HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中依那普利和依那普利拉的濃度

張　勇，施振國(guó)

HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中依那普利和依那普利拉的濃度

張勇*，施振國(guó)

[摘要]目的建立人血漿中依那普利和依那普利拉含量測(cè)定的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)方法。方法血漿樣品加入內(nèi)標(biāo)(貝那普利拉)，以含0.1%甲酸的甲醇沉淀蛋白后,進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。色譜柱為Hedera ODS-2 C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.5%甲酸水溶液梯度洗脫，流速為0.4 mL/min，柱溫為30 ℃，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式進(jìn)行定量分析，用于監(jiān)測(cè)的離子質(zhì)荷比分別為m/z 377.2 → m/z 234.3(依那普利)、m/z 349.3 → m/z 206.2(依那普利拉)和m/z 397.4 → m/z 351.4(內(nèi)標(biāo)，貝那普利拉)。結(jié)果人血漿中依那普利和依那普利拉的線性范圍分別為0.2~200 ng/mL(r=0.999 9)、0.5~120 ng/mL(r=0.999 3)；批內(nèi)、批間精密度均<11.3%。結(jié)論該方法快速、靈敏、專屬性強(qiáng)，可用于人血漿中依那普利和依那普利拉濃度的測(cè)定。

[關(guān)鍵詞]依那普利；依那普利拉；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；人血漿

[Abstract]ObjectiveTo establish a method for determination of enalapril and enalaprilat in human plasma by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.MethodsAfter being mixed with the internal standard benazeprilat,plasma samples were deproteinized with methanol (0.1% formic acid) and separated by HPLC-MS/MS on a 30 ℃ Hedera ODS-2 C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)column with a gradient elution by the mobile phase of methanol (A) and 0.1 % formic acid water solution (B) at a flow rate of 0.4 mL/min.Quantification was performed using multiple reaction monitoring (MRM) of the transitions of m/z 377.2 → m/z 234.3 for enalapril,m/z 349.3 → m/z 206.2 for enalaprilat and m/z 397.4 → m/z 351.4 for IS (benazeprilat),respectively.ResultsCalibration curves for enalapril and enalaprilat were linear over the range of 0.2~200 ng/mL (r=0.999 9),0.5 ~ 120 ng/mL(r=0.999 3),respectively.The intra-/inter-batch RSD was less than 11.3%.ConclusionThe established method is rapid， specific and sensitive,it could be used for the quality control for the quantification of enalapril and enalaprilat in human plasma.

收稿日期：2015-04-17

通信作者*

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201512020

Simultaneous determination of enalapril and enalaprilat in human plasma by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometryZHANG Yong*,SHI Zhen-guo(Department of Pharmacy,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China)

Key words：Enalapril;Enalaprilat;HPLC-MS/MS;Human plasma

0內(nèi)容

依那普利是臨床上常用的一線血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)類降壓藥，口服后在人體內(nèi)經(jīng)肝臟代謝為活性代謝產(chǎn)物依那普利拉，通過(guò)抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，降低體內(nèi)血管緊張素Ⅱ的含量，使全身血管舒張而實(shí)現(xiàn)降壓的功效[1-2]。目前用于同時(shí)定量測(cè)定人體內(nèi)依那普利及依那普利拉的方法主要有高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[3-4]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[5-7]，但均存在樣品前處理繁瑣、樣品用量大、靈敏度不高等不足，本研究采用直接蛋白沉淀的樣品前處理方法，建立了一種高效、準(zhǔn)確、靈敏的HPLC-MS/MS方法，進(jìn)行人體內(nèi)依那普利及依那普利拉血藥濃度的定量分析。

1材料

1.1藥物與試劑馬來(lái)酸依那普利對(duì)照品(批號(hào)：100705-201203)、依那普利拉對(duì)照品(批號(hào)：100707-200401)、貝那普利拉對(duì)照品(批號(hào)：100771-201001)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純，德國(guó)Merck公司)；甲酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為去離子水。

