SCF/c-Kit在缺血性腦血管病血管再生中的作用

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SCF/c-Kit在缺血性腦血管病血管再生中的作用

盧桃利羅勇

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016)

關(guān)鍵詞〔〕SCF/c-Kit；血管再生；內(nèi)皮祖細(xì)胞

第一作者：盧桃利(1986-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事腦血管病的損傷及保護(hù)機(jī)制研究。

干細(xì)胞因子(SCF)是一種低氧誘導(dǎo)細(xì)胞因子，在心肌缺血、腦卒中和動脈閉塞等病理損傷后大量上調(diào)。SCF因能通過與受體c-Kit結(jié)合促進(jìn)造血干細(xì)胞(HSCs)/內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)生存、黏附、動員〔1〕。腦缺血后EPCs參與的血管發(fā)生在促進(jìn)血管、神經(jīng)再生及神經(jīng)功能恢復(fù)方面發(fā)揮著主要作用。已證實(shí)腦缺血后SCF/c-Kit信號通路能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)在腦內(nèi)的動員、遷移及歸巢，利于腦缺血后的神經(jīng)再生〔2〕。但關(guān)于SCF/c-Kit信號通路促進(jìn)骨髓EPCs動員到外周血，遷移及歸巢到腦內(nèi)等過程尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本文就SCF/c-Kit信號通路在缺血性腦血管病中的可能作用作一綜述。

1SCF及其受體的生物學(xué)特點(diǎn)

SCF又稱肥大細(xì)胞生長因子(MGF)，Kit配體(KL)及Steel因子(SLF)。它是由骨髓微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一種酸性糖蛋白，其糖基連在肽鍵的N和O基團(tuán)上，相對分子質(zhì)量31 000～36 000，由非共價(jià)結(jié)合的兩個(gè)相同亞基組成，等電點(diǎn)PI=3.8〔3〕。SCF共有273個(gè)氨基酸〔4〕，從-25～-1為信號肽，+1～+189為膜外功能區(qū)，+190～+216為跨膜區(qū)，+217～+248為胞質(zhì)功能區(qū)。鼠與人的SCF有83%的同源性。天然SCF有兩種存在形式：可溶型SCF(sKitL)與膜結(jié)合型SCF(mKitL)。sKitL由可溶型SCF蛋白編碼248個(gè)氨基酸，有跨膜區(qū)，在第6外顯子中有一蛋白酶切割位點(diǎn)，經(jīng)蛋白酶水解去掉跨膜區(qū)，最終產(chǎn)物為N末端165氨基酸，仍為可溶型，并具有SCF活性；mKitL由膜結(jié)合型SCF蛋白編碼220個(gè)氨基酸，有跨膜區(qū)，mRNA在拼接過程中去除第6個(gè)外顯子(149～177氨基酸)，從而缺少蛋白酶切割位點(diǎn)，保留跨膜區(qū)〔5〕?？傊?，SCF的兩種形式為同一編碼mRNA在不同位點(diǎn)剪切所致，故SCF為兩種不同mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在動員EPCs的過程中起主要作用的是sKitL〔6〕。

