p53在乳腺癌基因治療中的研究進(jìn)展

詹　媛　江錦良　鄔黎青

(江西省腫瘤醫(yī)院病理科，江西　南昌　330029)

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p53在乳腺癌基因治療中的研究進(jìn)展

詹媛江錦良1鄔黎青2

(江西省腫瘤醫(yī)院病理科，江西南昌330029)

p53基因；信號(hào)通路；細(xì)胞周期；乳腺癌；基因治療

全球每年有超過40萬的人死于乳腺癌。我國(guó)雖是低發(fā)地區(qū)，但乳腺癌患病率占所有腫瘤的7%～9%，患病人群也呈年輕化發(fā)展趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)50%的腫瘤存在p53突變，乳腺癌也存在p53異常，p53與腫瘤之間存在密切聯(lián)系。本文對(duì)p53在乳腺癌基因治療中的研究進(jìn)展作一綜述。

1　p53結(jié)構(gòu)及其特點(diǎn)

1979年Lane和Craword首次用免疫的方法發(fā)現(xiàn)猿猴空泡病毒(SV40)感染的NH3T3小鼠細(xì)胞核中存在一種物質(zhì)，它是能與SV40大T抗原相互作用的核酸化核蛋白即p53蛋白，繼而發(fā)現(xiàn)了p53基因〔1〕。p53分為野生型和突變型兩類，前者在維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞惡性增殖過程中起主要作用，使細(xì)胞分裂阻滯在DNA合成前期(G1)/DNA合成期(S)期，使細(xì)胞有足夠時(shí)間修復(fù)損傷，阻止細(xì)胞將損傷傳給子代。而mt-p53失去正常p53的抑癌作用，同時(shí)還因突變而具有癌基因的作用〔2〕。

野生p53(wt-p53)基因位于人染色體17p13.1區(qū)帶,含11個(gè)外顯子及10個(gè)內(nèi)含子，第1個(gè)外顯子不參與編碼。p53上游400 bp處有啟動(dòng)子p1,下游1 kb處有啟動(dòng)子p2，二者為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，其啟動(dòng)子不含CAAT盒、TATA盒、GC盒等常見啟動(dòng)序列。p53 基因中有5個(gè)高度保守區(qū),其中4個(gè)位于外顯子5～ 8。它們是突變熱點(diǎn)，分別編碼132～143、174～179、236～248 和272～281 號(hào)氨基酸。wt-p53基因轉(zhuǎn)錄為25 kb mRNA然后翻譯成393個(gè)氨基酸組成的分子量為53 kD的核磷酸化蛋白，其結(jié)構(gòu)有：N-末端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(1～42氨基酸)是高電荷區(qū)，含大量的酸性殘基，能與一系列蛋白結(jié)構(gòu)(如p14ARF 和p300)結(jié)合，而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能。信號(hào)區(qū)(64～92個(gè)氨基酸)能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還有順序?qū)Ｒ坏腄NA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(102～292氨基酸)，它能特異性地結(jié)合靶基因中的順勢(shì)作用元件,調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄活性。具有的DNA四聚體化結(jié)構(gòu)域(342～355個(gè)氨基酸)能抑制癌細(xì)胞增長(zhǎng)。C-末端的非專一DNA結(jié)合區(qū)(370～393個(gè)氨基酸)則是與非特異性的DNA序列結(jié)合。p53的特殊結(jié)構(gòu)決定了其重要分子生物學(xué)特性〔2～4〕。

2　p53基因在乳腺癌中的作用

國(guó)外研究報(bào)道〔4〕：15%～50%的乳腺癌存在p53缺失，相關(guān)研究對(duì)中國(guó)乳腺癌p53表達(dá)做了薈萃分析，結(jié)果表明乳腺癌中p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率平均達(dá)45%〔5〕，說明p53異常與乳腺癌之間存在緊密聯(lián)系。作為多種細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞應(yīng)答的中間環(huán)節(jié)，p53與基因網(wǎng)絡(luò)上、下游的各種基因及調(diào)控因子構(gòu)成精細(xì)的信號(hào)通路，通過細(xì)胞凋亡及衰老等方式來維持DNA穩(wěn)定。若p53發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定、損傷的DNA不能修復(fù)，那么機(jī)體則易形成腫瘤。乳腺癌的發(fā)生與p53異常有關(guān)，正常乳腺細(xì)胞中wt-p53是通過以下途徑維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定。