1.2儀器Agilent 6410B高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，含：雙高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、電噴霧離子化接口、三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器。色譜工作站：MassHunter Workstation Software。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Hedera ODS-2 C18(150 mm×2.1 mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司)；預(yù)柱：C18保護(hù)柱(4.0 mm × 2.0 mm，5 μm，美國(guó)Phenomenex公司)。流動(dòng)相：甲醇(A)- 0.5%甲酸水溶液(B)梯度洗脫：0~0.5 min，B 為 70%；0.5~0.75 min，B 由70%降為 30%；0.75~4 min，B 為 30%；4~4.25 min，B由30%升為 70%。4.25~7 min，B 為 70%。流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2質(zhì)譜條件離子檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；離子化方式為氣動(dòng)輔助電噴霧離子化(ESI)；傳輸區(qū)電壓：120 V；干燥氣流速：10 L/min；霧化室壓力：40 psig；干燥氣溫度：350 ℃。用于定量分析監(jiān)測(cè)離子對(duì)：依那普利，[M+H]+，m/z377.2 →m/z234.3(碰撞能量：18 eV)；依那普利拉，[M+H]+，m/z349.3 →m/z206.2(碰撞能量：15 eV)；內(nèi)標(biāo)(貝那普利拉)，[M+H]+，m/z397.4 →m/z351.4(碰撞能量：20 eV)。

2.3溶液的制備分別精密稱取鹽酸依那普利對(duì)照品、依那普利拉對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)(貝那普利拉)對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1 mg/mL的各儲(chǔ)備液。所有儲(chǔ)備液置于4 ℃冰箱中保存待用。

2.4血漿樣品的處理精密吸取血漿樣品200 μL，置于1.5 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)(2 μg/mL)對(duì)照品溶液10 μL，旋渦混勻，加入甲醇(含0.1%甲酸)600 μL，旋渦3 min，靜置10 min后于15 600 r/min離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，進(jìn)樣量為5 μL。

2.5方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1專屬性分別取6個(gè)不同來(lái)源的空白血漿200 μL，除不加內(nèi)標(biāo)外，其余按“2.4”項(xiàng)下操作，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，得空白血漿樣品色譜圖；將依那普利、依那普利拉和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品加入空白血漿后，同法操作，得血漿樣品色譜圖；取健康受試者給藥后的血漿樣品，同法操作，得健康受試者血漿樣品色譜圖。典型色譜圖見(jiàn)圖 1。由圖1可見(jiàn)，依那普利、依那普利拉和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約為3.9 min、3.6 min和3.9 min，各成分峰形良好，無(wú)雜峰干擾測(cè)定。本方法具有較高的特異性，能準(zhǔn)確測(cè)定血漿中依那普利的濃度，靈敏度較高。

圖1　人血漿中依那普利、依那普利拉和內(nèi)標(biāo)(貝那普利拉)的色譜圖

2.5.2線性范圍與定量下限取1.5 mL離心管數(shù)支，分別加入不同量的依那普利對(duì)照品溶液后以氮?dú)饬鞔蹈?，加入空白血漿0.2 mL，旋渦混勻，配成含依那普利濃度分別為0.2、1、3、10、30、100、200 ng/mL及依那普利拉0.5、2、5、15、40、80、120 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“2.4”項(xiàng)下操作，記錄色譜圖，分別計(jì)算依那普利以及依那普利拉峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f。以平均比值f(f=As/Ai)對(duì)血藥濃度C作權(quán)重回歸計(jì)算，用加權(quán)最小二乘法(W=1/χ2)進(jìn)行回歸運(yùn)算，得出血漿樣品中依那普利和依那普利拉標(biāo)準(zhǔn)曲線的典型權(quán)重回歸方程，依那普利：f=0.005 732+0.065 80×C(r=0.999 9)，依那普利拉：f=0.014 00+0.005 874×C(r=0.999 3)。依那普利在血漿中的定量下限為0.2 ng/mL，依那普利拉在血漿中的定量下限為0.5 ng/mL。

2.5.3精密度和準(zhǔn)確度制備含依那普利濃度分別為0.5、20、180 ng/mL及依那普利濃度分別為1、10、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣品，每個(gè)濃度配制5份，并配制1條標(biāo)準(zhǔn)曲線，按“2.4”項(xiàng)下操作，共配制3個(gè)分析批，記錄色譜圖，計(jì)算樣品和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值f，代入當(dāng)批的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得實(shí)測(cè)濃度及其準(zhǔn)確度，計(jì)算批內(nèi)和批間精密度。結(jié)果表明，本方法的準(zhǔn)確度與精密度RSD均<15%，符合生物樣品分析要求(表1)。

