骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在心肌組織工程中的研究與進(jìn)展

孫國棟 郭光偉

（山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001）

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骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在心肌組織工程中的研究與進(jìn)展

孫國棟 郭光偉

（山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001）

【摘要】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞因其具有高度增殖能力，多向分化潛能等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)引起了人們對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究熱潮，尤其是做為組織工程及心血管疾病細(xì)胞移植治療的理想種子細(xì)胞方面。常規(guī)用于房間隔或室間隔缺損修補(bǔ)手術(shù)的補(bǔ)片為滌綸補(bǔ)片，它具有質(zhì)量輕、質(zhì)地薄、生物相容性較好等優(yōu)點(diǎn)，但近幾年發(fā)現(xiàn)，用其修補(bǔ)后，如若發(fā)生術(shù)后殘余漏，較易引起溶血、真菌或細(xì)菌感染。因此利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能在體外構(gòu)建一種含有類心肌樣細(xì)胞具有生物活性的補(bǔ)片是目前亟待解決的問題。但骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞含量極低，需經(jīng)體外分離，純化，擴(kuò)增并吸附于一種生物相容性良好并可被機(jī)體吸收的生物材料上形成復(fù)合物，然后將其復(fù)合物植入機(jī)體組織或器官病損部位，才能達(dá)到修復(fù)缺損心肌和梗死后心肌組織的目的。

【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；組織工程；心肌樣細(xì)胞

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，組織工程的興起，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）在組織工程學(xué)中作為種子細(xì)胞使用也越來越受到人們的關(guān)注。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來自于中胚層，于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中均存在，但含量極少［1］。相比較而言，BMSCs在骨髓中的含量最多，為骨髓中的非造血干胞，對骨髓中的造血干細(xì)胞有機(jī)械支持作用，也可以分泌許多生長因子（如ILIF、L-11、IL-6、M-CSF及SCF等）支持造血。所以獲得生長狀態(tài)良好、較純化和足夠數(shù)量的BMSCs是組織工程研究實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。人們在研究中發(fā)現(xiàn)BMSCs對塑料培養(yǎng)材料的貼壁特性，過去又被稱為塑料貼壁細(xì)胞。它體外培養(yǎng)增殖較為容易，同時(shí)還具有無免疫原性和多向分化的潛能。在一定的體外環(huán)境下可以分化成為心肌樣細(xì)胞，本文就BMSCs誘導(dǎo)成心肌樣細(xì)胞研究進(jìn)展做如下綜述。

1 研究背景

隨著人們生活節(jié)奏的加快，生活方式的改變，心血管系統(tǒng)方面的疾病呈逐年增長的趨勢。但心肌細(xì)胞是不可再生細(xì)胞，現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)手段也只能從營養(yǎng)心肌細(xì)胞，降低心肌氧耗來改善心臟功能。因此尋找一種能替代壞死心肌細(xì)胞的新的種子細(xì)胞成為我們的迫切需求。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）最原始的命名為骨髓基質(zhì)成纖維細(xì)胞，它屬于成體干細(xì)胞，主要來源于中胚層，可在體內(nèi)外分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞，心肌樣細(xì)胞等。1995年，Wakitani等［2］首先證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外經(jīng)5-氮雜胞苷誘導(dǎo)后分化成心肌樣細(xì)胞，分化率約為30%。引起了對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究熱潮。屈佳等［3］體外模擬心肌環(huán)境用心肌細(xì)胞凍融液誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞分化發(fā)現(xiàn)：在心肌細(xì)胞凍融液的環(huán)境中培養(yǎng)的MSCs，細(xì)胞生長旺盛，有大量子代形成。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凍融液可將具有多能分化潛能的MSCs誘導(dǎo)為包括心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的一個(gè)細(xì)胞群體，與5-Aza單一的心肌細(xì)胞誘導(dǎo)作用相比，更能提供一個(gè)適合心肌再生所需的自然條件。Kadner［4］等以成人BMSCs為種子細(xì)胞，進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后進(jìn)行基因修飾借助于生物材料載體將其回植入體內(nèi)，可用于心血管組織工程。Krupnick等［5］將鼠BMSCs種植在三維支架上，并將細(xì)胞－支架復(fù)合物移植在同系基因型鼠的左心室，研究結(jié)果表明，BMSCs種植在三維細(xì)胞支架上有向心肌分化的潛力。