p53-鼠雙微體蛋白(MDM2)負(fù)反饋環(huán)路調(diào)控是一系列復(fù)雜的調(diào)節(jié)。wt-p53的失活常常是因?yàn)镸DM2調(diào)控的異常，后者是一種E3泛激素連接酶，它編碼一種鋅指蛋白P90能與p53結(jié)合，誘導(dǎo)p53的出核轉(zhuǎn)運(yùn)、促進(jìn)泛素化,最終p53被蛋白酶降解〔6〕。MDM2及MDMX(MDM4)具有同源性，MDM2能與p53直接發(fā)生作用，而后者雖不能直接作用于p53，但能夠增強(qiáng)MDM2活性，間接發(fā)揮作用〔6〕。當(dāng)DNA損傷、離子輻射激活信號(hào)通路時(shí)，共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張綜合征突變基因(ATM)及ATM-RAD3相關(guān)基因(ATR)可被激活，進(jìn)而導(dǎo)致p53及MDM2的磷酸化，使得p53與MDM2相互的結(jié)合能力下降，細(xì)胞核內(nèi)p53水平升高。另一條反饋機(jī)制腫瘤抑制蛋白p14ARF-MDM2環(huán)路〔7〕，它可以抑制p53-MDM2信號(hào)途徑，升高p53水平。細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(E2F)-1及Myc、Rasp14、Beta-catenin可增加ARF的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，從而使ARF與MDM2結(jié)合，抑制其E3泛素酶活性、增強(qiáng)p53功能。而p53又能下調(diào)ARF轉(zhuǎn)錄，形成精細(xì)的環(huán)路反饋。人體處于紫外線、離子輻射、化學(xué)誘變劑、致瘤病原體等復(fù)雜的外部環(huán)境暴露，導(dǎo)致乳腺細(xì)胞DNA發(fā)生損傷時(shí)，機(jī)體可以通過上述通路來維持細(xì)胞正常，增強(qiáng)p53抑癌功能，抑制腫瘤形成。倘若機(jī)體p53失活，那么乳腺細(xì)胞中損傷的DNA則會(huì)繼續(xù)傳給子代，最終形成乳腺腫瘤。

p53能激活下游靶基因GADD45、Bax、Puma、p21、Fas，發(fā)揮DNA修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯〔8〕、抑制腫瘤血管等功能〔9〕。 GADD45是第一個(gè)被檢出的 p53下游靶基因，它有生長(zhǎng)阻滯及DNA 損傷修復(fù)功能。p53為GADD45轉(zhuǎn)錄激活物，其編碼產(chǎn)物可以參與DNA 修復(fù)且抑制DNA 合成〔6〕。它可通過p53依賴及非依賴兩條途徑參與細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)、細(xì)胞凋亡等重要細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，并通過抑制細(xì)胞生長(zhǎng)及促進(jìn) DNA 損傷修復(fù)方式維持基因組穩(wěn)定性，抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤的惡性進(jìn)展〔10〕。p53還可以激活下游靶基因p21，p21作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)廣泛抑制劑，與細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)A-CDK2、CyclinD1-CDK4、CyclinE-CDK2復(fù)合物結(jié)合，抑制其相應(yīng)蛋白激酶活性，導(dǎo)致Rb不能磷酸化，轉(zhuǎn)錄因子E2F不能活化，最終引起G1/S期阻滯，使受損細(xì)胞有足夠時(shí)間修復(fù)損傷〔10，11〕。若DNA 的損傷發(fā)生在 S期之前，p21 蛋白主要通過與CDK/Cyclin 結(jié)合并抑制其功能使細(xì)胞周期停滯于 G1期。而發(fā)生在S期的損傷，主要是通過p21 與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的相互作用來阻滯細(xì)胞周期。p21WAF1/CIP1基因在羧基末端編碼一個(gè) PCNA 結(jié)合域，p21和PCNA結(jié)合可直接抑制DNA的合成。在正常細(xì)胞中P21與Cyclin、CDK、PCNA組成四聯(lián)體使增殖信號(hào)不能有效形成，其中包括E2F激活及DNA聚合酶形成，從而發(fā)生細(xì)胞周期阻滯〔10，12，13〕。

