褐藻素對HSC-T6細胞生長和凋亡的影響*

戴啟心，　宋　偉，　張潤錦，　王　愷，　鄒書兵

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，南昌 330006)

?

褐藻素對HSC-T6細胞生長和凋亡的影響*

戴啟心，宋偉，張潤錦，王愷△，鄒書兵△

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，南昌 330006)

[摘要]目的： 探討褐藻素對HSC-T6細胞生長和凋亡的影響。方法: 將HSC-T6細胞分為空白對照組、陰性對照組及藥物組，用不同濃度的褐藻素培養(yǎng)HSC-T6細胞。采用CCK-8檢測在24 h、48 h和72 h褐藻素對HSC-T6細胞活力變化的影響，流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡，Western blot法分別檢測Bcl-2和Bax的蛋白表達。結(jié)果: 與空白對照組相比，CCK-8檢測的結(jié)果表明，褐藻素在一定濃度范圍內(nèi)(15～75 μmol/L)內(nèi)能顯著抑制HSC-T6細胞的活力(P<0.01)，呈劑量和時間依賴性。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，24 h后高濃度(60 μmol/L)組對HSC-T6細胞周期影響的效果顯著(P<0.01)，G1期比例顯著下降(P<0.01)，G2期和S期的比例顯著升高(P<0.01)，48 h后低濃度(15 μmol/L)和中濃度(30 μmol/L)組對HSC-T6細胞周期的阻滯作用增強，呈劑量依賴性(P<0.05)；低、中、高濃度組早期凋亡率和總凋亡率都顯著升高，呈劑量依賴性(P<0.05)。蛋白印跡法實驗結(jié)果表明，低、中、高濃度組Bax的蛋白表達顯著上調(diào)，中、高濃度組Bcl-2的蛋白表達顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論: 褐藻素可以通過使細胞周期阻滯于S期和G2期而抑制HSC-T6細胞生長；同時能通過下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax的表達而誘導(dǎo)HSC-T6細胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]褐藻素； HSC-T6細胞； 細胞活力； 細胞周期； 細胞凋亡； Bcl-2； Bax

肝纖維化常繼發(fā)于肝臟慢性炎癥性損傷，而在慢性炎癥階段，肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)持續(xù)激活后分泌大量細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，以至于其合成與分解代謝失衡而過度沉積于肝臟，是肝纖維化發(fā)展中的關(guān)鍵因素[1]。因此，抑制肝星狀細胞的活化與增殖是治療肝纖維化的重要策略[2]。HSC-T6細胞是雄性SD大鼠肝臟分離培養(yǎng)后，具有活化HSC的表型，有快速增殖及穩(wěn)定傳代的能力，常被用作于肝纖維化研究的對象[3]。而褐藻素(fucoxanthin,Fu)是可食用藻類中提取出的一種天然類胡蘿卜素，具有抗炎反應(yīng)及促進多種腫瘤細胞凋亡等作用[4]，本研究采用HSC-T6細胞系，研究褐藻素對HSC-T6細胞的生長和凋亡的影響，并探討其抗纖維化的作用機制。

材料和方法

1材料

大鼠肝星狀細胞系HSC-T6購自湘雅細胞庫；褐藻素購自Sigma；胎牛血清購自Biological Industries；RPMI-1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶(不含EDTA)購自Solarbio；CCK-8試劑盒、胰蛋白酶(含EDTA)和HRP標記山羊抗兔IgG購自北京全式金生物科技有限公司；無水乙醇購自西隴化工股份有限公司；細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自BD；Bcl-2和Bax兔抗鼠多克隆抗體購自Proteintech。

2方法

2.1褐藻素存儲液的配制褐藻素粉末按15 mmol/L溶解于無水乙醇中，-20 ℃避光保存。使用時用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

2.2HSC-T6培養(yǎng)與分組HSC-T6復(fù)蘇后置于含10%胎牛血清及雙抗(1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、飽和空氣濕度和5%CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。細胞呈貼壁生長，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗，設(shè)置空白對照組，陰性對照組，不同濃度(15、30、45、60和75 μmol/L)藥物組。

2.3CCK-8法檢測HSC-T6細胞的活力 收集對數(shù)期HSC-T6細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100 μL細胞懸液，鋪板細胞密度為每孔1×104濃度接種于96孔板。隔夜細胞貼壁，按實驗分組加入不同濃度褐藻素處理24 h、48 h和72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，在孵育箱中繼續(xù)染色2 h后在酶標儀上測定波長450 nm處各孔吸光度(A)值。每組5復(fù)孔，計算各組的平均值。