SCF配體是原癌基因c-Kit編碼蛋白，分子量為145 kD，也被稱為CD117。人類c-Kit原癌基因定位于4號染色體q31～34區(qū)。編碼一個(gè)由976個(gè)氨基酸殘基組成的跨膜蛋白：胞外區(qū)497個(gè)，跨膜區(qū)23個(gè)，胞內(nèi)區(qū)433個(gè)。其中胞外區(qū)包含5個(gè)免疫球蛋白區(qū)(1～9號外顯子)，第2和第3個(gè)免疫球蛋白區(qū)是與SCF結(jié)合的關(guān)鍵部位，第4及第5個(gè)免疫球蛋白區(qū)是形成二聚化必不可少的區(qū)域，含有5個(gè)k樣結(jié)構(gòu)，且具有酪氨酸激酶活性，能夠在SCF、血小板衍生因子(PDGF)或集落刺激因子(CSF)-1的作用下產(chǎn)生相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)〔7〕。1%～4%正常人的骨髓干細(xì)胞表面可表達(dá)c-Kit受體，且在人CD34+造血細(xì)胞中大約60%～75%的細(xì)胞表面表達(dá)c-Kit受體，其具體表達(dá)情況隨造血干/祖細(xì)胞的發(fā)育成熟呈現(xiàn)一定變化趨勢，原始造血細(xì)胞表面c-Kit較少，祖細(xì)胞水平時(shí)達(dá)到高峰，隨著祖細(xì)胞向成熟血細(xì)胞分化而逐漸降低，到終末分化血細(xì)胞表面不再有c-Kit的表達(dá)〔8〕。SCF與c-Kit之間的特異性結(jié)合可觸發(fā)c-Kit的同源二聚體化和細(xì)胞膜內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化，產(chǎn)生停泊位點(diǎn)，捕獲含有SH2結(jié)構(gòu)域的信號分子、還能直接激活蛋白激酶C、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Ras相關(guān)的C3肉毒素底物(Rac1)、c-Ju-氨基末端激酶(JNK)、Raf-1蛋白激酶、Janus激酶(JAK)2等，通過多種信號因子的參與將細(xì)胞外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部，引發(fā)某些基因的特異性表達(dá)〔9〕。研究表明：SCF/c-Kit下游信號轉(zhuǎn)錄情況是非常復(fù)雜的，它是各種底物激酶酪氨酸磷酸化和絲/蘇氨酸激酶磷酸化的共同參與和整合，且存在許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的串話作用(cross-talking)，從而精確地調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、生存、黏附和遷移〔10〕，其具體機(jī)制是近年來信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的熱點(diǎn)問題。

2與SCF/c-Kit 相關(guān)的信號通路

2.1磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)通路SCF通過與受體c-Kit結(jié)合直接激活PI3K/Akt通路。當(dāng)SCF與c-Kit結(jié)合時(shí)，c-Kit受體酪氨酸激酶磷酸化，在激酶插入?yún)^(qū)第719位酪氨酸處與PI3K的p85亞基結(jié)合，使之磷酸化，激活p110催化亞基〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)c-Kit第719位酪氨酸(Y)突變?yōu)楸奖彼?F)時(shí)，既失去與PI3K p85亞基耦聯(lián)的能力，又喪失由SCF介導(dǎo)使PI3K活性增加的能力，但Y719F c-Kit自動磷酸化活性沒有損傷〔11〕。激活的蛋白激酶B(PKB)又能激活下游的信號分子p70核糖體S6激酶(p70S6K)、PKB(即Akt)和NF-κB〔12〕。

2.2Ras蛋白/絲裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路SCF與c-Kit結(jié)合激活Ras蛋白，誘導(dǎo)增殖反應(yīng)。SCF介導(dǎo)c-Kit的磷酸化，c-Kit 受體激活后，酪氨酸殘基703及936則通過Grb2的銜接及蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶SHP2、ShcA 間接或直接與Sos蛋白相作用，Ras直接與后者相關(guān)聯(lián)，激活Ras蛋白〔13〕。激活的Ras蛋白能繼續(xù)激活Raf-1(絲氨酸/蘇氨酸)激酶，并最終激活MAPK及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)。二者隨后磷酸化一系列的轉(zhuǎn)錄因子，影響基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控HSCs分化〔14〕。完整Src家族激酶(SFK)結(jié)合位點(diǎn)的存在是此通路激活不可或缺的條件〔15〕。

2.3Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)通路SCF參與誘導(dǎo)JAK/STAT通路的激活。SCF可以誘導(dǎo)JAK2與c-Kit耦聯(lián)，激活JAK2，使下游的STAT1a、STAT3、STAT5A、STAT5b磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖反應(yīng)〔16〕。STAT除通過JAK激活外，還可被c-Kit受體直接激活。當(dāng)SCF作用于表面表達(dá)有c-Kit受體的骨髓細(xì)胞和成纖維細(xì)胞時(shí)，c-Kit胞內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)域可誘導(dǎo)STAT1a、STAT3、STAT5A、STAT5b與之發(fā)生耦聯(lián)磷酸化〔17〕。SCF誘導(dǎo)的JAK/STAT 通路的活化與胚胎肝臟造血祖細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)。