乳腺細(xì)胞損傷的DNA未被修復(fù)，p53則會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡過程即凋亡來阻止受損DNA遺傳給子代細(xì)胞。細(xì)胞凋亡是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞主動(dòng)死亡，其中涉及特殊基因激活及細(xì)胞發(fā)生特征的生化和形態(tài)學(xué)改變?nèi)绲蛲鲂◇w的形成。目前已發(fā)現(xiàn)受p53基因調(diào)控與凋亡相關(guān)的基因有：Bak、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-1、DR5、Bax、Puma、Fas等〔12〕。Bax 是Bcl-2 家族中重要的促凋亡蛋白。Bcl-2基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的原癌基因，腫瘤細(xì)胞凋亡受凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡促進(jìn)基因 Bax 的雙向調(diào)節(jié)，而Bax也屬于Bcl-2家族。p53還可以與凋亡刺激蛋白(ASPP)形成復(fù)合物，ASPP1和ASPP2是同一蛋白質(zhì)家族，他們可以促進(jìn) p53的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)p53與DNA 的結(jié)合，促進(jìn)凋亡基因啟動(dòng)子活化，增強(qiáng)p53的細(xì)胞凋亡功能，使細(xì)胞發(fā)生凋亡〔10，12，13〕。

乳腺癌的生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由血液供應(yīng)，因此腫瘤需要大量的血管生長(zhǎng)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是血管生成的重要促進(jìn)因子，是一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖及血管構(gòu)建〔7〕。可使血管滲透性升高,血液大分子外滲沉積在血管外組織基質(zhì)中，為腫瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)支持，同時(shí)血管通透性增加也促使腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。一旦停止血液供應(yīng)，乳腺腫瘤組織就不能生長(zhǎng)，甚至退化、壞死。wt-p53能抑制腫瘤血管生長(zhǎng)，它通過抑制VEGF的表達(dá)，從而抑制血管的生成、降低血管通透性，最終抑制腫瘤惡化〔11〕。

3　p53基因治療乳腺癌

基因治療的成功取決于分子生物學(xué)發(fā)展水平及重組基因技術(shù)支持。Seki等〔11〕用基因治療的方法成功治愈腺苷脫胺酶(ADA)缺乏的患者。Serrano等〔10〕將bcl-2反義寡聚脫氧核糖核苷酸(ODN)導(dǎo)入耐藥的骨髓瘤細(xì)胞內(nèi),加強(qiáng)化療藥物效果。

逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入是最早開展的基因?qū)敕ǎ捎谒僮鲝?fù)雜、感染效率低，且存在重組入宿主基因組生成致病型重組病毒的危險(xiǎn)，現(xiàn)已很少使用〔12〕。腺病毒導(dǎo)入法操作簡(jiǎn)單、感染效率高，現(xiàn)已得到廣泛運(yùn)用，并獲得較好的治療效果。腺病毒介導(dǎo)的p53感染腫瘤細(xì)胞后能有效地控制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或引起凋亡〔11〕。中國(guó)在2003年首次批準(zhǔn)基因治療藥物——p53重組腺病毒藥物Gendicine的運(yùn)用〔11〕。目前它已經(jīng)用于腫瘤臨床治療乳腺癌、膀胱癌治療。雖然腺病毒治療法療效顯著，但也存在一些問題如毒副反應(yīng)、感染等。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者仍在不斷研究新的基因治療方法。基因封閉是基因治療的新技術(shù)，它是運(yùn)用各種類型的反義分子在基因水平有選擇地去封閉有害基因的表達(dá),從而達(dá)到治療疾病的作用，包括RNA干擾(RNAi)〔13〕、ODN、反義RNA、核酶〔14〕等。te Poele等〔12〕體外合成能與p53特異性結(jié)合的小干擾RNA(siRNA),用其轉(zhuǎn)染乳腺細(xì)胞系MDAH087以治療腫瘤。Mottolese等〔13〕發(fā)現(xiàn)核酶可以令p53下游基因 p21和 Bax的表達(dá)激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。這些案例為基因治療可行性提供有力的說明。研究發(fā)現(xiàn)一些作用于p53-MDM2通路的小分子抑制劑如Nutlin-3a、MI-219，能與p53競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MDM2，從而抑制腫瘤〔15〕。如今p53疫苗研究也進(jìn)入了實(shí)驗(yàn)研究階段，p53作為外來抗原使機(jī)體發(fā)揮體液免疫，產(chǎn)生p53抗體，同時(shí)激活CD4+、CD8+T細(xì)胞，通過細(xì)胞免疫來抗腫瘤〔16，17〕。綜上，p53突變分析及其信號(hào)通路研究為腫瘤治療提供新的思路。目前針對(duì)p53的抗腫瘤藥物已經(jīng)上市、關(guān)于基因治療腫瘤的研究也在不斷深入。

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〔2015-04-09修回〕

(編輯苑云杰/王一涵)

鄔黎青(1963-)，女，博士，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事乳腺癌研究。

詹媛(1990-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事乳腺癌研究。

R737.9

A

1005-9202(2016)17-4391-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.125

1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院2南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院