2.4流式細胞術(shù)檢測細胞周期收集對數(shù)期HSC-T6細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入2 mL細胞懸液，鋪板細胞密度為每孔8×105濃度接種于6孔板中。隔夜細胞貼壁，按實驗分組加入不同濃度褐藻素處理24 h后，用胰酶(不含EDTA)消化并收集細胞，用PBS洗滌1次。于70%乙醇中4 ℃固定2 h后，1 200 r/min離心5 min，棄去乙醇，并用PBS洗滌2次。用RNA酶100 μL混勻，37 ℃水浴30 min，后加入碘化丙啶 (propidium iodide，PI) 400 μL染色懸浮細胞，在避光、4 ℃孵育30 min，在流式細胞儀檢測細胞周期的變化。

2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率收集對數(shù)期HSC-T6細胞，每孔加入2 mL細胞懸液，以每孔8×105接種于6孔板中。設(shè)定不同實驗組，隔夜細胞貼壁，按實驗分組加入不同濃度褐藻素處理24 h后，用胰酶(不含EDTA)消化并收集細胞，用PBS洗滌2次，100 μL 1×binding buffer重懸細胞后，分別加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI并使其混勻，室溫、避光的條件下孵育15 min，再加入400 μL 1×binding buffer后于流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.6Western blot法檢測褐藻素對HSC-T6細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達的影響采用蛋白抽取液分別提取空白對照組和藥物組細胞的總蛋白，全自動生化分析儀(Beckman)測定蛋白濃度。取30 μg細胞總蛋白經(jīng)5×上樣緩沖液和30 g/L SDS配平蛋白至同體積后進行100 g/L SDS-PAGE,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以50 g/L脫脂奶粉常溫封閉150 min，分別用兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗鼠Bax多克隆抗體和兔抗鼠GAPDH單克隆抗體孵育過夜。洗滌后分別加入HRP-標記山羊抗兔II抗，加入底物化學(xué)發(fā)光試劑后X線片曝光，曝光顯影的目的條帶用軟件進行半定量分析，以內(nèi)參照為參考標準計算出目的條帶標準化后的相對值，以此判斷蛋白相對表達量。

3統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1褐藻素對HSC-T6細胞活力的影響

與對照組比較，隨著褐藻素濃度的增加及時間的延長，各濃度藥物組HSC-T6細胞的活力明顯受抑制，且不同褐藻素濃度均以72 h抑制HSC-T6細胞活力的作用最為明顯，這表明褐藻素呈現(xiàn)明顯時間和劑量依賴性地抑制HSC-T6細胞的活力，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。各時段空白對照組與陰性對照組比較，差異均無明顯統(tǒng)計學(xué)顯著性，表明藥物組中最大劑量的乙醇(0.5%乙醇)對HSC-T6細胞活力無影響，見表1。

表1各組培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時T6細胞的增殖情況

Table 1.Comparison of HSC-T6 cell proliferation among different groups at 24 h, 48 h and 72 h by CCK-8 assay (Avalue. Mean±SD.n=3)

**P<0.01vsblank control;#P<0.05,##P<0.01vsFu 15 μmol/L;＊P<0.05,＊＊P<0.01vsFu 30 μmol/L;&&P<0.01vsFu 45 μmol/L;△P<0.05,△△P<0.01vsFu 60 μmol/L.

2褐藻素對HSC-T6細胞周期的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，各藥物組處理24 h后，與對照組相比，15 μmol/L和30 μmol/L藥物組變化趨勢不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，而60 μmol/L藥物組G0/G1期細胞比例明顯下降(P<0.01)，S期和G2/M期細胞比例明顯上升(P<0.01)；15 μmol/L組和30 μmol/L組作用48 h后，與對照組相比，G0/G1期細胞比例明顯下降(P<0.05)，S期和G2/M期細胞比例明顯上升(P<0.05)，且阻滯作用隨藥物濃度的增加而增強, 見圖1、表2、表3。

Figure 1.The representative images of the cell cycle of HSC-T6 cells treated with different concentrations of fucoxanthin for 24 h or 48 h. See Table 2 and Table 3 for the quantitative analysis.

圖1褐藻素作用24 h和48 h各組細胞的周期分布

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsFu 15 μmol/L;＊＊P<0.01vsFu 30 μmol/L.

*P<0.05，**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsFu 15 μmol/L.

