自體外周血SC移植，治療效果顯著，臨床癥狀較治療前明顯緩解，肢體末梢冷感和疼痛感顯著減輕，保留住了患肢，避免截肢的命運(yùn)。重組的人粒細(xì)胞集落刺激因子對骨髓單核細(xì)胞系具有明顯促進(jìn)作用，尤其對中性粒細(xì)胞的作用強(qiáng)大，它可促進(jìn)中性粒細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子并釋放入血。通過動員EPC入外周血，促進(jìn)新生血管生成，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。在SC動員過程中，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)在3~5 d內(nèi)急劇升高為正常值的數(shù)倍甚至數(shù)十倍，血液黏稠度明顯增加，易形成靜脈血栓，發(fā)生腦梗死、心肌梗死等心腦血管意外的可能性明顯高于正常人。研究〔13〕顯示，在動員的整個(gè)過程中，形成急性血栓或并發(fā)腦梗死、心肌梗死等并發(fā)癥的概率尚不足5%，且主要發(fā)生于外周血白細(xì)胞總數(shù)超過40×109/L時(shí)。為降低動員期間腦血管意外發(fā)生率應(yīng)注意：①使用各種措施控制血糖、血壓及血脂，盡可能保持在正常范圍之內(nèi)。對同時(shí)合并有冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、缺血性腦卒中的患者應(yīng)積極使用相關(guān)藥物加以控制，密切觀察病情變化，使患者盡量處于相對平穩(wěn)的狀態(tài)，減少血糖、血壓及血脂的波動幅度。②可在同一時(shí)間里皮下注射低分子肝素5 000 U/d或靜滴肝素10 000 U/d，加強(qiáng)抗凝。③用于動員的集落刺激因子的量要適當(dāng)，避免因過量引起外周血白細(xì)胞數(shù)過高。④4~5 d是進(jìn)行動員的最佳時(shí)間，動員期間應(yīng)每日行血常規(guī)檢查,觀察外周血白細(xì)胞總數(shù)的上升速度及幅度，同時(shí)觀察患者的臨床癥狀，把握采集的最佳時(shí)機(jī)，當(dāng)外周血白細(xì)胞總數(shù)升至(40~50)×109/L左右時(shí)可進(jìn)行采集，但如果發(fā)現(xiàn)有血栓形成及心腦血管并發(fā)癥出現(xiàn)的先兆時(shí)，可適當(dāng)提前采集的時(shí)間，但必須保證外周血白細(xì)胞總數(shù)高于30×109/L，在采集過程中適當(dāng)補(bǔ)充血容量，加大循環(huán)血量〔13〕。

黃平平等〔12〕開創(chuàng)了國內(nèi)使用SC對下肢缺血性病變進(jìn)行治療的先例。楊曉鳳等〔14〕對下肢缺血性病變患者采用同樣的方法進(jìn)行治療，大部分患者在早期即表現(xiàn)出對這一先進(jìn)技術(shù)的良好的反應(yīng)性，主要體現(xiàn)為：患者逐漸減輕的局部疼痛感、較前升高的皮膚溫度及逐漸紅潤的皮膚色澤，但各項(xiàng)檢查如血管超聲、血管造影均顯示此時(shí)尚未形成新生血管。患者癥狀緩解可能的原因主要是SC及EPC分泌釋放的各種血管生成因子,包括血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子及白細(xì)胞介素-18等〔15〕，促進(jìn)局部血液循環(huán)，使患肢血供得到改善。蔣銳等〔16〕使用自體外周血SC移植對23例臨床癥狀較為明顯的重度DF患者進(jìn)行治療，分別選取左下肢14條、右下肢12條，所選取的26條患肢均有明顯的靜息痛；其中發(fā)生足壞疽者18例，經(jīng)過一段時(shí)間治療后，治療組患者的疼痛緩解率85.70%(12/14)、冷感緩解率85.70%(12/14)、間歇性跛行緩解率71.40%(10/14)、潰瘍愈合率64.30%(9/14)。對照組分別為25.00%(3/12)、16.70%(2/12)、8.30%(1/12)、33.30%(4/12)和8.30%(1/12)。研究取得良好的效果，肯定其臨床應(yīng)用價(jià)值，再次證明自體外周血SC移植治療DF的有效性。

4安全性問題

進(jìn)行SC移植治療的過程中，免疫排斥反應(yīng)及刺激機(jī)體組織腫瘤生長是頗受關(guān)注的主要安全性問題。自體SC移植不會發(fā)生免疫排斥問題，但由于SC是未分化的具有多向分化潛能的細(xì)胞，是否會在移植部位分化為其他組織如肌肉組織、神經(jīng)組織、肝臟組織等，是否會激發(fā)體內(nèi)潛在惡性腫瘤及血管瘤的生長，目前尚未見報(bào)道。自體SC移植治療DF理論上講是安全而有效的，尤其是對于病變嚴(yán)重、自身?xiàng)l件差或合并有其他重要臟器病變不能進(jìn)行血管搭橋及介入手術(shù)的患者，但還需加大研究樣本，延長隨訪年限，進(jìn)一步明確有無遠(yuǎn)期并發(fā)癥的發(fā)生。