2.4Src 通路目前發(fā)現(xiàn)的酪氨酸蛋白激酶Scr家族的成員有：Src、Yes、Fyn、Lck、Lyn、Blk、Hck〔18,19〕。SCF誘導(dǎo)激活的Scr家族成員有Scr、Yes、Lyn、Fyn。Scr主要通過SH2結(jié)構(gòu)域與激活的c-Kit近膜區(qū)的Y568、Y570磷酸化的酪氨酸特異性耦聯(lián)并磷酸化〔20〕。用反義寡核苷酸降低Lyn的表達(dá)能抑制SCF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。這與Lyn缺失的肥大細(xì)胞，SCF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖被削弱是一致的〔19〕。研究還發(fā)現(xiàn)Src家族與SCF誘導(dǎo)的c-Kit的運(yùn)輸有關(guān)，但具體機(jī)制還不清楚。

2.5磷酯酶C(Plc)-y通路Plc-y主要水解磷脂酰肌醇4，5二磷酸(PIP2)生成二酰甘油和1,4,5-三磷酸肌醇，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣水平，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究證實(shí)Plc-y的激活與mSCF有關(guān)，sSCF不能誘導(dǎo)Plc-y的磷酸化。而Plc-y主要與c-Kit酪氨酸殘基730和936作用，進(jìn)一步激活下游信號分子，在抗細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用〔21〕。

3SCF/c-Kit 與EPCs的關(guān)系

3.1c-Kit是EPCs早期標(biāo)志物之一目前把同時(shí)表達(dá)CD34+、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體(VEGFR)2+、CD133+的細(xì)胞稱為早期EPCs。有報(bào)道稱c-Kit(CD117)也可表達(dá)于早期EPCs，隨著EPCs向成熟內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)分化，c-Kit逐漸消失，出現(xiàn)血管性假血友病因子(vWF)和VE-cadhern等成熟ECs標(biāo)志物〔22,23〕。c-Kit的這一特性和CD133類似。但是否CD117也能像CD133一樣在識別EPCs方面有相對CD34、VEGFR2高的特異性，需待進(jìn)一步的證實(shí)。

3.2SCF/c-Kit參與EPCs的動員目前的觀點(diǎn)認(rèn)為SCF/c-Kit調(diào)節(jié)EPCs的動員受基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9的調(diào)控。MMP-9是骨髓EPCs動員的關(guān)鍵因素。Heissig等〔24,25〕證實(shí)MMP-9能把KitL從mKitL轉(zhuǎn)化為sKitL，EPCs可借助mKitL 結(jié)合于骨髓基質(zhì)細(xì)胞上。當(dāng)mKitL 轉(zhuǎn)變?yōu)閟KitL 時(shí)，EPCs 與基質(zhì)細(xì)胞的結(jié)合減弱，同時(shí)sKitL 可以促進(jìn)EPCs 的運(yùn)動，使EPCs 從骨髓動員到外周血，啟動EPCs動員的第一步。研究還證實(shí)MMP-9-/-小鼠的sKitL釋放減少，干細(xì)胞動員受抑制。Huang等〔26〕通過研究后肢缺血小鼠也證實(shí)MMP-9-/-小鼠缺血誘導(dǎo)的血管新生降低，這可能是由于sKitL釋放的減少，削弱了EPCs的動員、遷移及血管新生功能。Fazel等〔27〕也證實(shí)心肌缺血性損傷后，c-Kit的活化和sKitL的釋放是EPCs動員的關(guān)鍵，而c-Kit的激活和sKitL的釋放需要內(nèi)源性MMP-9，c-Kit缺失的小鼠心肌梗死(MI)后易發(fā)展為心衰。Dentelli等〔28〕通過體內(nèi)外研究表明，炎癥能誘導(dǎo)ECs表達(dá)mKitL，EPCs的歸巢依賴于c-Kit/mKitL的結(jié)合。敲除內(nèi)源性c-Kit或者用c-Kit抑制劑能阻止EPCs的黏附。