3褐藻素對HSC-T6細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，各藥物組處理24 h后，其早期凋亡率和總凋亡率均顯著升高(P<0.05)，凋亡率隨藥物濃度的增加而升高，見圖2。

Figure 2.The effects of fucoxanthin at different concentrations on the apoptosis of HSC-T6 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖2流式細胞術(shù)細胞檢測各組細胞凋亡的變化

4褐藻素對HSC-T6細胞Bcl-2和Bax表達水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，在各組細胞處理24 h后，隨著藥物濃度的增加，與對照組相比，Bax的表達明顯升高，同時，中濃度和高濃度的Bcl-2的表達也明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，而低濃度組的Bcl-2的表達無明顯變化，見圖3。

Figure 3.The effects of fucoxanthin at different concentrations on the protein expression of Bax and Bcl-2 in the HSC-T6 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖3褐藻素對HSC-T6細胞Bax和Bcl-2表達的影響

討論

隨著對肝纖維化發(fā)生機制的不斷了解，研究者發(fā)現(xiàn)各種原因?qū)е碌母渭毎麚p傷會激活靜息狀態(tài)下的肝星狀細胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細胞，再通過不斷地自分泌和旁分泌作用，激活更多的肝星狀細胞，使細胞外基質(zhì)合成增加以至在肝內(nèi)過度沉積是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)[5]。所以，對肝纖維化的早期診斷、早期治療不僅可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化，甚至能有效防止肝硬化的發(fā)生。

目前，已有大量實驗證實從藻類植物中提取的化合物具有一定的護肝作用，但均尚未明確是何種化合物[6-7]。而本實驗中所運用的褐藻素亦稱巖藻黃質(zhì)、巖藻黃素，屬于海產(chǎn)類胡蘿卜素，能從一些藻類植物(如裙帶菜、海帶、馬尾藻等)中提取[8]。雖然褐藻素具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng)，但是，褐藻素的抗纖維化作用尚無明確的研究探討。

本實驗就是將褐藻素作用于雌性SD大鼠活化的肝星狀細胞即HSC-T6細胞，通過CCK-8實驗結(jié)果表明，與空白對照組相比，在一定范圍內(nèi)(15 ～75 μmol/L)，各藥物濃度組均存在顯著性差異，隨著褐藻素藥物濃度的增加，HSC-T6細胞活力明顯受到抑制，呈現(xiàn)時間和劑量依賴性，而陰性對照組(乙醇)對細胞活力的影響與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，提示褐藻素對HSC-T6細胞的生長具有抑制作用，并與乙醇的作用無關(guān)。流式細胞術(shù)檢測細胞周期結(jié)果表明，與空白對照組相比，低濃度(15 μmol/L)和中濃度(30 μmol/L)組周期變化均不明顯，而高濃度(60 μmol/L)組與前3組比較，G0/G1期細胞比例明顯減少，S期和G2/M期細胞比例明顯增高，提示高濃度褐藻素作用HSC-T6細胞周期阻滯于S期和G2/M期。對于低濃度和中濃度細胞周期變化不明顯，考慮可能因作用時間短且藥物濃度較低，致使藥效作用未能完全發(fā)揮所致，所以補充低濃度組和中濃度組作用48 h后，與空白對照組相比，G0/G1期細胞比例明顯減少，S期和G2/M期細胞比例明顯增高，說明隨著作用時間的延長，褐藻素對HSC-T6細胞周期阻滯作用隨藥物濃度的增加而增強。初步驗證褐藻素可能通過調(diào)控細胞周期而抑制HSC-T6細胞的增殖。

Bcl-2蛋白家族是凋亡調(diào)節(jié)中的主要家族之一，其中有20多種參與調(diào)控抑制凋亡和促進凋亡的成員，其中抑制凋亡的主要包括Bcl-2、Bcl-w和Boo等，促進凋亡的主要包括Bax、Bok和Bad等[9-10]。而本實驗流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果表明，各藥物濃度組早期凋亡和總凋亡細胞均較對照組有明顯升高，并對藥物濃度呈劑量依賴性，提示褐藻素誘導(dǎo)T6細胞凋亡。同時下調(diào)Bcl-2蛋白的表達及上調(diào)Bax蛋白的表達，因此可初步推測褐藻素通過下調(diào)Bcl-2表達及上調(diào)Bax表達來誘導(dǎo)T6細胞的凋亡。這與Liu等[11]聯(lián)合褐藻素和順鉑增強抗腫瘤作用的研究中，增加Bax/Bcl-2的比例來驗證其聯(lián)合作用促進腫瘤細胞凋亡，以及侯莉莉等[12]研究褐藻素促進MCF-7細胞凋亡時，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達和上調(diào)Bax蛋白的表達結(jié)果均相類似。

綜上所述，褐藻素通過作用于HSC-T6細胞周期，使其阻滯于S期和G2期，從而抑制HSC-T6細胞的生長；可能通過下調(diào)Bcl-2蛋白的表達同時上調(diào)Bax蛋白的表達誘導(dǎo)HSC-T6細胞的凋亡。提示褐藻素具有一定的抗肝纖維化作用，為進一步探討褐藻素抗肝纖維化作用的機制奠定了一定的分子基礎(chǔ)。

[參考文獻]

[1]吳麗，鄭仕中，潘蘇華，等. 免疫細胞對肝纖維化發(fā)展的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2010, 26(12):1557-1560.