5展望

國內(nèi)外已有大量研究人員使用自體外周血SC及自體骨髓血SC移植治療下肢缺血性相關(guān)疾病，并取得顯著療效。為使這項(xiàng)新技術(shù)能廣泛應(yīng)用于廣大DM患者，廣大學(xué)者應(yīng)致力于以下問題的研究完善:①治療的效果與所選移植細(xì)胞的種類、數(shù)量及移植方式之間的關(guān)系。②完善SC采集方法。③選用的最好移植途徑、最有效治療量及最恰當(dāng)?shù)囊浦矔r(shí)間。④移植SC的質(zhì)量檢測、動員多長時(shí)間最為適宜及動員期間外周血白細(xì)胞數(shù)量的控制。⑤對SC移植的安全性問題，對移植后SC分化方向如何進(jìn)行監(jiān)控。⑥移植后產(chǎn)生的新生血管是否會再次出現(xiàn)狹窄甚至閉塞，如何預(yù)防其狹窄及閉塞。⑦自體SC在移植部位的增殖潛能及影響增殖潛能的各種因素。

6參考文獻(xiàn)

1陸再英，終南山.內(nèi)科學(xué)〔M〕.第7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007:777.

2葉帥，陳明衛(wèi).自體干細(xì)胞移植在治療糖尿病下肢缺血性血管病變中的應(yīng)用〔J〕.安徽醫(yī)藥，2012;16(4):426.

3Pescs M，Orlandi A，Lachininoto MG.Myoendothelial differentiation of human umbilical cord blood-derived stem cells in ischemic limb tissues〔J〕.Circ Res，2003;93(5):51-62.

4劉丹丹，王悅增，趙東海,等.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究〔J〕.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2006;22(4):423-8.

5Shintani S，Murohara T，Ikeda H，etal.Augmentation of postnatal neovascularization with autologous bone marrow transplantation〔J〕.Circulation，2001;103(6)：897-903.

6Takakura N，Watanabe T，Suenobu S，etal.A role for hematopoietic stem cells in promoting angiogenesis〔J〕.Cell，2000;102(2)：199-209.

7谷涌泉，郭連瑞，張建,等.自體骨髓干細(xì)胞移植治療嚴(yán)重下肢缺血1例〔J〕.中國實(shí)用外科雜志，2003;23(11):670.

8張會峰，趙志剛，袁慧娟,等.自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療糖尿病下肢周圍神經(jīng)病變〔J〕.中國組織工程研究，2012;16(6):1137-40.

9Prochazka V，Gumulec J，Chmelová J，etal.Autologous bone marrow stem cell transplantation in patients with end-stage chronical critical limb ischemia and diabetic foot〔J〕.Vnitr Lek，2009;55(3):173-8.

10顏雪蕓，陳書艷.內(nèi)皮祖細(xì)胞的研究及進(jìn)展〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2005;21(6)：803-6.

11Matsui K，Murakami Y，Yoshioka T，etal.Therapeutic angiogenesis by transplantation of autologous bone marrow and peripheral blood mouonuclear cells in patients with peripheral arterial disease〔J〕.Int J Angiol,2003;12(3)：155-61.

12黃平平，李尚珠，韓明哲,等.自體外周血干細(xì)胞移植治療下肢動脈硬化閉塞癥〔J〕.中華血液學(xué)雜志，2003;24(6)：308-11.

13張軼斌，楊曉鳳，王紅梅，等.自體外周血干細(xì)胞移植治療下肢缺血性疾病術(shù)前行干細(xì)胞動員引發(fā)心腦血管危險(xiǎn)因素的探討〔J〕.臨床內(nèi)科雜志，2005;22(6)：422.

14楊曉鳳，吳雁翔，王紅梅,等.自體外周血干細(xì)胞移植治療62例缺血性下肢血管病的臨床研究〔J〕.中華內(nèi)科雜志，2005；44(2)：95-8.

15Iba O，Matsubara H，Nozawa Y，etal.Angiogenesis by implantation of peripheral blood mononuclear cells and platelets into ischemic limbs〔J〕.Circulation，2002;106(15)：2019-25.

16 蔣銳，謝明，張秋萍,等.自體外周血造血干細(xì)胞移植治療糖尿病足的臨床觀察〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012;22(4)：96-8.

〔2014-11-08修回〕

(編輯王一涵)

〔中圖分類號〕R587.2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)04-1020-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.120