2.5.4基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率按“2.4”項(xiàng)下操作，分別制備6種不同來(lái)源的空白血漿上清液適量，加入適量依那普利和依那普利拉對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液，配制依那普利濃度分別為0.5、20、180 ng/mL及依那普利濃度分別為1、10、100 ng/mL的含藥血漿樣品，每個(gè)濃度6份，進(jìn)行LC-MS/MS分析，記錄依那普利、依那普利拉和內(nèi)標(biāo)峰面積(A)，并分別計(jì)算依那普利、依那普利拉峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的平均值(B)；以水代替空白血漿，其余操作同上，每個(gè)濃度3份進(jìn)行LC-MS/MS分析，記錄依那普利、依那普利拉和內(nèi)標(biāo)的峰面積，并分別計(jì)算依那普利、依那普利拉峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的平均值(C)；按“2.5.3”項(xiàng)下操作，配制依那普利濃度分別為0.5、20、180 ng/mL，依那普利濃度分別為1、10、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣品，每種濃度配制5份，進(jìn)行LC-MS/MS分析，記錄依那普利、依那普利拉和內(nèi)標(biāo)峰面積(D)。依那普利、依那普利拉和內(nèi)標(biāo)的介質(zhì)效應(yīng)的計(jì)算公式：ME(%)=A/C×100%；依那普利、依那普利拉和內(nèi)標(biāo)的提取回收率的計(jì)算公式：R(%)=D/B×100%。結(jié)果表明，人血漿樣品中依那普利、依那普利拉和內(nèi)標(biāo)的介質(zhì)效應(yīng)均為85%~115%，可認(rèn)為沒(méi)有介質(zhì)效應(yīng)。不同濃度待測(cè)物的提取回收率恒定。見(jiàn)表1。

表1　人血漿中依那普利和依那普利拉的精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果

注：RSD：相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；RE：相對(duì)誤差

2.5.5穩(wěn)定性配制含依那普利濃度分別為0.5、20、180 ng/mL及含依那普利拉濃度分別為1、10、100 ng/mL的含藥血漿適量，每種濃度分取12份，每份0.2 mL。3份于配制好后按“2.4”項(xiàng)下操作，并立即分析，并在測(cè)定完成后，在進(jìn)樣器樣品盤(pán)中放置11.5 h后再次進(jìn)樣分析；3份于室溫放置10 h后按“2.4”項(xiàng)下操作分析；3份于配制好后反復(fù)凍融3次，按“2.4”項(xiàng)下操作分析；3份于配制好后放入-20 ℃冰箱中冷凍保存8周后，取出化凍，按“2.4”項(xiàng)下操作分析。由相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出各樣品的濃度，計(jì)算測(cè)得濃度平均值。結(jié)果表明，依那普利及依那普利拉血漿樣品在室溫下放置10 h、進(jìn)樣器中放置11.5 h、反復(fù)凍融3次及冰凍放置8周條件下的穩(wěn)定性良好。

3討論

本研究采用蛋白沉淀法對(duì)血漿樣品進(jìn)行前處理，分別考察了樣品經(jīng)不同蛋白沉淀劑(甲醇、乙腈)處理后，待測(cè)物的提取回收率，結(jié)果表明，血漿樣品經(jīng)甲醇處理后，提取回收率穩(wěn)定且高于乙腈處理的樣品。

當(dāng)采用質(zhì)譜法對(duì)生物樣品進(jìn)行定量分析時(shí)，如何解決基質(zhì)效應(yīng)，保證樣品測(cè)定的準(zhǔn)確度至關(guān)重要。本研究在選擇甲醇作為樣品前處理的蛋白沉淀劑的基礎(chǔ)上，通過(guò)加入甲酸調(diào)節(jié)血漿樣品的pH值，最大程度地將血漿樣品中的內(nèi)源性雜質(zhì)隨血漿蛋白沉淀除去，同時(shí)采用梯度洗脫的方式避免了基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生，保證了樣品測(cè)定的準(zhǔn)確。通過(guò)優(yōu)化甲酸的濃度(0、0.1%、0.3%、0.5%、1.0%)，最終選擇加入3倍血漿樣品體積的甲醇(含0.1%甲酸)作為樣品的前處理方法。為改善依那普利和依那普利拉的色譜保留，改善色譜峰形，提高待測(cè)物的檢測(cè)靈敏度，本研究選擇0.5%的甲酸水溶液作為水相，從而保證了樣品測(cè)定的高效、靈敏。

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作者單位：1.嘉興市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，浙江 嘉興 314000；2.浙江嘉興學(xué)院，浙江 嘉興 314000