2 BMSCs的分離方法

2.1 全骨髓貼壁法：這是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞最早的分離方法，將抽取的骨髓直接加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，以合適的細(xì)胞濃度進(jìn)行接種培養(yǎng)，它是利用BMSCs對塑料底的貼附性，定期換液去除懸浮生長的造血系細(xì)胞，進(jìn)行分選純化而得。這種方法得到的BMSCs形態(tài)多呈梭形、呈集落生長，而且成分復(fù)雜，均一性差，抗原特異性差異也較大。

2.2 密度梯度離心法：根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分的比重不同，能有效地將紅細(xì)胞、白細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞分離開來，然后將分離出來的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。這類細(xì)胞同源性更強(qiáng)，且有更強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能，同時(shí)操作簡便、快速，對細(xì)胞的活性影響較小。

2.3 流式細(xì)胞儀分離法：不同種類細(xì)胞都有其自身特殊的細(xì)胞標(biāo)志并且其體積大小也不同，將分理出的細(xì)胞與有熒光標(biāo)記的特異性抗體相結(jié)合，制做成特定濃度的細(xì)胞懸液，放入流式細(xì)胞儀機(jī)器中，然后經(jīng)激光照射，發(fā)出的熒光信號將被轉(zhuǎn)化成電信號，再由計(jì)算機(jī)對其進(jìn)行處理，這樣就把陽性表達(dá)的細(xì)胞與陰性表達(dá)的細(xì)胞分離開了。

2.4 免疫磁珠分離法：將BMSCs的表面特異性抗原與連接有磁珠的特異性抗體相結(jié)合，形成帶有磁珠的，抗原-抗體免疫復(fù)合物，在外加磁場磁力作用下帶有磁珠的細(xì)胞將停留在磁場中，未帶磁珠的細(xì)胞則離開了磁場，從而使細(xì)胞分離。

后兩種方法分離的細(xì)胞純度較高，但價(jià)格昂貴，對細(xì)胞的活性影響也較大，甚至導(dǎo)致細(xì)胞完全失去活性，目前較少應(yīng)用。

3 BMSCs體外擴(kuò)增的微環(huán)境

3.1 胎牛血清培養(yǎng)法：胎牛血清是目前干細(xì)胞培養(yǎng)中常規(guī)應(yīng)用的添加劑，但其有感染病毒或細(xì)菌的潛在風(fēng)險(xiǎn)，此外胎牛血清培養(yǎng)后的細(xì)胞含有異體蛋白，并且擴(kuò)增后也難以清除，Spees等［6］證實(shí)應(yīng)用胎牛血清擴(kuò)增獲得的108個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞含7～30 mg胎牛血清蛋白，可引起免疫反應(yīng)。

3.2 自體血清培養(yǎng)法：Mizuno等［7］使用人自體血清代替胎牛血清，實(shí)驗(yàn)也證明自體血清微環(huán)境更適合體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，它能促進(jìn)BMSCs增殖，縮短傳代時(shí)間，維持細(xì)胞的穩(wěn)定，減少細(xì)胞自發(fā)分化等優(yōu)點(diǎn)。

3.3 臍血血清培養(yǎng)法：臍血血清含有多種細(xì)胞因子，可促進(jìn)BMSCs的增殖、分化；并且具有采集方便，來源廣泛，對母親及胎兒無影響，巨細(xì)胞病毒、EB病毒污染率低，無倫理限制等優(yōu)勢。Lam等［8］使用自體臍血血清擴(kuò)增自體臍血干細(xì)胞，曠文勇等［9］使用臍帶血血清替代胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)法，雷曉宇等［10］發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在較低體積分?jǐn)?shù)臍血血清中增殖能力良好。這些實(shí)驗(yàn)也都足以說明臍血血清培養(yǎng)法可做為一種安全有效的培養(yǎng)法應(yīng)用于臨床。