[2]Zois CD, Baltayiannis GH, Karayiannis P, et al. Syste-matic review: hepatic fibrosis - regression with therapy[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2008, 28(10): 1175-1187.

[3]Vogel S, Piantedosi R, Frank J, et al. An immortalized rat liver stellate cell line (HSC-T6): a new cell model for the study of retinoid metabolisminvitro[J]. J Lipid Res, 2000, 41(6):882-893.

[4]張怡評，謝全靈，方華，等. 巖藻黃質(zhì)研究進展[J]. 中國海洋藥物, 2013, 32(4): 83-88.

[5]Nair DG, Weiskirchen R, Al-Musharafi SK. The use of marine-derived bioactive compounds as potential hepatoprotective agents[J]. Acta Pharmacol Sin, 2015, 36(2):158-170.

[6]Rajamani K, Renju VC, Sethupathy S, et al. Ameliorative effect of polyphenols fromPadinaboergeseniiagainst ferric nitrilotriacetate induced renal oxidative damage: with inhibition of oxidative hemolysis andinvitrofree radicals[J]. Environ Toxicol, 2014, 30(8):865-876.

[7]Makhmoor T, Naheed S, Shujaat S, et al. Hepatoprotection by chemical constituents of the marine brown algaSpatoglossumvariabile: a relation to free radical scavenging potential[J]. Pharm Biol, 2013, 51(3):383-390.

[8]Kim SM, Jung YJ, Kwon ON, et al. A potential commercial source of fucoxanthin extracted from the microalgaPhaeodactylumtricornutum[J]. Appl Biochem Biotech-nol, 2012, 166(7):1843-1855.

[9]Ola MS, Nawaz M, Ahsan H. Role of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosis[J]. Mol Cell Biochem, 2011, 351(1-2):41-58.

[10]Adams JM, Cory S. Bcl-2-regulated apoptosis: mechanism and therapeutic potential[J]. Curr Opin Immunol, 2007, 19(5):488-496.

[11]Liu CL, Lim YP, Hu ML. Fucoxanthin enhances cisplatin-induced cytotoxicity via NFκB-mediated pathway and downregulates DNA repair gene expression in human hepatoma HepG2 cells[J]. Mar Drugs, 2013, 11(1): 50-66.

[12]侯莉莉，許秋菊，胡國強，等. 褐藻素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的實驗研究[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2014, 49(2):117-120.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effect of fucoxanthin on growth and apoptosis of HSC-T6 cells

DAI Qi-xin, SONG Wei, ZHANG Run-jin, WANG Kai, ZOU Shu-bing

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail：neswk@163.com;zousb999@163.com)

[KEY WORDS]Fucoxanthin; HSC-T6 cells; Cell viability; Cell cycle; Apoptosis; Bcl-2; Bax

[ABSTRACT]AIM: To explore the effect of fucoxanthin (Fu) on the growth and apoptosis of HSC-T6 cells. METHODS: HSC-T6 cells were divided into blank control group, negative control group and drug groups (treated with different concentrations of Fu). The cell viability was detected by CCK-8 assay at 24 h, 48 h and 72 h after Fu treatment. The cell cycle distribution and apoptotic rate were analyzed by flow cytometry. The protein expression of Bcl-2 and Bax were detected by Western blot. RESULTS: Compared with blank control group, the viability of HSC-T6 cells was inhibited by Fu at concentrations of 15～75 μmol/L in a dose- and time-dependent manner (P<0.01). The cell ratio of G1phase was significantly decreased (P<0.01) and the cell ratio of S phase and G2phase was significantly increased (P<0.01) in 60 μmol/L Fu group after 24 h. The cell ratio of G1phase was significantly decreased (P<0.05) and the cell ratio of S phase and G2phase was significantly increased (P<0.05) in 15 μmol/L and 30 μmol/L Fu groups in a dose-dependent manner after 48 h. The early cell apoptotic rates and total cell apoptotic rates were significantly increased in the Fu treatment groups in a dose-dependent manner (P<0.05). The protein expression of Bax was significantly increased in the Fu treatment groups and the protein expression of Bcl-2 was significantly decreased in 30 μmol/L and 60 μmol/L Fu groups (P<0.05).CONCLUSION: Fu inhibits the growth of HSC-T6 cells possiblely via arresting the cell cycle at S phase and G2phase. The apoptosis of HSC-T6 cells induced by Fu might be via down-regulating the protein expression of Bcl-2 and up-regulating the protein expression of Bax.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1132- 06

[收稿日期]2015- 11- 23[修回日期] 2016- 03- 22

*[基金項目]江西省自然科學(xué)基金資助項目(No.20142BAB205045)

通訊作者△Tel: 0791-6259631; E-mail： neswk@163.com; zousb999@163.com

[中圖分類號]R391.11

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.029