3.3SCF/c-Kit參與EPCs的遷移EPCs的遷移受SCF/c-Kit的調(diào)節(jié)。閻昕等〔29〕通過體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)SCF可誘導(dǎo)EPCs的遷移，對EPCs具有趨化作用，誘導(dǎo)血管生成。該實(shí)驗(yàn)把用流式細(xì)胞儀篩選出來的EPCs直接種植在transwell小室的上室，且把下室分為空白對照組、SCF組、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)組、Anti-SCF抗體組、免疫球蛋白G(IgG)組，12 h后分析數(shù)據(jù)為：SCF和VEGF組跨膜遷移的細(xì)胞數(shù)目為(118±6.5)個(gè)和(161±7.9)個(gè)，顯著高于空白對照組(47±4.7)個(gè)，說明此兩組促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用均顯著；IgG組細(xì)胞數(shù)為(43±6.3)個(gè)與空白對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Anti-SCF組跨膜遷移細(xì)胞數(shù)目最低約(33±4.0)個(gè)。Kuang等〔30〕也報(bào)道SCF/c-Kit信號通路參與心臟干細(xì)胞(CSCs)的遷移過程。大鼠MI后5天SCF mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)在梗死周圍向梗死中心增加有顯著意義。給予c-Kit受體能抑制SCF誘導(dǎo)CSCs的遷移。Sun等〔31〕報(bào)道SCF/c-Kit通路可能介導(dǎo)NSCs向腦損傷區(qū)遷移，NSCs具有向神經(jīng)元分化的潛能，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)再生。

3.4SCF/c-Kit促進(jìn)血管發(fā)生血管發(fā)生是指原始血管網(wǎng)的形成，通過血管母細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞形成迷宮樣的血管網(wǎng)絡(luò)，主要涉及EPCs的參與。研究證實(shí)，SCF能刺激HSCs的增殖分化，動員HSCs/EPCs到外周血，促進(jìn)血管發(fā)生〔32,33〕。Matsumoto等〔34〕報(bào)道抑制Lnk蛋白(SCF/c-Kit通路的抑制蛋白)能促進(jìn)SCF/c-Kit信號通路誘導(dǎo)的HSCs/EPCs的動員，促進(jìn)骨折周圍血管發(fā)生，利于骨折愈合。在炎癥反應(yīng)中，SCF/c-Kit同樣可以通過誘導(dǎo)EPCs到外周血，促進(jìn)病理性血管發(fā)生〔28〕。Abu EI-Asrar等〔35〕通過對8例糖尿病視網(wǎng)膜病(PDR)和12例非PDR病人視網(wǎng)膜ECs的c-Kit蛋白質(zhì)表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，PDR組較非PDR組均增加，得出SCF/c-Kit對EPCs的動員、募集有促進(jìn)作用，有利于PDR后的血管發(fā)生。Kim等〔36〕通過離體和在體實(shí)驗(yàn)證明SCF/c-Kit信號通路能直接促進(jìn)EPCs介導(dǎo)的血管發(fā)生，得出SCF的上調(diào)能促進(jìn)EPCs的動員，EPCs歸巢到缺血區(qū)，直接促進(jìn)EPCs介導(dǎo)的血管發(fā)生。

4SCF/c-Kit在缺血性腦血管病中的作用

SCF是一種多功能細(xì)胞生長因子，在神經(jīng)系統(tǒng)中有廣泛的表達(dá)，對神經(jīng)系統(tǒng)有重要作用，通過與VEGF、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)素等共同作用，作為NSCs的存活因子刺激NSCs增殖，在細(xì)胞增殖、分化和遷移過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Jin等〔2〕證實(shí)，腦缺血缺氧后能誘導(dǎo)神經(jīng)再生，這一過程需要營養(yǎng)因子SCF的參與。體外實(shí)驗(yàn)表明缺氧導(dǎo)致小鼠皮質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞神經(jīng)再生，這種作用是通過分泌SCF而實(shí)現(xiàn)的，SCF可刺激培養(yǎng)細(xì)胞和整體動物皮質(zhì)側(cè)腦室外側(cè)壁的室下帶(SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下層(SGZ)的神經(jīng)再生；在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)給予SCF后Brdu標(biāo)記的非成熟神經(jīng)元增加。Kawada等〔37〕也報(bào)道SCF能促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)再生，利于功能恢復(fù)。Erlandsson等〔38〕證實(shí)SCF對NSCs的遷移和存活具有重要作用，SCF可誘導(dǎo)NSCs的遷移。腦卒中后給予粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)/SCF能使梗死面積降低50%，梗死周圍的血管密度較對照組增加1.5倍，因而得出G-CSF/SCF可能通過誘導(dǎo)骨髓源性的血管發(fā)生，利于腦缺血后的功能恢復(fù)〔39〕。Zhao等〔40,41〕分別在腦卒中的急性期和慢性期給予造血因子G-CSF/SCF，發(fā)現(xiàn)G-CSF/SCF能降低梗死面積，神經(jīng)缺失癥狀得到改善，利于腦的恢復(fù)。