4 BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的研究

4.1 誘導(dǎo)分化的方法及相關(guān)誘導(dǎo)因素

4.1.1 化學(xué)誘導(dǎo)劑：①5-氮胞苷：盡管胞嘧啶類似物5-Aza的誘導(dǎo)作用已獲得肯定，但5-Aza具有細(xì)胞毒性則限制了其應(yīng)用，因此尋找更加安全有效的誘導(dǎo)劑成為當(dāng)前備受關(guān)注的課題之一。②血管緊張素Ⅱ：AngⅡ是一種肽類激素，它可誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化，其誘導(dǎo)作用可能與濃度，細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。它同時(shí)具有調(diào)節(jié)代謝，刺激血管平滑肌增殖，調(diào)節(jié)血管張力的作用。Li等［11］研究證實(shí)，AngⅡ刺激BMSCs增殖的作用是通過與受體結(jié)合，引發(fā)多條信號通路激活使細(xì)胞活化，其中最重要的是其激活有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路并發(fā)生酪氨酸磷酸化而活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（EPK）而產(chǎn)生的。③骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2：BMP-2是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族中的一員，它可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生長、分化和凋亡。王新艷等［12］研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2介導(dǎo)Smad通路的磷酸化及向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位過程，從而在BMSCs向心肌細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮誘導(dǎo)效應(yīng)。④丁酸鈉：董亮等［13］研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉能夠有效誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化，其機(jī)制可能與抑制組蛋白去乙酰化酶活性，增強(qiáng)組蛋白的乙?；?，進(jìn)而激活相關(guān)沉默基因，促使其表達(dá)有關(guān)，因組蛋白乙酰化是誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的機(jī)制之一。

4.1.2 心肌微環(huán)境：①心肌組織裂解液：李琴等［14］用心肌組織裂解液人工模擬心肌生長的微環(huán)境，對BMSCs定向誘導(dǎo)。得到的結(jié)果證明誘導(dǎo)后的細(xì)胞呈明暗交替排列整齊的肌絲樣結(jié)構(gòu)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了具有自律性搏動的多核肌管結(jié)構(gòu)。②心肌細(xì)胞共培養(yǎng)：Pijnappels等［15］將心肌細(xì)胞混合乳鼠BMSCs進(jìn)行共培養(yǎng)誘導(dǎo)，獲得的細(xì)胞有心肌細(xì)胞的功能活性，但大齡鼠BMSCs無法得到具有功能活性的心肌細(xì)胞。因此可以得出在誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的過程中不但外部的誘導(dǎo)環(huán)境非常重要，同時(shí)實(shí)驗(yàn)對象的年齡，細(xì)胞的活力和其自身的形態(tài)都有關(guān)系。

4.2 分化為心肌樣細(xì)胞的鑒定方法

4.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定：①在高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)：如細(xì)胞外形是否向心肌樣衍變，細(xì)胞是否形成肌管，細(xì)胞是否跳動等。②在電子顯微鏡下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)：如定向誘導(dǎo)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否具有心肌樣細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，如呈梭形樣的細(xì)胞，其細(xì)胞核位于細(xì)胞的中央，胞質(zhì)內(nèi)可見糖原顆粒和線粒體結(jié)構(gòu)等。