5展望

已證實(shí)eNOS-NO-MMP-9-KitL瀑布鏈在骨髓EPCs的動員、遷移方面發(fā)揮著重要作用。當(dāng)組織缺血、缺氧等損傷后，可釋放一系列信號因子，如VEGF、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1a、胎血生長因子(PLGF)等，它們被骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)識別后，與其相應(yīng)受體結(jié)合，通過PI3K/AKt通路激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)，eNOS能誘導(dǎo)產(chǎn)生NO，激活MMP-9，使mKitL水解成sKitL，再與其受體c-Kit結(jié)合，誘導(dǎo)骨髓EPCs從“骨髓龕”動員到外周血。這只是動員骨髓EPCs的第一步，其中的具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。以往的實(shí)驗(yàn)也得出：①腦缺血可促進(jìn)腦內(nèi)SDF-1a表達(dá)的上調(diào)，SDF-1a可能通過與其受體CXCR4結(jié)合誘導(dǎo)EPCs向腦內(nèi)遷移〔42〕；②腦缺血后腦內(nèi)PLGF、PI3K/AKt的表達(dá)也增加，而PLGF的上調(diào)能進(jìn)一步促進(jìn)SDF-1a /CXCR4表達(dá)的增加，進(jìn)而激活PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)骨髓EPCs釋放入血并歸巢到腦缺血區(qū)〔43～46〕；③腦缺血后腦內(nèi)eNOS、MMP-9、SCF/c-Kit的表達(dá)也上調(diào)，它們作為PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游信號分子共同參與腦缺血后EPCs的動員、遷移、歸巢〔47～49〕；④腦缺血后腦內(nèi)CD34、AC133表達(dá)上調(diào)，CD34、AC133是目前公認(rèn)的EPCs標(biāo)志物，通過流式檢測出腦缺血后外周血中EPCs的數(shù)量增加〔42,43,50〕。腦缺血確實(shí)能動員骨髓EPCs入外周血，并最終遷移入腦組織，但因涉及多種細(xì)胞因子及信號通路的參與具體機(jī)制仍不十分明確。

SCF是一種多功能細(xì)胞因子，通過與受體c-Kit的結(jié)合即能作為PI3K/Akt的下游信號分子參與EPCs的動員，也能作為一種促血管生長因子，通過激活多種信號通路誘導(dǎo)EPCs的動員、遷移、歸巢。目前在糖尿病、缺血性心肌病、炎癥、動脈閉塞等方面均證實(shí)c-Kit可通過與SCF結(jié)合動員EPCs，促進(jìn)EPCs向外周遷移，利于血管發(fā)生。在缺血性腦血管病中證實(shí)SCF/c-Kit信號通路參與腦缺血后NSCs的動員、遷移、歸巢，有利于腦缺血后的神經(jīng)再生。但是關(guān)于SCF/c-Kit信號通路促進(jìn)骨髓EPCs向腦內(nèi)遷移目前國內(nèi)外報(bào)道較少。因而腦缺血后對SCF/c-Kit信號通路的研究將會為骨髓EPCs的動員、遷移、歸巢及EPCs參與的促進(jìn)腦內(nèi)血管再生進(jìn)一步提供可靠依據(jù)。

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〔2014-06-19修回〕

(編輯馮超/王一涵)

通訊作者：羅勇(1965-)，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事腦血管病的損傷及保護(hù)機(jī)制研究。

基金項(xiàng)目：教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研 資助課題(No.20095503110001)；重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(渝中醫(yī)2005-B-24)；重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研重點(diǎn)資助項(xiàng)目(ZY20131027)

中圖分類號〔〕R743〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0229-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.105