4.2.2 免疫組化鑒定：①表達(dá)心肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志：a.結(jié)蛋白、α肌動蛋白：作為心肌細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物，結(jié)蛋白與和α肌動蛋白得到了廣泛的認(rèn)可。目前用來檢測心肌細(xì)胞使用次數(shù)最多的特異性指標(biāo)。b.肌鈣蛋白：具有較高特異性的cTnI，作為心肌損傷的檢測和心肌源性細(xì)胞鑒定的特異性生化標(biāo)志物，其陽性表達(dá)說明BMSCs發(fā)生心肌轉(zhuǎn)化白。c.間隙連接蛋白43：Cx43在細(xì)胞間電沖動的傳導(dǎo)，維持細(xì)胞間電活動和收縮、舒張功能的同步性，心肌功能的保持和細(xì)胞間化學(xué)信號的交流，都很重要，是心肌閏盤檢測的常用指標(biāo)。賈敏等［16］在研究BMSCs提取擴(kuò)增及向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)的過程中，cTnT和Cx43表達(dá)陽性，表明誘導(dǎo)分化的細(xì)胞有心肌細(xì)胞的特性。d.肌細(xì)胞增強(qiáng)子2C：肌細(xì)胞增強(qiáng)子2C（MEF2C）作為心臟特異性的因子在心臟發(fā)育的過程中均參與、調(diào)解心臟特異性基因的表達(dá)，MEF2C有顯著的組織特異性。e.超極化激活的核酸環(huán)：超極化激活的環(huán)核苷酸門控的離子通道（HCN）是編碼起搏電流的離子通道，同時(shí)由于HCN和心臟起搏的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)密切相關(guān)，因此又被稱作起搏基因。HCN編碼的起搏電流具有超極化激活，對鈉鉀離子均具有通透性，可被細(xì)胞內(nèi)的cAMP調(diào)節(jié)，具有微弱的單通道電導(dǎo)等獨(dú)特特征［17］。HCN的表達(dá)在竇房結(jié)中依次為HCN4＞HCN2＞HCN1。因此，可以通過檢測HCN4、HCN2和起搏電流判定BMSCs是否分化為心肌細(xì)胞。f.肌球蛋白重鏈：已知哺乳動物的心臟表達(dá)兩種肌球蛋白重鏈（MHC），即α-MHC和β-MHC。β-MHC蛋白水平能夠在一定程度上反映BMSCs向心肌細(xì)胞的分化情況，其基因表達(dá)水平是觀察BMSCs向成熟心肌樣細(xì)胞分化的重要指標(biāo)之一。②β半乳糖酐酶基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)：將β半乳糖酐酶基因通過復(fù)制缺陷重組胰病毒為載體轉(zhuǎn)染至待移植培養(yǎng)的骨髓干細(xì)胞。通過檢測宿主心臟中的β半乳糖酐酶的活性，即可定性和定位移植干細(xì)胞是否分化增殖為心肌細(xì)胞。③Y染色體熒光原位雜交技術(shù)：運(yùn)用該技術(shù)鑒定移植干細(xì)胞的前提是選用雌性動物為受體，同時(shí)移植的骨髓干細(xì)胞來源于雄性動物，如果雌性受體動物心肌檢測到Y(jié)染色體，則可以證明骨髓干細(xì)胞已分化增殖為心肌細(xì)胞。

4.2.3 電生理學(xué)鑒定：目前遇到分化出來的心肌樣細(xì)胞的電生理特性的研究尚不多見，雖然一些對細(xì)胞的動作電位的特點(diǎn)進(jìn)行了描述，但對細(xì)胞膜上的鈉、鉀、鈣、氯等離子通道的特異性研究在國內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道較少。

5 存在的問題及展望

近年來骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞因具有易獲得，易增殖，易被誘導(dǎo)分化，不存在道德倫理問題，移植后無免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。它已被作為種子細(xì)胞廣泛的應(yīng)用于骨，軟骨，心肌等組織工程的研究中，并且已經(jīng)取得了一定的發(fā)展。但在一些領(lǐng)域的研究尚處于探索階段，還有如下一些問題需要解決。

5.1 BMSCs的鑒定問題：雖然BMSCs分化為心肌樣細(xì)胞的心肌特異性鑒定指標(biāo)的研究取得一定成果，但仍有許多問題需要解決。如BMSCs表面的多個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)志物大多缺乏特異性，因此在BMSCs的鑒定方面的仍需進(jìn)一步的研究。

5.2 BMSCs的誘導(dǎo)問題：BMSCs增殖，分化的控制需要合適的條件，如何既能控制增殖，又可以避免腫瘤細(xì)胞形成，同時(shí)又能在合適的條件下取得所需的分化途徑，還有待進(jìn)一步的研究。

5.3 對BMSCs離子通道的研究：從結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)到功能蛋白的表達(dá)之間存在著復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，可能與細(xì)胞分化的方向和程度密切相關(guān)。BMSCs僅表達(dá)外向鉀電流，未表達(dá)內(nèi)向的快鈉電流，說明其尚不足以完成心肌細(xì)胞的興奮與傳導(dǎo)功能。

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中圖分類號：R54

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1671-8194（2016）03-0041-03